2氧化体系制备细菌纤维素纳米纤维的方法附图说明" src="/d/file/p/2020/12-01/bb9704d1cc8c0f122bcb1cf12cc73baf.gif" />
基于TEMPO/漆酶/O2氧化体系制备细菌纤维素纳米纤维的方法
技术领域
本发明属于生物材料的改性技术领域，涉及一种基于TEMPO/漆酶/O2氧化体系制备细菌纤维素纳米纤维的方法。
背景技术
细菌纤维素纳米纤维(BCN)具有低密度、高表面积、高机械性能和高分散性，可 以作为优异的增强材料。BCN通过水解或氧化纤维素生产，制得的纳米晶体具有不同 的尺寸和表面官能团。BCN的高纵横比和大表面积确保了其在非常低的添加含量下也 可以发挥较好的增强作用，在吸附材料、药物输送以及生物支架中的具有应用价值。
纤维素氧化反应不仅可以改变纤维素的结构，同时给予氧化后的纤维素许多新的物 理和化学特性，极大地拓展了纤维素材料的应用范围。利用氧化后纤维素中的醛基、羧基等具有反应活性基团，一方面可将纤维素与其他基团反应进而对纤维素进行功能改 性；另一方面可将氧化纤维素与其他功能材料复合，形成同时具有生物活性与功能化的 复合材料。
2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)是一种哌啶类氮氧自由基，具有捕获自由基、猝 灭单线态氧和选择性氧化等功能。研究表明，含TEMPO的氧化体系对伯羟基的选择性高，反应条件温和且反应过程简单，能够对多糖类高分子进行选择性氧化。传统的 TEMPO催化氧化方法一般选用次氯酸钠(NaClO)作为氧化剂，溴化钠(NaBr)作为氧化助 剂，氧化产物中残留有大量的卤离子，并且需要在较强的碱性环境下进行(pH10-11)，应 用受限(Tanaka R,Satio T,Isogai A.Cellulose nanofibrils prepared from softwoodcellulose by TEMPO/NaClO/NaClO2 systems in water at pH 4.8or 6.8[J].International Journal of Biological Macromolecules,2012,51:228-234)。
发明内容
针对现有纳米纤维的TEMPO催化氧化方法反应条件苛刻，且残余大量卤离子的问题，本发明提供一种氧化条件温和、氧化效率高的基于TEMPO/漆酶/O2氧化体系制备 细菌纤维素纳米纤维的方法。该方法采用硫酸铜为助催化剂，酸解细菌纤维素，有效调 控BCN结构，再引入TEMPO/漆酶/O2氧化体系对细菌纤维素进行改性，获得具有高羧 基含量的氧化BCN。
本发明的技术方案如下：
基于TEMPO/漆酶/O2氧化体系制备细菌纤维素纳米纤维的方法，具体步骤如下：
步骤1，按硫酸铜与细菌纤维素的质量比为0.04～0.1:1，将硫酸铜溶于50wt％的硫 酸溶液中，形成硫酸铜溶液，加入细菌纤维素，65±5℃下水解，水解完全后，加入NaOH溶液中和，离心，洗涤至中性得到细菌纤维素纳米纤维；
步骤2，TEMPO/漆酶/O2氧化BCN：
将细菌纤维素纳米纤维搅拌分散在pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，加入 TEMPO，通入氧气，加入漆酶，TEMPO浓度为30～70mM，漆酶的浓度为4～5UmL-1， 在60～70℃下进行氧化反应，反应完全后，乙醇和水依次洗涤至中性，得到氧化细菌纤 维素纳米纤维。
优选地，步骤1中，硫酸铜与细菌纤维素的质量比为0.06～0.08:1。
优选地，步骤2中，TEMPO浓度为30～50mM。
