包含非共价连接的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜
技术领域
本发明涉及一种多孔硝酸纤维素膜及其制备和使用方法，所述多孔硝酸纤维素膜包括表面和有机纳米结构分子。特别地，本发明的多孔NCM包括表面结合的有机纳米结构分子。所述有机纳米结构分子具有分支区域，该分支区域包括多个末端区域(例如末端)部分，其非共价连接或结合至多孔NCM表面。所述有机纳米结构分子还包括线性区域，该线性区域包括共价连接的捕获分子，该捕获分子适于选择性地结合目标分子。
背景技术
硝酸纤维素膜是由硝酸纤维素构成的多孔膜。多孔硝酸纤维素膜的中值孔径通常为约0.2μm至约15μm。尽管硝酸纤维素膜总体上是中性的，但是它们已被用于通过NCM的硝基基团和蛋白质中存在的偶极矩之间的强偶极矩来固定蛋白质。在某些情况下，蛋白质的离子侧链也已被用于将蛋白质固定在NCM上。NCM固定蛋白质的能力随所用溶液的pH值而变化。不受任何理论的限制，认为pH通过改变溶液中蛋白质的性质来影响特定蛋白质的固定效率。
硝酸纤维素膜也已经被用于静电固定核酸。相对于双链DNA，硝酸纤维素对单链DNA和DNA-RNA杂交体具有特别高的亲和力。通常，NCM不固定RNA。核苷酸结合特性的这些差异已被用于在液相杂交体形成反应中分离或定量单链核苷酸链和单链核酸，以及分离或定量与蛋白质形成复合物的核酸。
使用硝酸纤维素膜对目标材料或物质(例如蛋白质、核酸等)进行定量分析时，用作捕获分子的蛋白质(例如与感兴趣的目标材料选择性结合的蛋白质)通常印刷在硝酸纤维素膜上并干燥所得的硝酸纤维素膜。以这种方式，将捕获分子固定在硝酸纤维素膜上，而在捕获分子与硝酸纤维素膜表面之间不产生共价键(图1)。不受任何理论的限制，捕获分子在硝酸纤维素膜表面上的这种非共价固定或连接，可以通过多种化学和/或物理手段实现，例如但不限于离子相互作用、氢键、疏水相互作用、范德华相互作用等。而且，同样不受任何理论的限制，在非共价连接中，在捕获分子在硝酸纤维素膜表面上的固定中可能涉及一种或多种这样的化学和/或物理相互作用的组合。据认为，俘获材料(或捕获分子)与硝酸纤维素膜表面的非共价连接是一种热力学现象，并且偶极矩相互作用和/或疏水相互作用被认为是引起该现象的主要因素或要素之一。
硝酸纤维素膜是多孔结构的聚合物，其可以用作具有基本上单向流动的溶液的色谱基质。这种基本上单向流动的方式使得硝酸纤维素膜可以用在各种诊断检测的流通型测试试剂盒中。与任何流通型测试或诊断试剂盒一样，如果目标材料穿过包含捕获分子的固定区域而未形成捕获分子-目标材料复合物，则无法准确确定样品中目标分子的存在。此外，如果一项测试的流速与另一项测试的流速不同，则该测试或诊断试剂盒将不可靠。因此，准确而可靠的测试或诊断试剂盒需要为捕获分子-目标材料复合物的形成提供足够的时间。在硝酸纤维素膜中产生恒定流速的常规方法是调节膜的孔径。
不幸的是，流速和孔径不是流通型测试或诊断试剂盒的准确性和可靠性所需的唯一因素。例如，即使目标材料在足够的时间内通过结合到膜表面的捕获分子以在捕获分子和目标材料之间形成复合物，通常也不会形成所需的复合物，这是因为形成捕获分子-目标材料复合物所需的反应位点可能会由于方向不正确或硝酸纤维素膜表面上存在多个捕获分子层而被遮盖或无法进入。这些因素还会导致使用硝酸纤维素膜的流通型测试或诊断试剂盒的重现性和可靠性降低。
因此，仍需基于硝酸纤维素膜的高度可重现和可靠的测试和/或诊断试剂盒。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种使用硝酸纤维素膜的高度可重现和可靠的测试和/或诊断试剂盒。本发明的硝酸纤维素膜包括非共价结合的有机纳米结构(即，有机纳米结构分子)。在一些实施方案中，有机纳米结构分子包含共价连接(即，共价结合)的捕获分子或捕获材料，所述捕获分子或捕获材料能够选择性地结合目标材料或目标物质。不受任何理论的限制，据认为，使用有机纳米结构分子使得捕获分子更有效和有利地呈递至目标材料，从而产生更准确和可靠的测试/诊断试剂盒。
据认为，使用本发明的有机纳米结构分子产生了更易接近和更结构化(即，不成团或多层)的反应或结合位点，从而显著降低了捕获分子和目标材料之间结合的空间位阻。当在将有机纳米结构连接到膜载体上之后，将捕获分子连接或印刷到有机纳米结构分子上时，可以获得相同的效果。使用有机纳米结构分子连接捕获分子改变了捕获分子在硝酸纤维素膜表面上的空间环境，从而创造一种环境，在该环境中使目标材料和捕获分子更容易形成复合物。所得的硝酸纤维素膜提供了对目标材料的高度可重复和高度可靠的定量和定性分析。
本发明的另一方面提供了目标材料的一种高度可重现的定量分析方法。目标材料选择性地结合至捕获分子，该捕获分子共价连接于本发明的有机纳米结构分子上。反过来，有机纳米结构分子非共价连接于用作支撑物的硝酸纤维素膜上。
本发明的另一方面还提供了一种定量和/或定性的检测试剂盒。在一些实施方案中，检测试剂盒能够以高度重现性定量测试目标材料。
在一些实施方案中，有机纳米结构分子包含多个分支区域和线性区域。线性区域的末端含有可用于共价连接捕获分子的官能团。可替代地，在将有机纳米结构分子非共价连接到硝酸纤维素膜上之前，可以先将捕获分子连接到线性区域的末端。在一些实施方案中，有机纳米结构分子包含多个(例如，至少两个，通常至少三个，并且最经常为三个、九个或二十七个)能够在硝酸纤维素膜上形成非共价连接的分支区域末端官能团。分支区域末端官能团可以带正电或带负电。
本发明的另一方面还提供了一种使用本文所述的硝酸纤维素膜对目标材料进行定量和/或定性分析的方法。
