具有高效基因递送能力的还原响应性超支化聚β-氨基酯及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因负载和递送领域，具体涉及具有高效基因递送能力的还原响应性超支化聚β-氨基酯及其制备方法与应用，并用于siRNA的转染。
背景技术
基因载体是用于负载核酸分子，将其递送入靶细胞并成功表达的重要工具。基因载体材料可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体具有转染效率高的优点，但其本身的免疫原性高、致癌风险高以及基因装载量低等缺点严重制约了其在医药领域的应用和发展。基于此，非病毒基因载体逐渐得到重视和发展。常用的非病毒基因载体主要有脂质体、阳离子聚合物和多糖等。现有基因载体受到其结构的限制，往往需要较高的质量比才能有效地缩合核酸分子，这也带来较高的细胞毒性。基于此，发展刺激响应型可降解的阳离子聚合物，可以在实现稳定包载核酸药物的同时，解决上述矛盾。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有还原响应性的超支化聚β-氨基酯，该聚合物可以用作核酸药物的载体，且具有良好的生物相容性、还原敏感性以及高基因转染能力；并提供上述超支化还原响应的聚β-氨基酯结合核酸分子的制备方法和在核酸药物递送系统中的应用。
本发明提供一种具有还原响应性的超支化聚β-氨基酯，通过迈克尔加成方法聚合后，使用小分子胺作为封端剂进行封端；本发明的阳离子聚β-氨基酯具有超支化结构，主链上具有还原敏感的基团。
本发明采用如下技术方案：
一种还原响应性的超支化聚β-氨基酯，具有式（I）所示的结构；
所述式（I）所示的结构中，8～15，y为7～14，z为6～10；优选的，x为9～11，y为8～10，z为7～9。
本发明公开了上述还原响应性的超支化聚β-氨基酯的制备方法，以2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯、氨基醇、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和胺基化合物为原料，反应制备还原响应性超支化聚β-氨基酯。
本发明公开了一种纳米药物的制备方法,为以下步骤：以2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯、氨基醇、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和胺基化合物为原料，反应制备还原响应性超支化聚β-氨基酯；将所述还原响应性超支化聚β-氨基酯复合药物得到纳米药物。
氨基醇具有如下化学结构式：
本发明中，R1为带有羟基的小分子基团，可以如下：
胺基化合物具有如下化学结构式：
本发明中，R2为带有胺基的小分子基团，R2结构可如下：
以具有式（ⅠI）结构的聚β-氨基酯为例，本发明提供了具有式（ⅠI）结构的聚合物聚β-氨基酯的制备方法，包括以下步骤：以2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和1-（3-氨基丙基）-4-甲基哌嗪为原料，反应制备具有还原（GSH）响应性的超支化聚β-氨基酯。
本发明公开了一种纳米药物的制备方法，包括以下步骤：以2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和1-（3-氨基丙基）-4-甲基哌嗪为原料，反应制备还原响应性超支化聚β-氨基酯；所述还原响应性超支化聚β-氨基酯复合核酸分子得到纳米药物；具体方法是，将还原响应性超支化聚β-氨基酯溶解于醋酸缓冲溶液中，再加入核酸溶液，然后于37 ℃孵育，得到纳米药物。
本发明中，2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯、氨基醇、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯加热反应后再加入胺基化合物，然后室温反应，制备还原响应性超支化聚β-氨基酯；2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、氨基醇、胺基化合物的摩尔比为0.83﹕0.25﹕1﹕1；加热反应为50℃反应14~18 h；室温反应的时间为10～15小时。比如2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯于50℃反应后再加入1-（3-氨基丙基）-4-甲基哌嗪，然后室温反应，制备还原响应性超支化聚β-氨基酯；优选的，2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、4-氨基-1-丁醇、1-（3-氨基丙基）-4-甲基哌嗪的摩尔比为0.83﹕0.25﹕1﹕1；50℃反应的时间为16 h；室温反应的时间为12 h。