优选地，步骤2中，反应时间为30～80h，更优选为30～50h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明以硫酸铜为助催化剂，优化酸解体系制得具有高长径比的BCN材料，再利用TEMPO/漆酶/O2氧化体系在BCN表面引入大量的羧基基团，相比传统氧化体系，该 反应更加绿色环保且副产物少,氧化率高。
附图说明
图1为纤维素水解产物的(a)粒度及zeta电位，(b)产物得率随硫酸铜添加量变化曲 线。
图2为未处理的BC以及0％、3％、8％CuSO4添加量条件下水解细菌纤维素制得 BCN的TEM图。
图3为氧化BCN的TEM形貌图。
图4中(a)为BC、TEMPO/Lac氧化BC和TEMPO/NaClO氧化BC的红外图谱；(b) 为BC、TEMPO/Lac氧化BC和TEMPO/NaClO氧化BC的XRD图谱；(c)为BC和TEMPO 氧化BC的XPS图谱；(d)为BC和TEMPO氧化BC的热重图谱。
图5为不同TEMPO反应浓度条件下(a)以及不同漆酶反应浓度条件下(b)酶活性随反 应时间变化曲线图。
图6为(a)不同TEMPO反应浓度，(b)不同漆酶反应浓度以及(c)不同反应时间条件下，氧化所得羧基含量变化曲线图。
图7为氧化BCN的DPv随羧酸盐与醛含量变化的关系图。
图8为TEMPO/漆酶氧化体系中不同形态的TEMPO吸光度的变化图。
图9为TEMPO/Laccase/O2体系氧化BCN反应机理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
将活化的木醋杆菌斜面菌种接入灭菌并冷却的种子培养液中，在29℃、150r·min-1条件下培养36小时后，按8％接种量接种于灭菌的发酵培养基中，轻轻摇荡，使种子液均匀分散在培养基，然后分装，放入培养箱29℃、150r·min-1振荡培养6天，得到动态 摇瓶发酵BC。用0.1M氢氧化钠溶液在80℃处理BC 2小时以除去残留菌体，去离子水 冲洗数次至中性。在50wt％硫酸溶液中加入硫酸铜固体配制硫酸铜溶液。分别按硫酸铜 与细菌纤维素的质量比为0～0.15:1，将硫酸铜溶液加入到细菌纤维素中，65℃下水解 24h。向反应液中滴加30％的NaOH溶液中和反应，然后离心并用去离子水冲洗BCN沉 淀物，反复冲洗，透析样品直至达到中性pH。
图1为纤维素水解产物的(a)粒度及zeta电位，(b)产物得率随硫酸铜添加量变化曲 线。由图1(a)可以看出当CuSO4用量为6％左右时，所得的纳米纤维素悬浊液比较稳 定。(b)中产物得率随CuSO4用量的变化曲线可以看出，产物得率均在45％以上，高于 植物纤维素的水解产率。
图2为未处理的BC以及0％、3％、8％CuSO4添加量条件下水解细菌纤维素制得 BCN的TEM图。结果表明，当CuSO4用量为8％时，得到了长度在300nm左右，具有 高均匀度和高分散性的BCN水溶液。
实施例2
将活化的木醋杆菌斜面菌种接入灭菌并冷却的种子培养液中，在29℃、150r·min-1条件下培养36小时后，按8％接种量接种于灭菌的发酵培养基中，轻轻摇荡，使种子液均匀分散在培养基，然后分装，放入培养箱29℃、150r·min-1振荡培养6天，得到动态 摇瓶发酵BC。用0.1M氢氧化钠溶液在80℃处理BC 2小时以除去残留菌体，用去离子 水冲洗数次至中性。在50wt％硫酸溶液中加入硫酸铜固体配制硫酸铜溶液。按硫酸铜与 细菌纤维素的质量比为0.06:1，将硫酸铜溶液加入到细菌纤维素中，65℃下水解24小时。 向反应液中滴加30％的NaOH溶液中和反应，然后离心并用去离子水冲洗BCN沉淀物， 反复冲洗，透析样品直至达到中性pH。将得到的浆液配制成0.5g·mL-1的BCN悬浮液， 储存在4℃冰箱中待用。
