氨基吴茱萸碱聚合物胶束及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于载药胶束，具体涉及氨基吴茱萸碱聚合物胶束及其制备方法与应用。
背景技术
聚合物胶束（polymeric 胶束，PMs）作为一种新型的纳米载体具有结构简单、载药量高、易形成丰富的纳米结构等优势；根据肿瘤组织中乏氧、微酸的环境，构建以pH敏感的酯键、腙键、酰胺键、还原敏感的二硫键等刺激敏感的共价键相连的聚合物胶束，将疏水性药物键合在聚合物载体中，方便药物的递送，减少毒性。CN103284947A涉及吴茱萸碱纳米乳的配方及制备方法，制备得到的吴茱萸碱纳米乳可以提高药物的溶解度，提高生物利用度和药理活性。CN102727454A提供了一种治疗高尿酸血症、痛风的新药-吴茱萸碱分散片，它是由包括如下重量配比的原辅料制备而成的制剂：吴茱萸碱7-13份、固体分散体水溶性载体材料30-50份、填充剂70-90份、崩解剂8-14份；还提供了该分散片的制备方法和用途；提供的吴茱萸碱分散片，崩解时间短、分散均匀性高，能够显著提高难溶性药物吴茱萸碱在固体制剂中的溶出度，有利于吴茱萸碱在体内的吸收，进而提高了药物的生物利用度，为治疗高尿酸血症、痛风的临床用药提供了新的选择。
但是，现有技术公开的纳米胶束都是针对吴茱萸碱（EVO），而且对EVO进行结构修饰，得到不同位点、不同取代基的衍生物，对抗肿瘤活性有明显影响，现有文献研究结构修饰多集中在A环的10位，B环的13位，D环14位、E环的3位以及E环骨架的修饰。
发明内容
本发明首次公开了氨基吴茱萸碱聚合物胶束及其制备方法，提高药物的水溶性和生物利用度，将药物与纳米技术相结合，开发了纳米载药体系用于药物递送，纳米药物可通过EPR效应被动靶向富集在肿瘤组织中。
本发明采用如下技术方案：
氨基吴茱萸碱聚合物胶束，其以氨基吴茱萸碱为核、聚合物为壳。
本发明氨基吴茱萸碱聚合物胶束的制备方法包括以下步骤，将聚合物与氨基吴茱萸碱反应制备氨基吴茱萸碱聚合物偶联物；然后将氨基吴茱萸碱聚合物偶联物自组装，得到氨基吴茱萸碱聚合物胶束。
本发明公开了氨基吴茱萸碱聚合物偶联物，其制备方法包括以下步骤，将聚合物与氨基吴茱萸碱反应制备氨基吴茱萸碱聚合物偶联物。
本发明中，氨基吴茱萸碱具有如下化学结构式：
聚合物为聚乙二醇；
氨基吴茱萸碱聚合物偶联物具有如下化学结构式：
本发明中，R为氢、烷基或者烷氧基。
本发明中，将带有羧基和甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG-COOH2000）分别与氨基吴茱萸碱衍生物2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO在氮气保护下，以DMAP为催化剂、EDC为脱水剂条件下反应生成mPEG-CO-NH-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物。
本发明中，反应为0℃反应2h，再室温反应48h。
本发明中，将氨基吴茱萸碱聚合物偶联物溶于四氢呋喃中，再加入水中，搅拌后静置，得到氨基吴茱萸碱聚合物胶束。
本发明公开了上述氨基吴茱萸碱聚合物胶束或者氨基吴茱萸碱聚合物偶联物在制备纳米药物中的应用，比如纳米抗癌药物。
本发明首次得到两种目标吴茱萸碱衍生物（2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO），核磁共振氢谱、高分辨质谱红外光谱等的表征结果充分证实了化合物的成功合成；体外细胞毒性和凋亡实验表明，与吴茱萸碱相比，化合物2-NH2-EVO对乳腺癌细胞MDA-MB-231有很强的抑制作用，IC50值为0.79uM，同时能够显著诱导细胞凋亡，有望发展成为具有潜力的抗癌药物；进一步制备了两种mPEG-CO-NH-EVO胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束，形貌为均匀的圆球形，粒径为40nm。细胞毒性实验表明聚合物胶束mPEG-CO-NH-EVO 胶束具有抑制细胞增殖能力，mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束对肿瘤细胞和正常细胞均没有毒性，因此可以把其作为无毒两亲性载体，用它来负载其他的疏水性抗癌药物，比如装载阿霉素，起到循环稳定，发挥协同效果的作用。