本发明中，以双（2-羟乙基）二硫化物和丙烯酰氯为原料，三乙胺为催化剂，制备2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯。
具体的，本发明具有式（Ⅰ）结构的聚合物聚β-氨基酯的制备方法如下：
（1）以双（2-羟乙基）二硫化物和丙烯酰氯为原料，三乙胺为催化剂，反应制备2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯；
（2）以2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、氨基醇、胺基化合物为原料反应制备还原响应性超支化聚β-氨基酯。
上述具体反应可表示如下：
上述技术方案中：
步骤（1）中，所述反应的溶剂为无水四氢呋喃（THF）溶液，在室温条件下反应24 h；所得产物用Na2CO3 溶液和蒸馏水分别洗涤，无水硫酸镁干燥，通过旋蒸除去溶剂；粗产物通过硅胶柱色谱法（展开剂：正己烷/乙酸乙酯 = 16/1）纯化；所述2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯的化学结构式为：
本发明提供的还原响应性超支化聚β-氨基酯可以与核酸分子自组装形成纳米药物，因此本发明公开了一种纳米药物，由上述还原响应性超支化聚β-氨基酯复合药物得到。
本发明中，药物为核酸分子。
本发明中，所述核酸药物为siRNA，可以特异性降解靶基因，抑制靶基因的表达。
本发明中，还原响应性超支化聚β-氨基酯与核酸分子的质量比为（10~100）：1，优选的质量比为（20~50）：1，更优选的质量比为（30~40）：1。
本发明中，所述纳米药物的粒径为120~600 nm，优选的粒径为120~200 nm，更优选的粒径为120~150 nm。
本发明公开了上述还原响应性超支化聚β-氨基酯在制备药物载体中的应用或者在制备纳米药物中的应用；或者上述纳米药物在制备基因药物中的应用。药物载体优选为基因药物载体，纳米药物为基因药物。
本发明的主要优势在于：
（1）本发明在聚β-氨基酯中引入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，使得聚合物具有超支化结构，该结构具有以下优点：①具有超支化结构的聚β-氨基酯具有更高密度的正电荷，可明显增强聚合物与核酸分子之间的静电相互作用，在较低的聚合物/核酸分子质量比下有效缩合基因药物；
（2）本发明中的还原响应性超支化聚β-氨基酯在受损细胞内的GSH条件下可以使得聚合物主链断裂，实现聚合物的快速降解，从而在显著提高转染效率的同时降低了材料的细胞毒性。
（3）本发明中的还原响应性超支化聚β-氨基酯正电荷密度高，促进了材料与细胞膜之间的相互作用，进而大幅提高了细胞对材料的内吞效率。
附图说明
附图用来对本发明进行进一步说明，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例一（2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯，SSDA）的1H NMR谱；
图2为实施例二（BPAE-SS）的1H NMR谱；
图3为对比例一（BPAE-CC）的1H NMR谱；
图4为实施例二、对比例一和对比例二的GPC结果；
图5为实施例二和对比例二的凝胶电泳图；
图6为实施例二包载siRNA后的粒径和电势图；
图7为GSH处理后，聚合物在不同质量比下包载siRNA的凝胶电泳图；
图8为实施例二、对比例一在GSH处理前后包裹siRNA后的粒径图；
图9为实施例二、对比例一与siRNA复合后，经肝素钠处理的siRNA释放图；
图10为实施例二、对比例一、对比例二和PEI包裹siRNA后，复合物的细胞摄取效率；
图11为复合物在RCMECs中的内涵体逃逸与siRNA的胞内释放图；
图12为实施例二、对比例一、对比例二和PEI在不同聚合物/siRNA质量比条件下的细胞毒性；
图13为复合物处理后细胞中的ICAM-1的基因表达水平；
图14为复合物给药后大鼠受损心肌组织处的ICAM-1基因表达水平；
图15为复合物给药后大鼠受损心肌组织处的ICAM-1以及炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）蛋白的表达水平；