本发明的另一方面还提供了一种包括本发明的硝酸纤维素膜(NCM)的定量和/或定性的检测试剂盒。
本发明还提供了一种有机纳米结构分子，其尤其可用于目标材料的定量和/或定性分析。本发明的有机纳米结构分子包括多个可用于共价连接捕获分子的分支区域末端官能团和线性区域末端官能团。
在一些实施方案中，与基于常规硝酸纤维素的检测测试(例如基于具有聚乙二醇(“PEG”)连接基的那些检测测试)相比，使用本发明的硝酸纤维素膜使选择性和/或特异性提高了至少10％，通常至少25％，并且经常至少50％。在其他实施方案中，使用本发明的硝酸纤维素膜使重现性提高了至少100％，通常至少200％，经常至少300％，更经常至少400％，最经常至少500％，如图4所示。
附图说明
图1是一个示意图，其中常规方法的捕获材料被固定在硝酸纤维素膜(NCM)的表面上。
图2-1是示出了根据本发明的一个实施方案，使用有机纳米结构分子将捕获分子连接在硝酸纤维素膜上的示意图。
图2-2是示出了根据本发明另一个实施方案，使用有机纳米结构分子将捕获分子连接在硝酸纤维素膜上的示意图。
图3是示出了实施例1的捕获材料与有机纳米结构之间的摩尔比的重现性结果的图，具有浓度-CV(％)图、趋势线和标准方程，且CV浓度为10％。
图4是示出了根据比较例1当将有机纳米结构在CV10％下施加到各制造商的硝酸纤维素膜上时的重现性结果和重现性增强倍率的图。
图5是示出了根据实施例2在CV10％的浓度下的有机纳米结构的环氧基和醛官能团的重现性结果和重现性增强倍率的图。
图6是示出了根据实施例3在CV10％的浓度下的有机纳米结构的分支末端为负电荷或正电荷的重现性和重现性增强倍率的图。
图7示出了根据实施例4在CV10％的浓度下的有机纳米结构的分支分子数目为3和9时的重现性结果和重现性增强倍率的图。
图8是如实施例5所示将有机纳米结构和捕获材料结合时，采用顺序法和混合法的在CV10％的浓度下的重现性和重现性的增强的图。
具体实施方式
提出本发明的以下讨论仅出于说明本发明的某些方面的目的，而无意于限制本发明的范围。尽管本发明的描述包括一个或多个实施方案以及某些变型和修改的描述，但是在理解本公开之后，例如在本领域技术人员的技术和知识范围内的其他变型和修改也在本发明的范围内。旨在在允许的范围内包括替代实施方案，所述替代的实施方案包括与所要求保护的那些结构、功能、范围或步骤的替代、互换和/或等效的结构、功能、范围或步骤，而不管这种替代、互换和/或等效的结构、功能、范围或步骤在本文中是否公开，并且无意公开致力于任何可获专利的主题。本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文中。
本文中使用的术语仅出于描述特定应用的目的，而不旨在限制本发明。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”也包括复数指示物。
本发明的一个特定方面提供了一种硝酸纤维素膜(NCM)，其对于目标材料的定量和/或定性分析是有用的。在一个实施方案中，NCM包含非共价连接到NCM的有机纳米结构分子。本发明的有机纳米结构分子包括多个分支区域，每个分支区域可包括可用于非共价连接至NCM的末端官能团。分支区域的末端官能团可以带正电或带负电。有机纳米结构分子还包括线性区域，该线性区域包括能够与捕获分子共价连接或结合的官能团。应当理解，本发明的范围包括有机纳米结构分子，其中捕获分子已经共价连接至有机纳米结构分子。
本发明的有机纳米结构分子包含中心原子、具有多个末端部分的分支区域以及具有末端官能团的线性区域。线性区域末端官能团用于共价连接捕获分子，如本文中详细描述的。多个分支区域末端部分(即，多个分支区域末端官能团)用于将有机纳米结构化合物非共价连接到多孔硝酸纤维素膜上。通常，本发明所用的硝酸纤维素膜的中值孔径为约0.05μm至约30μm，通常为约1μm至约30μm，通常为约5μm至约20μm，更通常为约10μm至约15μm。除非上下文另外要求，否则本文所用的术语“约”在指数值时是指数值的±20％，通常为±10％，经常为±5％，最经常为±1％。在一些实施方案中，线性区域的末端官能团包括共价结合的捕获分子。
尽管可以使用多种方法将有机纳米结构分子非共价连接至硝酸纤维素膜，但是本发明的一个特定实施方案包括通过多种非共价连接方法将有机纳米结构分子固定在多孔硝酸纤维素膜的表面或基质上。有机纳米结构包括：(i)中心原子；(ii)分支区域，其具有多个末端部分，所述末端部分非共价连接在所述多孔硝酸纤维素膜的表面上；以及(iii)线性区域，在所述线性区域的末端具有共价结合的捕获分子，其中当样品中存在目标材料时，所述捕获分子适于选择性地结合目标材料。可以通过任何已知方法将有机纳米结构分子连接至硝酸纤维素膜，所述已知方法包括但不限于印刷方法。印刷方法包括，例如使用喷射印刷技术，将有机纳米结构分子的溶液印刷在硝酸纤维素膜上并使印刷的溶液干燥。这种印刷技术允许通过多个非共价键将有机纳米结构分子固定在硝酸纤维素膜上。
可替代地，将有机纳米结构分子固定在硝酸纤维素膜上(例如，通过印刷方法)，并在足以产生与捕获分子共价连接的有机纳米结构线性区域的条件下，使捕获分子与有机纳米结构分子的线性区域的末端官能团反应。在一些实施方案中，将捕获分子印刷在硝酸纤维素膜的与有机纳米结构分子非共价连接的区域相同的区域上，并且在使用硝酸纤维素膜进行定量和/或定性检测之前，允许所得区域反应并干燥。不受任何理论的限制，据认为，使用有机纳米结构分子将捕获分子连接到硝酸纤维素膜上可以控制捕获分子-目标材料复合物之间的距离，如图2所示，从而显著降低了空间位阻。
