一种无机杂化自修复水凝胶的制备方法及使用方法
技术领域
本发明属于材料制备技术领域，涉及一种无机杂化自修复水凝胶的制备方法及使用方法，及其抗菌和皮肤损伤修复应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是将机体组织与外界环境隔绝从而起到保护作用的屏障。 皮肤损伤是人体最常见的损伤之一，大面积或者全皮层的皮肤损伤会导致皮下组织断裂，皮肤自身无法修复愈合。临床主要干预手段是通过皮肤修复手术和植皮使创面愈 合，然而修复后皮肤附属器如毛囊、汗腺和皮脂腺等无法再生，严重影响患者的生活 质量。此外，修复过程中引发的细菌感染尤其是耐药菌感染，会进一步导致创面愈合 受阻。生物材料的兴起为皮肤损伤修复带来了新的希望，其中水凝胶材料由于具有高 的含水量、良好的生物相容性以及和细胞外基质相似的组织成分和微观结构被广泛的 应用在皮肤修复领域。然而，由于损伤处恶劣的微环境，当前常用水凝胶无法有效应 对过度表达的炎症反应、大量分泌的活性自由基以及血管破坏后缺氧等难题，且缺乏 长期有效的抑菌作用，因此其修复效果总是不尽如人意，成为制约其进一步走向临床 研究的重要阻碍。
解决上述难题最有效的手段是制备一种具有抗菌功能的响应性水凝胶通过对受损 部位微环境的调控，提高皮肤损伤修复效果。二氧化锰纳米片，作为一种新型纳米酶，可以高效分解过氧化氢产生氧气，缓解氧化应激和乏氧，减轻炎症反应，且生物相容 性好，从而受到广泛关注。此外，抗菌肽，一种阳离子聚合物，通过破坏细胞膜通透 性，导致细菌渗透裂解，具有广谱抗菌的效果。目前制备二氧化锰纳米复合水凝胶的 方法主要是将二氧化锰纳米材料通过物理共混的方式整合到现有水凝胶体系中，该方 法存在二氧化锰纳米材料在水凝胶中分散不均匀，复合后水凝胶组织亲和性差的问题。 因此，亟需开发一种可降解的新型二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶改善氧化应激、 乏氧和炎症微环境，同时兼具长期有效的光谱抗菌功能，以及像人的皮肤一样在断裂 后自我修复的功能，提高损伤修复效果，以满足未来的临床应用需求。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种无机杂化自修复水凝胶的制备方法及使用方法，设计合成一种多功能二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶，防止伤口感 染，加速皮肤损伤修复。具体而言，采用机械剥离法制备单层结构的二氧化锰二维纳 米片，表面修饰聚赖氨酸，与端酚醛基修饰的聚醚F127胶束通过席夫碱动态交联制备 二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶。所制备材料结构和性能稳定，生物降解性优良， 且方法过程简易、绿色无污染、易于商品化。将得到的无机杂化自修复水凝胶用于抗 菌和皮肤损伤修复，体外和体内实验均取得明显的治疗效果。
技术方案
一种无机杂化自修复水凝胶的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1：将四甲基氢氧化铵溶于过氧化氢水溶液中，搅拌后加入二价锰盐溶液中，得到的黑色沉淀；黑色沉淀离心分离，采用去离子水洗涤干燥后，超声机械剥离的方 法，得到单层结构的二氧化锰二维纳米片；将聚赖氨酸与二氧化锰纳米片混合，得到 聚赖氨酸修饰的二氧化锰复合纳米片；所述聚赖氨酸与二氧化锰纳米片的质量比为1 ︰1～10︰1；
步骤2：将酚醛基修饰到聚醚F127两端，在水中自组装得到F127醛胶束；将聚 赖氨酸修饰的二氧化锰复合纳米片与两端酚醛基修饰的聚醚F127醛在4℃下以质量 分数比为30～50︰1共混，并在37℃下成胶，得到杂化自修复水凝胶。
所述过氧化氢水溶液的浓度为3％。
所述二价锰盐包括但不限于：无水二氯化锰MnCl2、无水硫酸锰MnSO4或无水硝 酸锰Mn(NO3)2。
所述的聚赖氨酸由聚乙烯亚胺代替。
所述F127醛胶束浓度为20％～40％。
一种制备的所述无机杂化自修复水凝胶的使用方法，其特征在于组份为：用于皮肤损伤修复和抗细菌感染。
有益效果
本发明提出的一种无机杂化自修复水凝胶的制备方法及使用方法，用机械剥离法制备单层结构的二氧化锰二维纳米片，表面修饰聚赖氨酸，与端酚醛基修饰的聚醚 F127醛胶束通过席夫碱动态交联制备二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶。由于纳米片 独特的二维纳米结构，使其不但在水凝胶中均匀分布，并显著提高水凝胶的成胶速度 和机械性能。由于氢键作用和基于席夫碱的动态交联，使得该水凝胶具有良好的组织 粘附性，同时，利用聚赖氨酸表面正电性质和二氧化锰纳米片锋利边缘的“纳米刀片” 效应，具有持续广谱抗菌性能。针对皮肤受损部位高浓度的过氧化氢的特点，杂化水 凝胶催化其分解产生氧气，降低氧化应激的同时缓解乏氧状况，协同促进皮肤再生。 此外，其高效清除活性自由基的性能，有望在其他组织工程学领域得到广泛应用。本 发明公开的制备方法，简便易行、生物相容性好，有望在临床中应用。