附图说明
图1为氨基吴茱萸碱聚合物胶束的结构示意图；
图2为聚合物的核磁共振氢谱。(a) mPEG-COOH的核磁共振氢谱, (b) mPEG-CO-NH-
EVO偶联物的核磁共振氢谱, (c) mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物的核磁共振氢谱；
图3为化合物的红外光谱图。(a) 2-NH2-EVO、mPEG-COOH及 mPEG-CO-NH-EVO 的红外光谱图(b)10-OCH3-2-NH2-EVO、mPEG-COOH及 mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 的红外光谱图；
图4为聚合物的形貌与尺寸。 (a) mPEG-CO-NH-EVO 胶束的透射电镜及粒径分布，(b)mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束的透射电镜及粒径分布；
图5为聚合物胶束的CMC结果。(a) DPH紫外吸收的吸光度对mPEG-CO-NH-EVO 胶束浓度的变化, (b) DPH紫外吸收的吸光度对mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束浓度的变化；
图6 (a) 2-NH2-EVO和mPEG-CO-NH-EVO 胶束的紫外吸收光谱，(b) 10-OCH3-2-NH2-EVO和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束的紫外吸收光谱；
图7 为mPEG-CO-NH-EVO 胶束在不同pH缓冲溶液中的释放曲线；
图8为体外细胞毒性评价结果。 (a)不同浓度EVO、2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束与宫颈癌Hela细胞共培养48h后的存活率; (b)不同浓度的2-NH2-EVO和mPEG-CO-NH-EVO 胶束与黑色素瘤细胞共培养24h后的存活率; (c)不同浓度的mPEG-CO-NH-EVO 偶联物及mPEG-CO-NH-EVO 胶束与乳腺癌MDA-MB-231细胞共培养48h后的存活, (d)不同浓度的mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束，mPEG-CO-NH-EVO 偶联物及mPEG-CO-NH-EVO 胶束与正常肝LO2细胞共培养48h后的存活率。
具体实施方式
本发明合成氨基吴茱萸碱衍生物（2-NH2-EVO及10-OCH3-2-NH2-EVO）并设计制备了聚乙二醇修饰的两亲性聚合物胶束，具体的，将带有羧基的亲水性聚乙二醇（mPEG-COOH）分别与氨基吴茱萸碱衍生物通过酰胺键连接，合成了mPEG-CO-NH-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物，该偶联物在水溶液中能自组装形成纳米胶束。用透射电镜对胶束的形貌进行表征，测试了临界胶束浓度，并用CCK-8法进行了细胞毒性的评价。本发明氨基吴茱萸碱聚合物胶束可示意如图1。
实验材料
合成例
参见申请人同日提交的另一篇申请，发明名称为氨基吴茱萸碱衍生物及其制备方法与应用，公开了氨基吴茱萸碱。
首先合成2个带有硝基的化合物2-硝基吴茱萸碱（7a）和10-甲氧基-2-硝基吴茱萸碱（7b）；然后再通过还原反应生成2-氨基吴茱萸碱（8a）和10-甲氧基-2-氨基吴茱萸碱（8b）。合成路线如下所示：
化合物3,4-二氢-β-咔啉（3a）的合成
在250mL单口烧瓶中加入色胺（1a）4g（M=160.22，24.97mmol），甲酸乙酯120mL（既是反应物又是溶剂），澄清浅黄色液体，加热回流，60℃回流18小时。旋蒸，得油状液体。在烧瓶中加入二氯甲烷至溶解，0-5℃冰盐浴条件下，用滴液漏斗滴入（10分钟滴完）10mlPOCl3，冰盐浴条件下反应2h后室温反应3h。旋蒸，得黑褐色油状液体。加入10%乙酸水溶液至全部溶解。用二氯甲烷萃取多次，收集上层（水层）液体。加氨水调节pH至9.5，析出黄色固体，抽滤，得浅黄色固体，用乙酸乙酯萃取滤液并收集上层有机层，将浅黄色固体溶于乙酸乙酯中，合并有机层并旋蒸得黄色固体3,4-二氢-β-咔啉（3a）3.2g。