一种检测方法涉及使用本文所述的硝酸纤维素膜(例如，作为流通型检测试剂盒或侧流型检测试剂盒)，并使样品或样本与硝酸纤维素膜接触以确定样品或样本中目标材料的存在和/或数量。如本文所用的，术语“样品”和“样本”在本文可互换使用，并且是指被分析的材料。这样的样品可以是体液样品(例如血液、唾液、粪便、尿液、粘液等)、生物学样品(例如细胞、DNA、蛋白质、细菌、病毒等)、化学样品、食物样品、环境样品(例如土壤、大气等)以及任何其他可以分析的样品。通常，使用侧流或流通方法进行检测以将目标材料(如果存在)与捕获分子结合。
检测过程还可以包括向硝酸纤维素膜中添加检测材料，例如信号示踪剂，如荧光团、酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、胶体金等，以确定捕获分子-目标材料复合物的存在或数量。分析可以包括使捕获分子-目标材料复合物与类似于ELISA中使用的检测材料反应。
检测材料可以包括适于产生比色、化学发光或化学荧光信号的部分。如此，可以使用光学传感器分析所产生的信号(例如，分别为颜色、发光或荧光信号)。还可以分析信号的信号水平，以量化在硝酸纤维素膜上形成的捕获分子-目标材料复合物。例如，如果检测材料包括荧光信号产生部分，则用激发波长的光照射硝酸纤维素膜，并且可以量化荧光强度以确定样品中存在的目标材料的量。当检测材料包括胶体金时，使用光学设备的比色参数来获得在光学系统中的显色度，以量化样品中存在的目标材料的数量。
可以使用目标材料浓度和信号值之间的关系图、趋势线、标准方程式和确定系数，对例如使用光学设备获得的信号进行量化或半量化。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用于可靠地分析多种目标材料，例如细胞、DNA、RNA、PNA、适体(aptamer)、配体、外泌体(exosome)、脂质。除非上下文另外要求，否则术语“分析(analyze)”或“分析(analysis)”是指定性和/或定量分析。
本发明还提供了一种使用硝酸纤维素膜分析目标材料的方法，包括以下步骤：(i)当样品中存在目标材料时，在足以形成捕获分子-目标材料复合物的条件下，将样品添加到本发明的硝酸纤维素膜中；(ii)当捕获分子-目标材料复合物存在于硝酸纤维素膜上时，使所得的硝酸纤维素复合物与检测材料接触以形成检测复合物；以及(iii)分析由检测复合物产生的信号以确定样品中目标材料的存在和/或存在的数量。
样品通常作为溶液呈现。可以使用本发明的方法进行分析的示例性样品包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、尿液、生物样品(例如粪便、痰或组织)、环境样品(例如水样品、土壤样品、空气样品)和食物样品(例如肉、鱼、蔬菜、饮料、干食品、加工食品)等。
目标材料可以是需要分析的任何物质，例如抗原、抗体、蛋白质、肽、DNA、RNA、PNA、适体、配体、有毒化合物、脂质、激素、无机物、细菌、病毒、大囊泡(macro-vesicles)、微囊泡(micro-vesicles)、外泌体或细胞等。
捕获分子可以是可以选择性结合目标材料的任何分子。示例性的捕获分子包括但不限于抗原、抗体、DNA、RNA、PNA、适体、配体、脂质、激素等。
检测材料还可以包括信号体或检测部分，例如但不限于荧光团、磁性颗粒、酶、纳米颗粒、纳米纤维等。
在本发明中，取决于有机纳米结构分子的分子量或结构，可以控制存在于硝酸纤维素膜表面上的捕获分子之间的距离和密度。在一个特定的实施方案中，有机纳米结构分子的线性区域末端官能团(或与其连接的捕获分子)之间的距离可以控制在约0.5nm至约10nm的范围内。或者，可以将硝酸纤维素膜上的捕获分子的密度调节在每nm2约0.01至约0.1个捕获分子的范围内。
使用本发明的硝酸纤维素膜——其包含非共价连接的有机纳米结构分子，该有机纳米结构分子具有共价连接的捕获分子——的分析方法可以以检测试剂盒的形式使用，也可以应用于诊断方法中。在一个特定实施方案中，本发明的检测试剂盒以侧流型或流通型检测试剂盒的形式制造。然而，应当理解，本发明的范围不限于这些特定的检测试剂盒。
本发明还提供了可用于将捕获分子共价连接至硝酸纤维素膜的有机纳米结构分子。所述有机纳米结构分子包括具有末端官能团的线性区域，该末端官能团用于共价连接捕获分子。所述有机纳米结构分子还包括多个分支区域。多个分支区域包括末端官能团，其可用于将有机纳米结构分子非共价连接至硝酸纤维素膜。
可用于共价连接捕获分子的线性区域的末端官能团可以是例如羟基、甲酰基、羰基、羧基、醚基、酯基、硝基、氨基、磺酸基、苯基、烷基、膦基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、醛基、环氧基、吖内酯(azlactone)、羰基二咪唑、马来酰亚胺、碘乙酰基、吡啶基二硫化物、吡啶基二硫化物、酰肼水合物或EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)HCl)。线性区域的典型的末端官能团选自醛基和环氧基。然而，应当理解，本发明的范围不限于上述线性区域的末端官能团。
在一些实施方案中，有机纳米结构分子的线性区域包括至少一个醚基。醚基的存在改进了有机纳米结构分子的亲水性。
在其他实施方案中，有机纳米结构分子的分支区域的每个末端官能团选自氨基、磺酸基、苯基、烷基、膦基、醛基、羟基、甲酰基、羰基、羧基、醚基、酯基、硝基和环氧基。然而，应当理解，分支区域的末端官能团不限于这些官能团。通常，可以使用允许有机纳米结构分子非共价连接至硝酸纤维素膜的任何合适的官能团。
在其他实施方案中，有机纳米结构分子的分支区域包括至少两个、通常至少三个、通常三个、九个或二十七个末端官能团，所述末端官能团适于将有机纳米结构分子非共价连接到硝酸纤维素膜上。