将3g BCN加入pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，用玻璃棒在烧杯中捣碎使分散均匀，然后转入固定在恒温水浴槽中的三口瓶中，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶 液冲洗，补充缓冲溶液使得反应液的浓度达到1.2％。分别加入10～70mM的TEMPO， 搅拌使得TEMPO全部溶解，同时打开充氧气泵通入氧气，待水浴槽中温度恒定为65℃， 加入漆酶，漆酶的浓度为5UmL-1，进行氧化反应，反应48h，乙醇和水依次洗涤至中性， 得到氧化细菌纤维素纳米纤维。
由图5(a)可以看出，纤维素的添加与否对漆酶活性的影响差别不大。图5(b) 为在氧化过程中漆酶活性随TEMPO浓度变化的情况，其中漆酶固定浓度为5UmL-1， TEMPO浓度为10mM～70mM。结果表明TEMPO的浓度是影响漆酶活性的主要因素， 并且随着TEMPO浓度的增大，漆酶活性逐渐降低。TEMPO的浓度为30～70mM时，漆 酶活性较高，TEMPO的浓度为50mM时，漆酶活性最高。图5(c)结果表明，即使成 倍数的提高反应中漆酶的反应浓度，酶活降低量在8h后都接近10％以下水平，说明在 混合体系中形成TEMPO+分子会降解漆酶活性。
实施例3
将活化的木醋杆菌斜面菌种接入灭菌并冷却的种子培养液中，在29℃、150r·min-1条件下培养36小时后，按8％接种量接种于灭菌的发酵培养基中，轻轻摇荡，使种子液均匀分散在培养基，然后分装，放入培养箱29℃、150r·min-1振荡培养6天，得到动态 摇瓶发酵BC。用0.1M氢氧化钠溶液在80℃处理BC 2小时以除去残留菌体，用去离子 水冲洗数次至中性。在50wt％硫酸溶液中加入硫酸铜固体配制硫酸铜溶液。按硫酸铜与 细菌纤维素的质量比为0.06:1，将硫酸铜溶液加入到细菌纤维素中，65℃下水解24小时。 向反应液中滴加30％的NaOH溶液中和反应，然后离心并用去离子水冲洗BCN沉淀物， 反复冲洗，透析样品直至达到中性pH。将得到的浆液配制成0.5g·mL-1的BCN悬浮液， 储存在4℃冰箱中待用。
将3gBCN加入pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，用玻璃棒在烧杯中捣碎使分散均匀，然后转入固定在恒温水浴槽中的三口瓶中，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶 液冲洗，然后补充缓冲溶液使得反应液的浓度达到1.2％。加入TEMPO，搅拌使其全部 溶解，TEMPO的浓度为50mM，同时打开充氧气泵，通入氧气，待水浴槽中温度恒定 为65℃，加入漆酶，分别使得漆酶的浓度为4.0～8.5UmL-1，进行氧化反应，反应48h， 乙醇和水依次洗涤至中性，得到氧化细菌纤维素纳米纤维。
由图6(a)表明TEMPO浓度为70mM，有利于氧化纤维素中有效的羧酸盐基团的 形成。图6(b)为不同漆酶反应浓度下，氧化所得羧基含量变化曲线图。当TEMPO浓度 和反应时间分别固定在50mM和48h，漆酶浓度范围从4.0U·mL-1变化到8.5U·mL-1， 氧化纤维素的羧酸盐含量几乎是恒定在0.55mmol·g-1，表明最佳的漆酶浓度为 4～5UmL-1。随着漆酶用量的增加，氧化纤维素中羧基含量呈现先增大后降低的变化趋势。 同时，漆酶用量的增加会导致反应速率加快，当漆酶过量时反应速率趋于稳定。
实施例4