化合物N-甲基-7-硝基靛红酸酐（6）的合成
在250ml蒸馏烧瓶中，加入2-氨基-4-硝基苯甲酸（4）4.500g（M=182.14，24.7mmol），三光气3.014g（M=296.73，10.16mmol），100ml四氢呋喃。固体全部溶解，颜色变为浅黄色。70℃回流5h，有固体析出，冷却至室温，将反应液倒入300ml冰水中，析出大量沉淀。抽滤，超纯水淋洗3次，二氯甲烷淋洗3次，烘干得淡黄色固体7-硝基靛红酸酐（5）5.01g。在250ml圆底烧瓶中，加入1.015g化合物5（M=208.13，4.88mmol），50mLDMF，溶液为黄色液体，加入氢化钠0.300g（M=24，12.5mmol），为红色液体，活化2h。滴加（10分钟滴完）碘甲烷液体3.142g（M=141.94，22.14mmol），冰水浴下反应4h。将反应液倒入300ml冰水中，析出沉淀。抽滤，用超纯水淋洗三次，烘干得黄色固体N-甲基-7-硝基靛红酸酐（6）0.670g。
2-氨基吴茱萸碱（8a）的合成
在250ml圆底烧瓶中，加入1.11g化合物6（M=222.16，5mmol），0.85g化合物3a（M=170.22，5mmol）和100mL二氯甲烷，溶解，呈澄清黄色液体。45℃加热回流18小时。抽滤，得橙黄色固体2-硝基吴茱萸碱（7a，称为2-NO2-EVO）1.164g。在250mL烧瓶里加入1.164g化合物7a（M=348，3.34mmol），然后依次加入4.00g（M=225.65，17.7mmol）的氯化亚锡二水合物，50mLDMF和10mL浓盐酸。溶液为橙红色，之后变为黄色液体。反应过夜，有沉淀析出。用NaOH调碱性至pH7-9，用乙酸乙酯萃取，旋蒸，蒸干溶剂，残留物用硅胶柱层析（二氯甲烷：乙醇=80:1）得到黄色固体2-氨基吴茱萸碱（8a，称为2-NH2-EVO）100mg。
10-甲氧基-2-氨基吴茱萸碱（8b，称为10-OCH3-2-NH2-EVO）的合成同上述方法，将色胺（1a）替换为色胺（1b），即R1为甲氧基，其余不变。化合物7b称为10-OCH3-2-NO2-EVO。
实施例一氨基吴茱萸碱聚合物偶联物的合成
将带有羧基和甲氧基封端的聚乙二醇（mPEG-COOH2000）分别与氨基吴茱萸碱衍生物2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO反应，在氮气保护下，以DMAP为催化剂、EDC为脱水剂条件下反应生成mPEG-CO-NH-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物。合成路线如下所示：
将122.38mg（0.061mmol）mPEG-COOH2000溶于20mL干燥的DCM中，39.73mg（0.125mmol）2-NH2-EVO溶解在3mLDMF中，再补加17mL干燥的DCM，磁力搅拌均匀。氮气保护，0℃冰浴条件下用注射器缓慢滴入10mL溶有100mg（0.522mmol）EDC和8mg（0.066mmol）DMAP的DCM溶液，0℃反应2h，再室温反应48h。反应完毕后，用饱和碳酸钠溶液洗涤，再用稀盐酸洗涤，用DCM萃取，收集下层有机层，并用无水硫酸镁干燥过夜，过滤，浓缩，用冰乙醚沉淀，得 100mg黄色固体（mPEG-CO-NH-EVO偶联物）。
mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物的合成同上述方法。
聚合物结构表征
（1）核磁共振（1H-NMR）
称取10mg的化合物溶于0.5mL氘代二甲基亚砜(d6-DMSO) ，以四甲基硅烷(TMS)作内标，在25℃温度、400 MHZ频率下进行测试。
（2）红外光谱（FT-IR）
取适量产物粉末置于ATR附件上，进行红外光谱的测试。
实施例二 聚合物胶束的制备
采用溶剂挥发法制备两亲性聚合物胶束，称取mPEG-CO-NH-EVO偶联物10mg，溶于1mL四氢呋喃中，再滴入到搅拌的10mL超纯水中，再继续搅拌30min，然后在通风厨中静置20小时，将溶解的四氢呋喃在室温下挥发掉，从而制备了两亲性聚合物胶束mPEG-CO-NH-EVO 胶束，位于水中，水挥发后，得到纯胶束。
mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束的制备同上述方法。