在一些实施方案中，有机纳米结构分子在其线性区域上包含三唑部分。令人惊讶地且出乎意料地，本发明人已发现，在有机纳米结构分子的线性区域上存在三唑部分提供了高度可重现和可靠的硝酸纤维素膜检测试剂盒。此外，与其他线性区域部分相比，在线性区域上存在三唑部分还允许相对刚性的结构并易于合成。在一个特定实施方案中，有机纳米结构分子具有下式所示结构：
L-Q1-(T)a1
式A
其中
L是有机纳米结构分子的线性区域部分，该线性区域部分包含三唑部分，其中L进一步包含：
(i)适于共价连接捕获分子的线性区域末端官能团，所述捕获分子适于选择性地结合目标分子，或
(2)适于选择性地结合目标分子的共价连接的捕获分子；
Q1是所述有机纳米结构分子的氧化态为至少3的中心原子；
a1是从2到Q1-1的氧化态的整数；且
每个T独立地是所述有机纳米结构分子的分支末端区域部分，其包含适于将所述有机纳米结构分子非共价连接至所述多孔硝酸纤维素膜的分支末端区域官能团；
并且其中所述有机纳米结构分子通过多个所述分支末端区域官能团非共价连接至所述多孔硝酸纤维素膜。
在一些实施方案中，L包含三唑基部分。在其他实施方案中，L包含1,2,3-三唑基部分。在其他实施方案中，L包含1,4-取代的1,2,3-三唑基部分。
在一个特定实施方案中，L包含下式的部分：
其中Ra如本文所定义，且Rb为连接至Q1的连接基。在一些实施方案中，Rb是具有约2至约10、通常为约2至约8、经常为约2至约6且更经常为2至4个原子链的连接基。在一个特定实施方案中，Rb是式-(CH2)2-C(＝O)-NRc-的部分，其中Rc是氢、C1-4烷基或氮保护基。术语“烷基”是指具有一至十二个、通常为一至六个碳原子的饱和直链一价烃部分，或具有三至十二个、通常为三至六个碳原子的饱和支链一价烃部分。示例性的烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、2-丙基、叔丁基、戊基等。
应当理解，当a1是小于Q1-1的氧化态的整数时，则Q1可以连接到氢或烷基上，例如，当Q1是C且a1是2时，则该式A的化合物可以表示为：L–CH(T)2或L–CR1(T)2，其中R1是烷基，例如甲基、乙基等。
在另一个实施方案中，有机纳米结构分子具有下式所示结构：
L–Q1–{[R2–Q2]a–{(R3–Q3)b–[(R4–Q4)c–(R5–Y)x]y}z}n
IA
其中
a、b和c各自独立地为0或1；
当c为0时，x为1，或当c为1时，x为从1到Q4-1的氧化态的整数；
当b为0时，y为1，或当b为1时，y为1到Q3-1的氧化态的整数；
当a为0时，z为1，或当a为1时，z为从1到Q2-1的氧化态的整数；
n是从1到Q1-1的氧化态的整数；
L和Q1如本文所定义；
Q2、Q3和Q4各自独立地为氧化态为至少3的支链原子；
R2、R3、R4和R5各自独立地为连接基；且
Y是所述分支末端区域官能团，
前提是n、x、y和z的乘积至少为3。连接基R2、R3、R4和R5可以是亚烷基(例如亚甲基、亚乙基、亚丙基等)，任选地具有杂原子，例如O、S或NR(其中R可以是H或C1-C6烷基)。术语“亚烷基”是指具有一至十二个、优选一至六个碳原子的饱和直链饱和二价烃部分，或具有三至十二个、优选三至六个碳原子的支链饱和二价烃部分。示例性亚烷基基团包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基等。在一些实施方案中，R2，R3，R4和R5各自独立地选自–CH2–、–CH2–O–、–CH2–CH2–、–CH2–CH2–O–、–O–CH2–CH2–、–CH2–CH2–CH2–O–、–O–CH2–CH2–CH2–等。
在另一个实施方案中，有机纳米结构分子具有下式所示结构：
其中
Q1、Q2、Q3、Q4、R2、R3、R4、R5、Y、a、b、c、x、y、z和n如本文所定义；
Ra选自：
以及上式的组合，
其中
虚线表示任选的双键；
Z是适于选择性地结合目标分子的捕获分子，并且其中所述Z使用式L1化合物的醛基官能团或式L2化合物的环氧基官能团共价连接。
在另一个实施方案中，有机纳米结构分子具有下式所示结构：
其中Ra如本文所定义。
一些示例性的有机纳米结构分子具有下式所示结构：
通常，除非另有定义，否则本文使用的术语是有机化学和生物化学领域的技术人员众所周知的。本文使用的一些特定术语定义如下。
术语“样品”是指液体或溶液样品，包括但不限于乳液、分散体、均质溶液和悬浮液。
术语“生物流体”是指所有的临床样品。示例性的生物流体包括但不限于血液、血浆、血清、尿液、粘液、脊髓液、唾液以及从生物体内排泄、分泌或转移的任何其他生物流体。
除非上下文另外要求，否则术语“捕获分子(capturing molecule)”、“捕获分子(capture molecule)”、“捕获材料(capturing material)”和“捕获材料(capturematerial)”在本文中可互换使用，并且是指能够直接或间接结合目标材料的物质。示例性的捕获分子包括但不限于核酸(例如，DNA、RNA、PNA和相应的寡核苷酸)、受体、配体、酶、蛋白质、适体以及可选择性地结合目标材料的任何其他基质。在一个具体实例中，捕获分子是对所需抗原具有强结合能力的抗体。
术语“检测分子”、“检测材料”、“检测物质”和“检测部分”在本文中可互换使用，并且是指能够检测或观察在捕获分子和目标材料之间形成的复合物的物质。检测分子可以是捕获分子和/或目标材料的一部分。因此，检测分子不必是单独的分子。