图16为复合物给药后大鼠心脏的TTC染色图；
图17为复合物给药后大鼠心脏超声检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
本发明的聚β-氨基酯是一类高效且低毒的阳离子基因递送载体，其主链上含有可水解的二硫键，带有正电荷的叔胺可以与带负电的核酸分子通过静电吸附形成纳米复合物，同时主要利用聚合物表面过量的正电荷与细胞膜结合，促进细胞内吞，因此可以用于核酸分子的胞内递送；研究发现，相比于线性结构，本发明聚合物结构可显著增强聚合物与核酸分子的相互作用，提高基因缩合能力，同时可通过增强与细胞膜的相互作用促进细胞摄取。因此具有超支化结构的聚β-氨基酯可以更加有效地结合核酸分子，实现基因的高效转染，同时具有刺激响应性的聚合物可以实现核酸分子的快速、可控释放。
本发明实施例中，涉及的具体操作以及测试为本领域常规方法，所有原料都是市购产品，其中ICAM-1 siRNA购自吉玛基因，SD雄性大鼠购自上海斯莱克动物实验有限公司。
实施例一
制备还原响应性的超支化聚β-氨基酯的方法，具体如下：
将双（2-羟乙基）二硫化物（7.7 g，50 mmol）和三乙胺（18.75 mL，150 mmol）溶于200mL无水四氢呋喃（THF）中。在氮气保护下于2 h内逐滴滴入丙烯酰氯（12.2 mL，150 mmol）的无水THF溶液（50 mL），室温反应24小时。Na2CO3溶液（0.2 M，5 × 100 mL）和蒸馏水（3 ×100 mL）分别洗涤，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，粗产物通过硅胶柱色谱法（展开剂：正己烷/乙酸乙酯 = 16/1，v/v）纯化，得淡黄色油状物2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯（SSDA）（8.1 g，31 mmol，产率62%）。氘代氯仿打核磁，附图1为其核磁谱图。
实施例二
将2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯（217 mg，0.83 mmol）、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA，74 mg，0.25 mmol）和4-氨基-1-丁醇（89 mg，1 mmol），无溶剂条件下，50℃反应16小时。加入1-（3-氨基丙基）-4-甲基哌嗪（MPZ，157 mg，1 mmol）的二氯甲烷溶液（1 mL），室温反应12h。然后用乙醚沉降三次，真空条件下除去溶剂，得到黄色粘稠油状物，即BPAE-SS，收率90%。氘代氯仿打核磁，附图2为其核磁谱图。BPAE-SS化学结构式（x为9～11，y为8～10，z为7～9）如下：
将上述50℃反应16小时更换为60℃反应8小时，其余不变，得到BPAE-SS，收率75%。
对比例一
1，6-己二醇二丙烯酸酯（188 mg，0.83 mmol）、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（74 mg，0.25mmol）和4-氨基-1-丁醇（89 mg，1 mmol）在50 oC反应16 h后，加入1-（3-氨基丙基）-4-甲基哌嗪（157 mg，1 mmol）的二氯甲烷溶液（1 mL），室温反应过夜，得到不敏感超支化聚β-氨基酯（BPAE-CC）作为阳性对照。氘代氯仿打核磁，附图3为其核磁谱图。其化学结构式如下：
对比例二
2，2-二硫二乙醇二丙烯酸酯（314 mg，1.2 mmol）和4-氨基-1-丁醇（89 mg，1 mmol）在50 oC反应24 h后，加入1-（3-氨基丙基）-4-甲基哌嗪（157 mg，1 mmol）的二氯甲烷溶液（1mL），室温反应过夜，得到线性聚合物（LPAE）作为阳性对照。其化学结构式如下：
图4为实施例二、对比例一和对比例二的GPC结果；数据分析表明实施例二、对比例一和对比例二的分子量无显著差异。
实施例三包载siRNA的纳米药物的制备、表征及其应用
分别配制实施例二的聚β-氨基酯（BPAE-SS）浓度为1 mg/mL的醋酸缓冲溶液（pH =5.2）和ICAM-1 siRNA（siICAM-1）浓度为0.1 mg/mL 的DEPC水溶液；然后将聚β-氨基酯和siRNA按不同重量比（10/1，20/10，30/1，40/1，50/1，80/1和100/1）混合，将混合物涡旋10秒，然后在37 ℃下孵育30 min，形成聚β-氨基酯/siRNA复合物（BPAE-SS/siRNA）。随后加入2%琼脂糖凝胶电泳上样孔内，90 V 下运行20 min，凝胶成像系统成像，测定siRNA的包载效率。