作为对比，以现有氨基吴茱萸碱衍生物替换本发明2-NH2-EVO，经过同样的方法，得到mPEG-CO-NH-ENH 胶束；现有氨基吴茱萸碱衍生物化学结构式如下：
聚合物胶束的性能表征
（1）胶束形貌表征
聚合物胶束的尺寸和形貌利用透射电镜(TEM)进行表征。取10uL制备的聚合物胶束溶液滴于电镜铜网上，晾干。溶剂挥发后通过透射电镜观察胶束形貌及尺寸并拍摄照片。
（2）动态光散射粒径分析(DLS)
聚合物胶束的粒径(Dn)、粒径分布(PDI)及Zeta电位等均通过动态光散射仪(DLS,Zetasizer Nano)进行检测。测粒径用四通的石英比色池，电位用Zeta电位样品池。
（3）临界胶束浓度（CMC）的测定
临界胶束浓度(CMC)为聚合物形成胶束的临界浓度，胶束的自组装过程由CMC证实。采用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（DPH）探针通过紫外吸收来测定聚合物胶束的CMC值。DPH为疏水区域，当纳米颗粒浓度低时，溶液的紫外吸收低，纳米颗粒浓度到某一浓度开始形成胶束时，DPH分子将会进入到胶束的疏水核内，紫外吸收会突然增大，此突变点所对应的浓度即为CMC值。
取DPH，用DCM溶解，配制成浓度为10-5 M的溶液，分别装在不同的试管中，通风厨下挥发掉溶剂，形成一层薄膜。配制不同浓度梯度1000、500、250、100、50、20、4、1ug/mL的胶束溶液，分别取3mL不同浓度的胶束溶液加入上述试管中，超声震荡均匀，并用紫外分光光度计在310nm处测定溶液的紫外吸收。
聚合物胶束的pH敏感性考察
采用动态透析法考察mPEG-CO-NH-EVO 胶束在不同pH条件下的释放性能。吸取5mL胶束溶液放入透析袋（MW=500），置于装有200mL的pH为5.0、6.5和7.4 释放介质的烧杯中，37℃，200 r/min恒温振荡，分别于不同时间点取出3mL透析液，同时补加3mL的空白释放介质，采用紫外分光光度法测释放介质中2-NH2-EVO的含量。
（1）pH7.4、6.5、5.0PBS缓冲液的配制
首先配制母液，称取14.32gNa2HPO4溶于200mL超纯水中得0.2M的Na2HPO4母液A。称取6.24gNaH2PO4溶于200mL超纯水中得0.2M的NaH2PO4母液B。取40.5mL母液A和9.5mL母液B，超纯水稀释至1000mL，用pH计调节pH至7.4，即得10mM pH7.4的PBS缓冲液。取15.75mL母液A和34.25mL母液B，超纯水稀释至1000mL，用pH计调节pH至6.5，即得10mM pH7.4的PBS缓冲液。取6.5mL母液A和93.5mL母液B，超纯水稀释至1000mL，用pH计调节pH至5.0，即得10mM pH7.4的PBS缓冲液。
（2）标准曲线的制备
精密称取5mg 2-NH2-EVO，置于10ml棕色容量瓶中，甲醇定容，配制成500ug/mL的储备液。将储备液稀释至1，5，20，25，50ug/mL等一系列不同浓度的标准溶液。以甲醇为空白，在285nm处测定溶液的吸光度（A）。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标进行线性回归。
（3）缓释实验
采用透析的方法在pH7.4、6.5、5.0的PBS磷酸缓冲液中进行释放。依据公式计算药物的累积释放率，同时绘制释放曲线。
药物累积释放率的计算公式：
式中：V0为释放介质的体积，Ct为每个时间点释放介质中2-NH2-EVO的浓度；W0为聚合物胶束中药物的总含量。
体外细胞毒性试验
细胞培养
（1）细胞复苏
从-78℃冰箱中取出细胞的冻存管在37℃水浴中，使其快速融化。于800r离心5min后；弃去原液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打，制成重悬液，再倒入含有5mL培养液的培养瓶中，摇匀，放于37℃，5%CO2培养箱中培养。
（2）细胞换液
细胞培养第二天时，弃掉培养液，用PBS洗一遍，加入5mL新鲜的培养基。
（3）细胞传代（一传三）
当培养瓶内细胞的密度达到80~90%时则需将其传代。首先，将培养液弃掉，用2mLPBS冲洗2遍，加入1mL胰酶，放入37℃培养箱2min，显微镜下看到团聚的细胞正在一点点消化分开变圆，加入1mL培养液终止消化，轻轻吹打下贴壁细胞，转移至15mL离心管内，于800r离心5min后；弃去上清液，再加入1mL DMEM培养基混匀，各取300uL细胞悬液于3个培养瓶中，摇匀， 37℃，5%CO2培养箱中培养。传至第四代后方可用于体外细胞实验。