捕获分子可以是能够特异性地识别具有捕获分子靶向的不同识别位点的目标材料的任何物质。例如，捕获分子可以是(i)抗体，包括从抗血清中纯化的多克隆抗体，该抗血清是通过用目标物质使哺乳动物免疫而获得的，(ii)产生抗体的细胞，其是从用目标物质免疫的哺乳动物中提取的，和(iii)单克隆抗体，其可以使用通过与骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤产生。可通过本领域技术人员已知的纯化方法获得针对目标物质的多克隆抗体，所述纯化方法例如(i)盐析抗血清，(ii)离子交换色谱，(iii)亲和色谱等。目标材料的单克隆抗体可通过本领域技术人员获得，例如：用目标物质使合适的动物(如小鼠)免疫，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并使用如ELISA的方法，选择克隆以产生抗体，该抗体能够特异性地结合目标材料，然后使用通过将合适的上清液或杂交瘤接种到合适的动物中而获得的腹水。通过将抗体固定在本文所述的载体如硝酸纤维素膜上，可以将如此获得的针对目标材料的抗体用作捕获分子。
通常，在抗体的产生中，将合适的实验动物暴露于需要抗体针对的抗原中，所述合适的实验动物例如但不限于兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、小鼠、大鼠或鸡。通常，用注射入动物的有效量的抗原免疫动物。有效量的抗原是指诱导动物产生抗体所需的量。然后使得动物的免疫系统在预定时间段内做出反应。可以重复该免疫过程，直到发现免疫系统正在产生针对抗原的抗体。为了获得对该抗原具有特异性的多克隆抗体，从含有所需抗体的动物中收集血清(或者对于鸡，可以从鸡蛋中收集抗体)。这样的血清可用作试剂。可以通过例如用硫酸铵处理血清从血清(或鸡蛋)中进一步纯化多克隆抗体。
单克隆抗体可以例如根据Kohler和Milstein(Nature，1975，256，495-497)的方法产生。例如，从免疫的动物的脾脏(或任何合适的组织)中回收B淋巴细胞，然后与骨髓瘤细胞融合以获得能够在合适的培养基中继续生长的杂交瘤细胞群。通过测试杂交瘤产生的抗体结合期望抗原的能力来选择产生期望抗体的杂交瘤。
抗体也可以用作检测材料，以通过在抗体上标记信号部分，例如酶、荧光物质或胶体金来识别与捕获分子复合的目标材料。作为具有信号部分标记的检测材料的抗体，通常使用单克隆抗体以获得对目标物质的高选择性。然而，当捕获分子是单克隆抗体时，该多克隆抗体可以用作检测材料。
本发明中的术语“温育(incubation)”是指将抗原-抗体或互补DNA或RNA之间的反应保存在恒定温度下(例如，在±5℃之内，通常在±3℃之内，经常在±1℃之内)。抗原-抗体反应是抗体与具有互补结构的抗原的选择性结合。如本文所用的，互补DNA或RNA反应是其中每条链的DNA或RNA具有用于杂交的100％互补碱基序列的反应。因此，本发明的组分和方法可用于区分单核苷酸多态性(“SNP”)。
术语“洗涤”以广泛可接受的方式使用。通常，术语“洗涤”是指在温育过程中使用溶剂或溶液洗涤或除去剩余的物质，而不与捕获分子或目标材料反应(例如，抗体或核酸杂交)。只要不影响捕获分子-目标材料复合物的形成(例如，抗原-抗体或核酸杂交)，就没有特别的限制。可以添加表面活性剂以增强清洁或洗涤效果。另外，洗涤或清洁方法没有特别限制，只要其对整个复合物形成过程有效即可。洗涤或清洁是可选步骤，可以进行此步骤以通过除去潜在的信号干扰物质来提高分析的灵敏度。
在本发明中，温育和信号体信号产生步骤中的反应温度没有特别限制。但是，为了防止酶信号活性的损失或反应溶液的冻结或蒸发，捕获分子与目标材料的结合在约4℃至约40℃的温度范围内进行。当需要在酶-配体复合中快速终止信号时，复合物形成的温度范围通常在约15℃至约40℃的范围内。
在形成捕获分子与目标分子之间的复合物的温育过程中，较长的温育时间通常导致较高量的捕获分子-目标材料复合物的形成。但是，结合(即复合物形成)反应在一定时间后会饱和。为了提供快速分析，期望减少复合物形成(即温育)的时间。NCM载体上负载(即非共价固定)的捕获分子数量越多，灵敏度越高，因为可以将更多的目标材料与捕获分子复合，因此可以缩短反应或温育时间。另一方面，通过阻断反应(络合物形成)位点而使目标材料成为空间位阻的一部分，效率降低；因此，有必要优化负载(即固定)到硝酸纤维素膜上的捕获分子的量。如本文所用的，当指有机纳米结构分子与硝酸纤维素膜的连接时，术语“固定”是指在检测过程中，干燥的硝酸纤维素膜中的基本上所有(通常>90％，经常>95％，最经常>99％)有机纳米结构分子保持连接在硝酸纤维素膜上。
由于捕获分子通过有机纳米结构分子固定在硝酸纤维素膜的表面上，因此每个捕获分子之间的距离可以由有机纳米结构分子相对地控制。这消除或显著减少了由于空间位阻而导致定量分析重现性不佳的问题。
术语“荧光”、“化学发光”、“化学荧光”和“比色”是本领域技术人员众所周知的。通常，这些术语是指使用本领域技术人员已知的任何分析方法发出或可以检测到的颜色或光(荧光、发光)的事实。
在本文公开的方法的分析步骤期间，可以使用裸眼半定量或定性地测量或测定信号。然而，通常，信号是通过仪器(例如比色仪器、UV/Vis光谱仪等)测量的，以定量或定性地分析信号。如本领域技术人员所公知的，“化学发光”、“化学荧光”和“荧光”通常用于测量由光学装置系统的图像传感器发射的荧光或化学发光的强度。可以定量或定性地分析此类信号。
除非上下文另外要求，术语“检测”和“分析”是指用于确认目标材料存在的步骤。这些术语包括用于确认目标材料存在与否的定性确定，以及目标物质浓度的定量或半定量确定。