本发明相对于现有技术，具有如下明显优势：
(1)本发明提供一种简便易行、绿色无污染、便于商品化的方法制备一种具有粘附性的可注射具有持续抗菌功能的二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶。
(2)本发明制备的杂化水凝胶具有微环境(高浓度过氧化氢)响应性，快速催化 分解过氧化氢释放氧气，克服氧化应激，提高氧气含量，协同增强皮肤损伤修复效果。
附图说明
图1：二氧化锰的扫描(a)、zeta电位(b)和(c)聚醚F127醛的1H核磁谱图
图2：无机杂化自修复水凝胶扫描电镜照片
图3：无机杂化自修复水凝胶分解过氧化氢和释放氧气曲线
图4：体外抗菌性能表征
图5：无机杂化自修复水凝胶促进皮肤修复动物实验
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
无机杂化自修复水凝胶的制备方法
步骤1：将四甲基氢氧化铵溶于3％过氧化氢水溶液中，并快速倒入二价锰盐溶 液中，持续搅拌。
步骤2：将得到的黑色沉淀离心分离，以去离子水洗涤干燥后，采用超声机械剥 离的方法，得到单层结构的二氧化锰二维纳米片。
步骤3：将聚赖氨酸与二氧化锰纳米片混合，得到聚赖氨酸修饰的二氧化锰复合纳米片。
步骤4：将酚醛基修饰到聚醚F127两端，在水中自组装得到F127醛胶束。
步骤5：将聚赖氨酸修饰的二氧化锰复合纳米片与两端酚醛基修饰的F127在4℃下共混，并在37℃成胶，得到杂化自修复水凝胶。
所述二价锰盐为无水二氯化锰(MnCl2)、无水硫酸锰(MnSO4)、无水硝酸锰 (Mn(NO3)2)中的任意一种。
所述四甲基氢氧化铵与二价锰盐的投料摩尔比为2：1。
所述搅拌反应时间为12小时。
所述离心分离的固体产物在机械剥离前要多次用去离子水洗涤。
所述的F127醛胶束浓度为20％～40％(质量百分比)。
所述的聚赖氨酸修饰的二氧化锰复合纳米片浓度为0.05％～1％(质量百分比)。
所述添加的过氧化氢溶液浓度为100μM。
将杂化自修复水凝胶浸于PBS缓冲溶液中，添加一定量的过氧化氢溶液，检测溶液中过氧化氢及溶解氧含量变化。
将杂化自修复水凝胶分别与革兰阳式细菌(金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和革兰阴式细菌(大肠杆菌)共培养，检测杂化自修复水凝胶的抗菌性能。
将杂化自修复水凝胶应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的小鼠皮肤损伤动物 模型中，考察其对体内抗菌和促进损伤修复的功能。
所述疾病模型不限于皮肤损伤，可以拓展至多种炎症以及细菌感染相关疾病，如糖尿病溃疡、脊椎损伤修复、关节炎、中风等。
具体实施例：
实施例1：聚赖氨酸修饰的二氧化锰二维纳米片的制备
将0.378g二氯化锰溶于10ml去离子水溶液中，称取2.2g四甲基氢氧化铵溶于 3％的过氧化氢溶液中，将其快速加至上述二氯化锰溶液中，600转/分钟持续搅拌， 反应12小时后得到黑色二氧化锰沉淀，用去离子水除去未反应的二氯化锰和四甲基氢 氧化铵后，超声剥离30min得到单层结构的二氧化锰二维纳米片，将所得最终产物冷 冻干燥。取上述二氧化锰纳米片分散到去离子水中，配制10mg/ml的溶液，并与20 mg/ml的聚赖氨酸溶液混合，充分搅拌12小时后，离心后用去离子水清洗三次，所得 产物冷冻干燥。
实施案例2：两端酚醛基修饰的聚醚F127醛的制备
将12.6g的平均分子量12.6kDa的聚醚F127在80℃下干燥12小时，加入120 毫升二氯甲烷，并置于冰浴中，快速加入0.875毫升的三乙胺。在氮气氛围保护下，0.32 毫升的甲磺酰氯溶于20毫升二氯甲烷中，并缓慢加入到上述混合液中，室温下反应24小时。反应结束后，加入150毫升去离子水，并用100毫升二氯甲烷萃取3次。分 别用100毫升1M的盐酸溶液和饱和盐水清洗2次有机相，然后加入无水硫酸钠除去 多余水分。向浓缩后的混合液中加入乙醚沉淀产物，纯化三次后将产物真空干燥。将 所得的中间产物与0.74g的对羟基苯甲醛和1.5g的碳酸钾加入到100毫升二甲基甲酰 胺中。在氮气氛围保护下80℃反应72小时。反应结束冷却后，加入150毫升去离子 水，并用100毫升二氯甲烷萃取产物，将得到的有机相产物中加入无水硫酸钠除去多 余水分，旋蒸浓缩后加入乙醚沉淀纯化产物，将沉淀过滤后室温真空干燥后得到两端 酚醛基修饰的聚醚F127醛。
实施案例3：二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-1