（4）细胞冻存
将一瓶细胞消化离心后，弃去培养液，加入冻存液（90%血清+10%DMSO），每个冻存管里500μL冻存液，放在冻存盒-78低温冻存。
体外细胞毒性
（1）细胞种板
分别取处于对数生长期的乳腺癌、宫颈癌、黑色素瘤、正常肝细胞等，将细胞用胰酶进行消化后离心，弃去上清液，加入新鲜培养基制成细胞悬液，经细胞计数板进行细胞的计数，计数后将细胞接种至96孔的培养皿中。接种数量为：每孔为1×104个细胞，100uL细胞悬液。37℃，5%CO2培养箱中培养。
（2）加药
孵育24h细胞贴壁贴壁，然后进行加药。5组样品，每组均设置不同浓度。同时设置空白对照，将96孔板中的培养基弃去，加入含有不同药物浓度的100uL的培养基，培养48h。
（3）加CCK-8
在孵育48h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，再次放入CO2的恒温培养箱中孵育4h。利用酶标仪（450 nm）测定每孔的OD值，计算出各组样品的存活率。
细胞存活率计算：
取对数生长期的细胞，依次进行96孔板铺板、加药、共同孵育48h后加入CCK-8试剂用酶标仪在450nm处测定吸光度并计算细胞存活率。
（1）mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束对宫颈癌Hela细胞的抑制实验
为了评价两亲性聚合物胶束mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束的活性，采用CCK-8法对EVO、2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束这四种物质与宫颈癌Hela细胞作用48小时的存活率进行测试。
（2）mPEG-CO-NH-EVO 胶束对黑色素瘤细胞的预实验
进行初步预实验，将2-NH2-EVO和mPEG-CO-NH-EVO胶束与黑色素瘤细胞作用24小时，来初步评价mPEG-CO-NH-EVO胶束的作用。
（3）mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束、mPEG-CO-NH-EVO 胶束对乳腺癌MDA-MB-231细胞和正常肝LO2细胞的抑制实验
将mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束、mPEG-CO-NH-EVO偶联物及mPEG-CO-NH-EVO胶束分别与乳腺癌MDA-MB-231细胞和正常肝LO2细胞作用48小时，检测胶束的细胞毒性。
实验结果
偶联物的结构表征
（1）1H NMR核磁氢谱表征
化合物mPEG-COOH、mPEG-CO-NH-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3的核磁共振氢谱见图2。
其中，图2a为mPEG-COOH的氢谱。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz) δ: 12.21(s, 1H),4.11~4.12(m, 2H), 3.51(s), 3.41~3.44(t, 2H), 3.24(s, 3H)。化学位移为12.21ppm的单峰归属于-COOH（a）上的质子，3.51 ppm归属于聚乙二醇的骨架峰（b），3.24 ppm归属于-OCH3（c）的甲基峰。
图2b为mPEG-CO-NH-EVO的氢谱。1H NMR (DMSO-d6, 600 MHz) δ:10.96 (s, 1H),10.19 (s, 1H), 7.66 (d, J=8.5Hz, 1H), 7.51(d , J=1.6Hz, 1H), 7.43(dd, J=18.0,8.0Hz, 2H), 7.34(d, J=8.2Hz, 1H), 7.10~7.07(m, 1H), 7.01~6.99(m, 1H), 6.96-6.93(m, 1H), 6.14(s, 1H), 4.13~4.12(m, 2H), 3.51(s), 3.43~3.41(m, 2H), 3.39~3.37(m, 1H), 3.24(s, 3H), 2.97(s, 3H), 2.91(s, 1H), 2.74~2.71(m, 1H), 2.63(s,1H)。