通常，样品是具有流动性的流体或溶液，以便于目标材料(如果存在于样品中)和固定在NCM载体上的捕获分子之间的选择性或特异性结合。然而，应当理解，样品不限于流体。例如，如果样品是固体，则可以使用合适的溶剂将其溶解或分散在溶液中。
关于测量(即检测)所需的样品量，对所需样品量没有特别要求，只要样品量足以允许对目标材料进行检测/定量即可，如果存在于样品中，则通过固定在NCM载体上的捕获分子来实现。可以在检测之前先稀释样品。但是，稀释样品会降低目标材料的浓度。因此，有可能由于样品中目标材料浓度的降低而难以进行目标材料的检测或定量。在这种情况下，如果样品中存在目标材料，则可以增加温育时间以留出足够的时间来形成捕获分子-目标材料复合物。或者，可以增加捕获分子的量以补偿目标材料浓度的降低。在本发明的分析方法中使用的样品的量通常为约10μL至约200μL。但是，应当理解，分析中使用的样品的量不限于这些范围。实际上，足以允许在捕获分子和目标材料之间形成复合物的任何量的样品都可以用于本发明的方法。
固定在NCM载体上的捕获分子共价连接到有机纳米结构分子的线性区域末端官能团上。有机纳米结构分子的合适的线性区域末端官能团包括但不限于羟基、甲酰基、羰基、羧基、醚基、酯基、硝基、氨基、磺酸基、苯基、烷基、膦基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、醛基、环氧基、吖内酯、羰基二咪唑、马来酰亚胺、碘乙酰基、吡啶基二硫化物、酰肼和EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)HCl)。
在一些实施方案中，为了避免或显著降低所需目标材料与硝酸纤维素膜的非捕获分子部分之间的相互作用，从而产生假阳性信号，可以阻断或淬灭硝酸纤维素膜的非捕获分子部分。例如，当捕获分子是蛋白质时，用含有酪蛋白、牛白蛋白或明胶的溶液处理硝酸纤维素膜，大大降低或防止了硝酸纤维素膜的非捕获分子部分与目标材料之间的非选择性相互作用。
本发明的方法可以用于检测/分析任何期望的目标材料。可以通过硝酸纤维素膜和本发明的方法检测/分析的示例性目标材料包括但不限于生物材料(例如抗原、抗体、蛋白质、脂质、肽、DNA和RNA)、有毒化合物、无机物、细菌、病毒、大囊泡、微囊泡、外泌体和细胞，以及非生物材料(例如药物、颜料、重金属)。
本发明的方法还可包括用两种抗体(例如，一种作为捕获分子，另一种作为检测材料)捕获目标材料。这样的方法类似于酶联免疫吸附检测(“ELISA”)，但是提供了实质上更高的可靠性和重现性。而且，本发明的方法明显更准确，并且用于检测/分析所需的目标材料的量显著减少。这样的方法对于具有含12至15个氨基酸的肽的分子量的目标材料特别有用。
当目标材料是诸如维生素的无机物质或诸如葡萄糖的低分子量物质时，抗体作为捕获分子是不合适的。在这种情况下，可以利用类似于目标材料的材料与一种特定的信号示踪剂之间的相互竞争。
本发明的其他目的、优点和新颖特征通过研究以下实施例而对于本领域技术人员变得显而易见，所述实施例并不旨在进行限制。在实施例中，以现在时态描述了结构上简化为实践的过程，并且以过去时态阐述了在实验室中已经进行的过程。
实施例
实施例1
在该实施例中，使用适于检测急性心肌梗塞生物标志物(即，心肌肌钙蛋白I(cTnI))的捕获分子来确定高度可重现的定量分析所需的有机纳米结构分子的合适量。
有机纳米结构分子(MW 762.93，C27H41K3N4O14)的钾盐水溶液，以相对于捕获分子(即对cTnI具有特异性的抗体)的摩尔数计0.4、1.0、4.1和5.1的摩尔比制备。将制备的有机纳米结构分子溶液以0.35μL/cm的速度分散到硝酸纤维素膜(CNPC，AdvancedMicrodevices，India)上以形成一条线，并在干燥器中于40℃和10％的相对湿度下干燥约10分钟。此后，通过相似的方法制备具有不同量的有机纳米结构分子的四种类型的硝酸纤维素膜，并在干燥器中于60℃和10％或更低的相对湿度下干燥24小时。为了比较有机纳米结构分子的量的影响，制备了不提供有机纳米结构分子而仅提供水的硝酸纤维素膜作为对照。将cTnI特异性捕获抗体(0.027mM，0.35μL/cm分散速率)分散到同一位置以再生线，并在干燥器中于40℃和10％的相对湿度下干燥约10分钟，然后使其在干燥器中于60℃和10％或更低的相对湿度下干燥24小时。
使用这些膜制备了侧流型试剂盒。将用人血清(Sigma-Aldrich，Louis，MO)(FSDTM647，在650nm处最大激发)稀释的各种浓度的cTnI抗原(8T62，HyTest，Finland)放置在检测试剂盒上，然后与100μL的每个测试组和每个对照组进行免疫印迹结合。665nm最大发射部分(BioActs，Korea)被聚合的cTnI特异性结合检测抗体(4T21clone19C7，HyTest，Finland)夹在中间。使用激光二极管(650nm)的激发光和配备了滤光片(拦截低于660nm的波长)的光电二极管检测荧光信号。使用光敏荧光读取器测量发出的665nm荧光。通过对控制线区域和测试线区域的面积进行积分，并将测试线面积积分值转换为除以控制线面积积分值的T/C比，获得测量的荧光信号值。绘制了目标物质(cTnI)浓度的标准曲线(图3)。
测量每个样品的发射16次，并使用通过标准曲线获得的标准方程式进行转换，并且使用以平均值和标准偏差计算的转换后浓度的变异系数(CV)获得CV(％)图，(图3)。
使用由趋势线(为CV图中的电源线(power line)的形式)获得的方程式将有机纳米结构的每种供给量的10％CV下的浓度值与样品浓度进行比较。