将500mg聚醚F127醛在4℃下溶于1.6ml去离子水中，另称取1mg聚赖氨酸 修饰的二氧化锰二维纳米片超声分散于0.4ml去离子水中，并将其快速加至聚醚F127 醛溶液中，用混匀仪快速混匀，最终得到二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-1。
实施案例4：二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-2
将500mg聚醚F127醛在4℃下溶于1.6ml去离子水中，另称取2mg聚赖氨酸 修饰的二氧化锰二维纳米片超声分散于0.4ml去离子水中，并将其快速加至聚醚F127 醛溶液中，用混匀仪快速混匀，最终得到二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-2。
实施案例5：二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-3
将500mg聚醚F127醛在4℃下溶于1.6ml去离子水中，另称取3mg聚赖氨酸 修饰的二氧化锰二维纳米片超声分散于0.4ml去离子水中，并将其快速加至聚醚F127 醛溶液中，用混匀仪快速混匀，最终得到二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-3。
实施案例6：二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-4
将500mg聚醚F127醛在4℃下溶于1.6ml去离子水中，另称取4mg聚赖氨酸 修饰的二氧化锰二维纳米片超声分散于0.4ml去离子水中，并将其快速加至聚醚F127 醛溶液中，用混匀仪快速混匀，最终得到二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶FEM-4。
实施案例7：二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶催化产氧性能研究
将硫酸钛溶液稀释到去离子水中，得到24％的硫酸钛溶液，将8.33ml的浓硫酸 稀释到50ml的去离子水中，并向其中加入1.33ml 24％的硫酸钛溶液，配制得到的过 氧化氢检测液，将制备得到的二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶(FEM-1,FEM-2, FEM-3,FEM-4)浸在1mM的过氧化氢PBS缓冲液中，不同时间点取50μl上清液与 100μl的检测液混合30min后，采用酶标仪测量405nm处吸光度值，计算杂化水凝 胶清除过氧化氢能力，同时在相应时间点，用溶解氧测试仪检测溶液中氧含量变化。
实施案例7：二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶体外抗菌性能研究
分别将二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶(FEM-1,FEM-2,FEM-3,FEM-4)、二氧 化锰纳米片、聚赖氨酸修饰的二氧化锰纳米片、两端酚醛基修饰的聚醚F127醛、990 微升PBS、990微升抗生素羟氨苄青霉素(200μg/ml)置于在24孔培养板中，分别 取10微升106CFU/ml的革兰阳式细菌(金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌)和革兰阴式细菌(大肠杆菌)滴于上述孔板中，37℃培养2小时后，加入适量 PBS至1ml。取10μl上述菌液加入到LB培养基中，37℃培养18小时，通过计算菌 落数证明二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶体外抗菌性能。
实施案例7：二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶体内抗菌和加速损伤修复的功能研究
将6周大健康的昆明小鼠麻醉后，背部退毛，制造直径8毫米的全层皮肤损伤创口，并向其中滴加10微升108CFU/ml耐甲氧西林金黄色葡萄球菌液，建立耐药菌感 染小鼠皮肤损伤模型。分别随机分为4组，每组15只小鼠。将二氧化锰纳米片杂化自 修复水凝胶涂覆与创口表面，并设置3组对照：1)10微升PBS；2)10微升抗生素羟 氨苄青霉素(20mg/ml)；3)两端酚醛基修饰的聚醚F127醛水凝胶。分别在第3，7，14天将每组5只小鼠处死后，用游标卡尺量取创口直径，对比证明二氧化锰纳米片杂 化自修复水凝胶加速皮肤损伤修复。将创口剪下切碎后置于含有1毫升PBS的摇菌管 中，37℃ 200转每分钟摇4小时，并将上菌液稀释100倍后，取10微升加入到LB培 养基中，37℃培养18小时，通过计算菌落数证明二氧化锰纳米片杂化自修复水凝胶 体内抗菌性能。