将活化的木醋杆菌斜面菌种接入灭菌并冷却的种子培养液中，在29℃、150r·min-1条件下培养36小时后，按8％接种量接种于灭菌的发酵培养基中，轻轻摇荡，使种子液均匀分散在培养基，然后分装，放入培养箱29℃、150r·min-1振荡培养6天，得到动态 摇瓶发酵BC。用0.1M氢氧化钠溶液在80℃处理BC 2小时以除去残留菌体，用去离子 水冲洗数次至中性。在50wt％硫酸溶液中加入硫酸铜固体配制硫酸铜溶液。按硫酸铜与 细菌纤维素的质量比为0.06:1，将硫酸铜溶液加入到细菌纤维素中，65℃下水解24小时。 向反应液中滴加30％的NaOH溶液中和反应，然后离心并用去离子水冲洗BCN沉淀物， 反复冲洗，透析样品直至达到中性pH。将得到的浆液配制成0.5g·mL-1的BCN悬浮液， 储存在4℃冰箱中待用。
将3gBCN加入pH＝4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，用玻璃棒在烧杯中捣碎使分散均匀，然后转入固定在恒温水浴槽中的三口瓶中，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液 冲洗，然后补充缓冲溶液使得反应液的浓度达到1.2％。加入TEMPO，搅拌使其全部溶 解，TEMPO的浓度为50mM，同时打开充氧气泵，通入氧气，待水浴槽中温度恒定为 65℃，加入漆酶，漆酶浓度为5U·mL-1，分别反应0～80小时。
图6(c)为不同反应时间条件下，氧化所得羧基含量变化曲线图。TEMPO和漆酶的浓度为分别固定在50mM和5U·mL-1，反应时间延长至80h，羧酸盐含量增加至0.62 mmol·g-1。表明增大反应时间能够提高BC的氧化得率。TEMPO/漆酶氧化初期，纤维 表面暴露的伯羟基可被快速氧化，随着反应时间的延长，反应逐渐向纤维内部扩散，因 纤维素间较强的氢键作用，每种反应物都需要克服更大的空间位阻，导致氧化速率降低。 根据图6的结果，最佳氧化反应条件为：TEMPO浓度为50mM，漆酶浓度为5U·mL-1， 反应时间为30h。
图3为氧化BCN的TEM形貌图。纯BC絮易出现堆叠和团聚的现象，氧化后由于 羧基官能团的引入，其分散性明显提升，得到纤维的长度约为300～600nm，直径在20nm 左右。
图4中(a)为BC、TEMPO/Lac氧化BC和TEMPO/NaClO氧化BC的红外图谱；(b) 为BC、TEMPO/Lac氧化BC和TEMPO/NaClO氧化BC的XRD图谱；(c)为BC和TEMPO 氧化BC的XPS图谱；(d)为BC和TEMPO氧化BC的热重图谱。图4(a)中，红外光 谱在1636cm-1处都出现了羧基官能团中的-C＝O峰，验证了氧化的可行性；(b)中，XRD 图谱表明TEMPO/漆酶氧化主要发生在无定型区或结晶区的表面，并不会对内部的结晶 区造成影响；(c)中，XPS图谱表明样品分子的化学结构越稳定；(d)中，表明纯BC样 品和氧化后BC样品的热解过程均分为3个阶段。氧化纤维素的热分解过程很大程度上 受到羧基含量的影响。
图7为氧化BCN的DPv随羧酸盐与醛含量变化的关系图。由图7可以看出，氧化 产率的增大对应着平均聚合度的下降。
图8为TEMPO/漆酶氧化体系中不同形态的TEMPO吸光度的变化图，表明反应过 程中存在还原态TEMPO和氮碳基阳离子。
图9为TEMPO/Laccase/O2体系氧化BCN反应机理示意图，表明TEMPO-Lac体系 选择性氧化纤维素C-6伯羟基的反应过程主要分为四个阶段：(1)Laccase与TEMPO在 反应初期以自由基形式反应生成Laccaseox和TEMPO+亚硝基形式；(2)生成的TEMPO+将纤维素上的C-6伯羟基氧化成醛基，进一步氧化成羧基，之后被还原成TEMPOH羟 胺形式；(3)TEMPOH与Laccase反应重新生成TEMPO自由基；(4)Laccaseox与O2反应 生成水和Laccase，从而进入下一轮反应循环。