化学位移10.96ppm的单峰归属于2-NH2-EVO吲哚环上-NH-质子（a），10.19ppm归属于-CO-NH-的亚氨基质子（b），3.51ppm归属于聚乙二醇（c）的骨架峰，2.97ppm归属于2-NH2-EVO中-N-CH3（d）甲基的峰，3.24pppm归属于聚乙二醇上-OCH3（e）的甲基峰。与2-NH2-EVO及mPEG-COOH的氢谱相比较，mPEG-CO-NH-EVO的氢谱中，羧基-COOH的质子峰和氨基-NH2的质子峰消失，生成了酰胺键-CO-NH-的质子峰，表明成功合成了mPEG-CO-NH-EVO偶联物。
图2c为mPEG-CO-NH-EVO-OCH3的氢谱。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ：10.66(s，1H), 10.30(s, 1H), 7.60 (d, J=1.9Hz, 1H), 7.52(dd, J=8.5,2.1Hz, 1H), 7.41(d,J=8.4Hz, 1H), 7.23(d, J=8.7Hz, 1H), 7.15(d, J=2.2Hz, 1H), 7.05 (d, J=2.3Hz,1H), 6.72(dd, J=8.7, 2.4Hz, 1H), 4.14~4.12(m, 2H), 3.76(s, 3H), 3.67-3.69(m,2H), 3.51(s), 3.25(s, 3H), 3.05(s, 2H), 2.87~2.83(m, 2H), 3.08~3.15(m, 1H),2.63(s, 3H)。
化学位移10.66ppm的单峰归属于10-OCH3-2-NH2-EVO吲哚环上-NH-质子（a），10.30ppm的单方峰归属于酰胺键中-CO-NH-中亚氨基质子（b），3.51ppm归属于聚乙二醇的骨架（c），3.76ppm归属于10-OCH3-2-NH2-EVO中-OCH3（d）的甲基峰，3.25ppm归属于聚乙二醇上-OCH3（e）的甲基峰，2.63ppm归属于10-OCH3-2-NH2-EVO中-N-CH3（f）的甲基峰。与10-OCH3-2-NH2-EVO及mPEG-COOH的氢谱相比较，mPEG-CO-NH-EVO-OCH3的氢谱中，羧基-COOH的质子峰和氨基-NH2的质子峰消失，生成了酰胺键-CO-NH-的质子峰，成功合成了mPEG-CO-NH-EVO-OCH3偶联物。
（2）红外光谱
图3a为2-NH2-EVO、mPEG-COOH及mPEG-CO-NH-EVO的红外光谱。3260 cm-1和3216 cm-1处的双峰是2-NH2-EVO中-NH2的特征吸收峰，3540 cm-1和1734 cm-1处的峰归属于mPEG-COOH中-COOH的特征吸收峰，1100cm-1是聚乙二醇骨架的振动吸收峰。1693cm-1处的峰是mPEG-CO-NH-EVO中-CO-NH-的吸收峰。图3b为10-OCH3-2-NH2-EVO、mPEG-COOH及 mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 的红外光谱图。3402 cm-1和3340cm-1处的双峰是10-OCH3-2-NH2-EVO中-NH2的特征吸收峰，3540 cm-1和1734 cm-1是mPEG-COOH中-COOH的特征吸收峰，1100cm-1是聚乙二醇骨架的振动吸收峰。1667cm-1是mPEG-CO-NH-EVO-OCH3中-CO-NH-的吸收峰。伯氨基、羧基的的特征吸收峰消失，生成了酰胺键、聚乙二醇骨架的特征吸收峰，进一步证明化合物被成功合成。
聚合物胶束的性能
（1）胶束形貌及粒径分析
采用溶剂挥发法制备mPEG-CO-NH-EVO和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3胶束。图4为聚合物胶束的透射电镜及粒径分布，从图4a mPEG-CO-NH-EVO 胶束的电镜图可以看出胶束呈球形，分布均匀，尺寸大约为40nm。动态光散射仪（DLS）测得平均粒径为195nm。图4b mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束的电镜图可以看出胶束呈球形且外形光滑圆整，分布均匀，尺寸大约为40nm，动态光散射仪测得平均粒径208nm。这主要是由于电镜样品在制备时，纳米胶束会失水塌缩，造成透射电镜下的粒径小于 DLS 得到的粒径。粒径分布及zeta电位见下表：