由具有固定的捕获分子而不存在有机纳米结构分子的对照硝酸纤维素膜获得了在10％CV下的浓度为2.03ng/mL，水处理后，由具有固定的捕获分子而不存在有机纳米结构分子的对照硝酸纤维素膜获得了在10％CV下的浓度为1.95ng/mL。
在包括是捕获分子的相对摩尔数的0.4、1.0、4.1和5.1倍的有机纳米结构分子的测试组中，在CV 10％下的浓度分别为6.70ng/mL、8.30ng/mL、0.40ng/mL和2.55ng/mL。在这四种不同浓度中，固定在使用与捕获分子相比4.1倍摩尔数的有机纳米结构分子处理的硝酸纤维素膜上的试剂盒，得到了最佳的可重复结果(图3)。在这种侧流型和快速型检测平台中，用捕获分子的相对摩尔数的4.1倍处理的有机纳米结构分子显示的CV 10％性能比固定的定量分析的CV 10％性能低约5倍，表明标准容量在重复性方面有所提高。
比较例1
在该比较例中，检查了来自不同制造商的硝酸纤维素膜的效果。简而言之，使用与捕获分子相比4.1倍的摩尔过量的有机纳米结构分子制备了侧流型试剂盒，并检测了人血清中的急性心肌梗塞标志物。在10％CV下检测作为生物标志物的cTnI目标物质，以比较定量改进效果。来自三种不同制造商的硝酸纤维素膜(Millipore的HF-135，GE Healthcare的Immuno-pore RP和AdvancedMicrodevices的CNPC)使用有机纳米结构分子将捕获分子固定。作为对照，也将膜与捕获分子固定在一起，而不使用任何有机纳米结构分子。
制备了人血清(Sigma-Aldrich，Louis，MO)中不同浓度(0、0.15、0.3、0.6、1.25和2.5ng/mL)的cTnI抗原(8T62，HyTest，Finland)。将100μL样品置于每个测试和对照试剂盒上，并夹有荧光(FSDTM 647，最大激发波长650nm，最大发射波长665nm，BioActs，Korea)聚合的cTnI特异性结合检测抗体(4T21clone19C7，HyTest，Finland)。使用激光二极管(650nm)通过激发光检测荧光信号，并使用配备有拦截低于660nm的波长的滤光片的光电二极管检测665nm发射荧光的读取器。
每个测试重复八次。通过对对照区域和测试线区域的面积进行积分，并将测试线区域的积分值转换为T/C比，获得了目标材料(cTnI)的浓度的标准曲线。使用由标准曲线获得的标准方程式，确定了平均值和标准偏差。然后将这些值用于计算CV(％)，并绘制浓度的CV图。参见图4。以指数形式绘制样品浓度的CV图中的趋势线，并计算出在CV10％下的浓度。确定了来自每个制造商的硝酸纤维素膜的定量改进效果。
对于其中不使用有机纳米结构分子固定捕获分子的对照硝酸纤维素膜，HF-135、Immuno-pore RP和CNPC的CV 10％浓度分别为2.81ng/mL、5.94ng/mL和1.73ng/mL。参见图4。对于固定有有机纳米结构分子的测试组膜，HF-135、Immuno-pore RP和CNPC的CV 10％浓度分别为0.96ng/mL、0.73ng/mL和0.24ng/mL。参见图4。
如图4所示，与对照硝酸纤维素膜相比，使用有机纳米结构分子固定捕获分子使定量分析的重现性提高了2.93至8.14倍。参见图4。
实施例2
该实施例证实了使用本发明的硝酸纤维素膜的目标材料的定量检测的重现性的提高。
在该实施例中，首先通过使用有机纳米结构分子的线性区域末端官能团将捕获分子共价连接到有机纳米结构分子来制备测试检测试剂盒。用于共价连接捕获分子的有机纳米结构分子的线性区域末端官能团是醛基或环氧基官能团。然后使用实施例1的方法将有机纳米结构分子非共价固定在硝酸纤维素膜上。进行与上述实施例类似的检测试验，以确定定量测试重现性方面的提高。
具有醛基线性区域末端官能团的有机纳米结构分子与捕获分子共价键合。简而言之，所使用的有机纳米结构分子的量是捕获分子的量的4.1倍。类似地，具有环氧基线性区域末端官能团的有机纳米结构分子与捕获分子共价键合。通过将有机纳米结构分子非共价固定到硝酸纤维素膜上来制备测试硝酸纤维素膜。还通过在不存在有机纳米结构分子的情况下将捕获分子直接连接到硝酸纤维素膜上来制备对照膜。
使用这些膜制备了侧流型试剂盒。如上所述制备人血清中各种浓度的cTnI抗原。对于每种测试试剂盒，放置100μL样品，并夹有荧光(FSDTM 647，最大激发波长650nm，最大发射波长665nm，BioActs，Korea)聚合的cTnI特异性结合检测抗体(4T21clone19C7，HyTest，Finland)。使用激光二极管(650nm)检测荧光信号，并使用配备了滤光片(拦截低于660nm的波长)的光电二极管检测665nm的发射荧光。每个硝酸纤维素膜重复该过程八次。
通过将对照和测试线区域的面积进行积分并将测试线面积积分值转换为T/C比，获得了目标材料(cTnI)的浓度的标准曲线。使用转化浓度的平均值和标准偏差计算CV(％)。参见图5。以指数形式绘制样品浓度的CV图的趋势线，并计算了在CV10％下的浓度。当使用具有醛基和环氧基线性区域末端官能团的有机纳米结构分子时，结果表明定量检测的可靠性得到提高。
对照硝酸纤维素膜、具有环氧基线性区域末端官能团的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜和具有醛基线性区域末端官能团的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜的CV 10％分别为1.90ng/mL、0.28ng/mL和0.27ng/mL。图5。这表明，无论有机纳米结构分子的线性区域末端官能团的类型如何，具有有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜都能改进定量分析。图5。