通过动态光散射（DLS）测定聚β-氨基酯/siRNA在不同重量比的条件下，复合物的粒径和电位。
将聚β-氨基酯用谷胱甘肽（GSH，5 mM，1 h，RT）预处理，随后将聚β-氨基酯和siRNA按不同重量比（10/1，20/10，30/1，40/1，50/1，80/1和100/1）混合，将混合物涡旋10秒，然后在37 ℃条件下孵育30 min，形成聚β-氨基酯/siRNA复合物。通过琼脂糖凝胶电泳测定siRNA的包裹效率，通过DLS研究复合物的粒径变化。
向制备好的复合物（BPAE/siRNA = 30）中加入不同浓度的肝素钠，37 oC孵育1 h，琼脂糖凝胶电泳实验研究GSH处理前后复合物的siRNA释放。
将大鼠心脏微血管内皮细胞（RCMECs）以1.5 × 105个/孔的密度接种于12孔板，培养24小时。将培养基换成无血清DMEM（1 mL/孔），加入复合物（聚合物/FAM-siRNA = 30，1μg siRNA/孔），以无任何处理的细胞作为空白对照。37 oC孵育4小时，弃培养基，含肝素钠的PBS（20 U/mL）润洗三次，消化并收集细胞，流式细胞仪检测FAM-siRNA（市售产品，购自吉玛基因）的细胞摄取情况。
共聚焦激光扫描显微镜观察复合物的内涵体逃逸与siRNA的胞内释放。将RCMECs细胞以4 × 104 cells/皿的密度接种于玻璃底细胞培养皿（Ф = 20 mm），培养24小时。将培养基换成无血清DMEM，加入BPAE-SS/FAM-siRNA复合物（1 μg FAM-siRNA/皿），37 oC孵育4小时，含肝素钠的PBS（20 U/mL）润洗三次，Hoechst 33258（5 μg/mL，30 min）和Lysotracker Red（200 nM，1 h）分别染色，并通过荧光共聚焦显微镜观察细胞。
将RCMECs细胞以1.5 × 104个细胞/孔的密度接种于96孔板，培养24小时，将培养基换成无血清DMEM并加入复合物（0.1 μg siRNA/孔），37 oC孵育4 h。将培养基换成含10%FBS的DMEM，继续培养20 h，通过MTT实验检测细胞存活率。
将RCMECs细胞以2 × 105个细胞/孔的密度接种于6孔板，培养24小时。将培养基换成无血清DMEM，加入复合物（2 μg siRNA/孔），37 oC孵育4 h。将培养基换成含10% FBS的DMEM，继续培养20 h，加入LPS（300 ng/mL）刺激6 h，Trizol试剂提取总RNA，并通过实时PCR系统分析目的基因（ICAM-1）表达量。
根据常规方法，通过结扎大鼠心脏左冠状动脉以诱导缺血再灌注损伤模型，以400μg/kg的剂量尾静脉注射聚合物/siRNA复合物（BPAE-SS/siRNA = 30, w/w）。在给药24 h后处死大鼠并取出心脏，PBS洗净，Trizol试剂提取心脏缺血组织总RNA，并通过实时PCR系统和Western Blot实验分析目的基因（ICAM-1）的表达量；在给药7天后处死大鼠并取出心脏，PBS洗净，切成约2 mm厚的片状，置于1% TTC磷酸盐染色液中，37 oC水浴20 min，4%甲醛溶液固定过夜。扫描仪扫描片状组织，ImageJ分析扫描图，计算心肌梗死面积；在给药3天后，腹腔注射戊巴比妥钠（5%，1.5 mL/kg）麻醉并固定大鼠，胸部去毛，进行心脏超声诊断，检测大鼠心脏射血分数（EF）和左室短轴缩短率（FS）评估心脏的左心室收缩功能。
将实施例二的还原响应性超支化聚β-氨基酯 （BPAE-SS）更换为对比例一的不敏感超支化聚β-氨基酯（BPAE-CC）以及对比例二的线性聚β-氨基酯 （LPAE），并与现有聚合物进行比较，进行平行对比实验；结果如下：
图5为实施例二和对比例二在不同聚合物/siRNA质量比下的凝胶电泳图，经数据分析可得，在质量比大于等于10时，实施例二可以完全包载住siRNA，说明实施例二中的超支化聚β-氨基酯具有显著提高的siRNA缩合能力。相比之下，CN110746599A实施例二公开的聚合物BPAE-NB需要在质量比大于等于15时，才可以完全包载住同样的siRNA。
图6为实施例二包载siRNA后的粒径和电势图，经数据分析可得，本发明的聚β-氨基酯和核酸药物质量比为5时即为正电荷，表面电势约为7～25mV，粒径约为120~150 nm。