（2）胶束的 CMC值
通过DPH紫外吸收法测定了聚合物胶束的临界胶束浓度，紫外吸收的吸光度对聚合物胶束浓度的变化突变拐点为CMC值。从图5a中得出mPEG-CO-NH-EVO 胶束的CMC值为200ug/mL。图5b中mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束 的CMC值为201ug/mL。低浓度条件下可以形成稳定的胶束结构。
胶束的体外释药
如图6a所示，2-NH2-EVO在292nm处有最大紫外吸收，mPEG-CO-NH-EVO 胶束在282nm处有最大紫外吸收，图6b表明10-OCH3-2-NH2-EVO在273nm处有紫外最大吸收，mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束在263nm处有最大紫外吸收，形成胶束后，紫外吸收蓝移。
采用透析的方法将mPEG-CO-NH-EVO 胶束在pH7.4、6.5、5.0的PBS缓冲液中进行释放，通过累积释放率绘制出释放曲线如图7。其中，2-NH2-EVO在285nm的紫外吸收与浓度所做的标准曲线为y=0.0632x+0.0225。
从图7中可以看出，在开始5小时内，mPEG-CO-NH-EVO 胶束在pH5.0的PBS缓冲溶液中释放最快，之后在pH7.4的PBS缓冲溶液中释放最快。均比在pH6.5的PBS缓冲溶液中释放快，表明酰胺键在酸性或弱碱性环境中断裂。在酸性环境中50小时的累积释放量达到65%，能够达到缓慢地释放。
细胞毒性试验
采用CCK-8法进行细胞毒性的评价，结果如图8所示。
图8a为EVO、2-NH2-EVO、10-OCH3-2-NH2-EVO及mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束这四种物质与宫颈癌Hela细胞作用48小时的存活率。结果显示EVO和2-NH2-EVO对Hela细胞的抑制作用呈浓度依赖，当浓度为100uM时，细胞存活率小于20%，且IC50分别为3.473和0.79uM。
图8b为2-NH2-EVO与mPEG-CO-NH-EVO 胶束与黑色素瘤细胞作用24小时的存活率，实验表明2-NH2-EVO与mPEG-CO-NH-EVO 胶束对黑色素瘤细胞的抑制作用呈浓度依赖，当浓度为50uM 时，2-NH2-EVO对黑色素瘤细胞具有很好的抑制作用，细胞存活率为20%，IC50为5.195uM。
图8c为mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束及mPEG-CO-NH-EVO 胶束对乳腺癌MDA-MB-231细胞作用48小时的存活率。同样的方法下，mPEG-CO-NH-ENH 胶束浓度为10 μM时，细胞存活率为85%。
图8d为mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束、mPEG-CO-NH-EVO偶联物及mPEG-CO-NH-EVO 胶束这三种物质对正常肝LO2细胞作用48小时的存活率。表明三种物质对对正常肝细胞LO2的毒性都很小。
本发明制备了两种mPEG-CO-NH-EVO 胶束和mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束，形貌为均匀的圆球形，粒径约为40nm。细胞毒性实验表明聚合物胶束mPEG-CO-NH-EVO 胶束具有一定的抑制细胞增殖能力，但是作用力低于游离的2-NH2-EVO；mPEG-CO-NH-EVO-OCH3 胶束对肿瘤细胞和正常细胞均没有毒性，因此可以把其作为无毒两亲性载体，用它来负载其他的疏水性抗癌药物，起到协同效果，比如mPEG-CO-NH-EVO-OCH3胶束装载DOX，浓度为10μg/mL，MAD-MB-231细胞存活率49%，而mPEG-CO-NH-ENH 胶束装载DOX，浓度为10μg/mL，MAD-MB-231细胞存活率68%，可以参见申请人同日提交的另一篇申请，发明名称为载阿霉素聚合物胶束及其制备方法与应用。