实施例3
该实施例确定了具有带正电荷(MW 657.07，C24H52Cl3N7O7)或带负电荷(MW762.93，C27H41K3N4O14)的有机纳米结构化合物的侧流型检测试剂盒的重现性的提高。
在分支区域末端具有负电荷的有机纳米结构分子(MW 762.93，C27H41K3N4O14)和具有正电荷的有机纳米结构分子(MR 657.07，C24H52Cl3N7O7)共价连接至捕获分子。简而言之，如上所述，使用cTnI抗体制备了4.1摩尔当量的具有环氧基线性区域末端官能团的有机纳米结构分子。还制备了对照硝酸纤维素膜，其中不使用有机纳米结构分子而将捕获分子直接连接到硝酸纤维素膜上。
使用这些膜制备了侧流型试剂盒。如上所述制备人血清中各种浓度的cTnI抗原。对于每个分析测试试剂盒，放置100μL样品，并夹有荧光(FSDTM647，最大激发波长650nm，最大发射波长665nm，BioActs，Korea)聚合的cTnI特异性结合检测抗体(4T21clone19C7，HyTest，Finland)。使用激光二极管(650nm)检测荧光信号，并使用配备了滤光片(拦截低于660nm的波长)的光电二极管检测665nm的发射荧光。每个硝酸纤维素膜重复该过程八次。
通过将对照和测试线区域的面积进行积分并将测试线面积积分值转换成T/C比，获得了目标材料(cTnI)的浓度的标准曲线。使用转化浓度的平均值和标准偏差计算CV(％)。参见图6。以指数形式绘制了样品浓度的CV图中的趋势线，并计算了在CV10％下的浓度。当使用具有正分支区末端和负分支区末端的有机纳米结构分子时，结果表明定量测试可靠性得到提高。
对照硝酸纤维素膜、具有负分支区域末端的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜和具有正分支区域末端的有机纳米结构分子的硝酸纤维素膜的CV10％分别为1.82ng/mL、0.29ng/mL和0.42ng/mL。图6。这相当于负分支区域末端有机纳米结构分子和正分支区域末端有机纳米结构分子的定量测试可靠性分别提高了6.26倍和4.33倍。可以看出，当有机纳米结构分子的分支区域末端带负电时，似乎获得了更好的定量提高。参见图6。
实施例4
在该实施例中，制备并测试了具有三个(MW 762.93，C27H41K3N4O14)和九个分支区域末端官能团(MW 1949.41，C66H98K9N7O38)的侧流型试剂盒。
如上所述进行了相应的检测测试试剂盒和检测测试。对照(组)、具有三个分支区域末端官能团的有机纳米结构分子和具有九个分支区域末端官能团的有机纳米结构分子的CV 10％浓度分别为1.97ng/mL、0.30ng/mL和0.36ng/mL。参见图7。与对照组相比，这相当于定量检测可靠性分别提高了6.57倍和5.47倍。图7。
实施例5
在该实施例中，测试试剂盒由两种不同的方法制备。第一种方法是顺序方法，其中将有机纳米结构分子首先连接到硝酸纤维素膜上，然后将捕获分子连接到有机纳米结构分子上。第二种方法是在将有机纳米结构分子固定到硝酸纤维素膜上之前，先将捕获分子与有机纳米结构分子共价连接。
在第一种方法中，将0.111mM(相当于捕获分子的4.1当量)的有机纳米结构分子(MW 762.93，C27H41K3N4O14)，以0.35μL/cm的分散速率分散到硝酸纤维素膜(CNPC，AdvancedMicrodevices，Inc.)上，形成一条线。将所得的硝酸纤维素膜在40℃下在10％或更低的相对湿度下干燥约10分钟，然后在60℃下在10％或更低的相对湿度下进一步干燥24小时。将cTnI特异性捕获抗体(0.027mM，0.35μL/cm分散速率)分散到相同位置，并在40℃和10％的相对湿度下干燥约10分钟，然后在60℃和10％或更低的相对湿度下进一步干燥24小时。
对于第二种方法，将0.111mol的有机纳米结构分子(FW 762.93，C27H41K3N4O14，相当于捕获分子的4.1摩尔当量)与捕获分子即cTnI抗体(0.027mM)混合。使混合物在37℃下搅拌反应3小时。将所得反应混合物以0.35μL/cm的分散速度分散到硝酸纤维素膜(CNPC，Advanced Microdevices，India)上，以形成一条线，并在40℃下在10％的相对湿度下干燥约10分钟。将该硝酸纤维素膜在60℃下在10％或更低的相对湿度下进一步干燥24小时。
使用通过上述两种方法制备的膜来制备侧流型检测试剂盒。并且如上所述进行检测。对照、通过第一方法制备的硝酸纤维素膜和通过第二方法制备的硝酸纤维素膜的CV10％浓度分别为1.75ng/mL、0.31ng/mL和0.29ng/mL。参见图8。与对照组相比，这相当于定量检测可靠性分别提高了5.65倍和6.03倍。图8。
为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的前述讨论。前述内容并非旨在将本发明限制为本文公开的一种或多种形式。尽管本发明的描述已经包括对一个或多个实施方案以及某些变型和修改的描述，但是在理解本公开之后，例如在本领域技术人员的技术和知识之内的其他变型和修改也在本发明的范围内。旨在获得在允许的范围内包括替代实施方案的权利，包括与所要求保护的那些结构、功能、范围或步骤的替代、互换和/或等效的结构、功能、范围或步骤，而不管这种替代、互换和/或等效的结构、功能、范围或步骤是否在此公开了，并且无意公开致力于任何可获专利的主题。本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文中。