图7为实施例二和对比例一经GSH预处理后，在不同质量比下包载siRNA的凝胶电泳图，经数据分析可得，在GSH处理后，实施例二在质量比为50时仍不能完全缩合siRNA，而对比例一在处理前后缩合siRNA的能力并无变化，证明实施例二/siRNA复合物的还原敏感性。
图8为实施例二、对比例一在GSH处理前后包裹siRNA后的粒径图，经数据分析可得，GSH处理后，实施例二（BPAE-SS复合物）的粒径显著增大，siRNA缩合能力明显降低，而对比例一（BPAE-CC复合物）的粒径未发生改变，表明BPAE-SS具有还原敏感性。
图9为实施例二、对比例一与siRNA复合后，经肝素钠处理的siRNA释放图，从图9中发现，当增加肝素钠浓度时，会有更多的siRNA分子被竞争释放出来。在聚合物经GSH处理后，siRNA在实施例二复合物中释放所需的肝素钠浓度大大降低，而对比例一复合物的siRNA释放行为未发生改变，说明实施例二具有良好的还原响应型，从而促进基因药物的释放。
图10为RCMECs细胞中，实施例二、对比例一、对比例二和PEI包裹siRNA后，复合物的细胞摄取效率，经分析数据可得，实施例二拥有比对比例一、对比例二和PEI更高的细胞内吞率，其中空白是指不染色的细胞，用来调试流式仪器。进行同样的细胞摄取效率实验，相比之下，CN110746599A实施例二公开的聚合物BPAE-NB包裹siRNA后的细胞内吞率为78.6%。
图11为复合物在RCMECs中的内涵体逃逸与siRNA的胞内释放图。经分析数据可得，与对比例二相比，经实施例二复合物处理后，细胞内大量的绿色荧光表明其更多地被细胞摄取，并且绿色荧光与红色荧光具有明显分离，说明该复合物可有效逃逸内涵体/溶酶体。
图12为实施例二、对比例一、对比例二和PEI在不同聚合物/siRNA质量比条件下的细胞毒性。从图12中可以发现，实施例二/siRNA复合物处理后，细胞活力约为100%，对比例二/siRNA复合物处理后，细胞活力≥90%，均未表现出显著的细胞毒性，而对比例一/siRNA复合物处理后细胞活力明显降低，表现出显著的细胞毒性。这表明在细胞内GSH的刺激下，实施例二聚合物可以降解为低分子量的片段，有效降低转染后材料的细胞毒性，生物相容性大大提高。
图13为复合物处理后RCMECs细胞中的ICAM-1的基因表达水平。经数据分析可得，实施例二/siICAM-1复合物可抑制RCMECs细胞中75%的ICAM-1 mRNA表达，其沉默效果显著优于商业试剂PEI。而对比例一/siICAM-1的基因沉默效率约为50%；对比例二/siICAM-1的基因沉默效率仅为30%；其中对照是指经PBS处理的细胞，PCR实验以PBS处理的细胞作为对照组，基因表达量记为100%。
图14为复合物给药后，大鼠受损心肌组织处的ICAM-1基因表达水平。经数据分析可得，实施例二/siICAM-1复合物给药后，损伤细胞中ICAM-1 mRNA的表达水平降低至21%，显著低于对比例一/siICAM-1和对比例二/siICAM-1，说明实施例二纳米药物优异的siRNA递送及沉默效率；其中对照是指注射PBS的大鼠心肌组织。
图15为复合物给药后，大鼠受损心肌组织处的ICAM-1以及炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）蛋白的表达水平。经数据分析可得，实施例二/siICAM-1给药组蛋白条带灰度显著降低，表明ICAM-1蛋白表达水平显著降低，其蛋白表达水平低于对比例一/siICAM-1和对比例二/siICAM-1，该结果与mRNA表达水平一致；其中对照是指PBS给药组大鼠（本质上是建立了炎症模型后，注射PBS进行治疗的大鼠）。
图16为复合物给药后大鼠心脏的TTC染色图。经TTC染色后，正常组织呈现红色，梗死组织呈现白色。经数据分析可得，与对比例一和对比例二相比，实施例二/siICAM-1给药组大鼠心脏的白色部分显著减少，心肌梗死面积仅为6%，证明该复合物可以有效地减少心肌梗死面积，减轻心脏损伤；其中对照同图15。
图17为复合物给药后大鼠心脏超声检测图，其中的射血分数（EF）和左室短轴缩短率（FS）是评估左心室功能的重要参数。经数据分析可得，实施例二/siICAM-1给药组大鼠的EF和FS分别为84%和47%，显著高于对比例一和对比例二，并且与正常组相比无显著差异。该结果表明实施例二/siICAM-1复合物可有效递送ICAM-1 siRNA，并通过沉默ICAM-1的表达，抑制炎症反应，显著改善左心室收缩功能。
本发明提供的还原响应性超支化聚β-氨基酯，该聚合物具有超支化的结构以及还原条件响应的基团，可以用作核酸的递送载体且具有还原响应性、高效的基因转染效率以及良好的生物相容性，在核酸药物，特别是siRNA药物递送系统中具有良好的应用前景。
