一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法
技术领域
本发明涉及天然产物制备技术领域，尤其是，本发明涉及一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法。
背景技术
硫酸乙酰肝素（HS）是线型的且带强电荷，高度硫酸化的糖胺聚糖，广泛存在于生物体的细胞表面和细胞外基质中，它与血管的生成，炎症的发生，病毒入侵和脑组织损伤等疾病都有着密切的关系，在生物体内扮演着重要的生物学与病理生理学角色。对生物体内HS寡糖结构功能的研究在疾病治疗及新糖类药物开发方面都有重要的意义。迄今为止，很少有报道阐述生物体内HS寡糖的结构，因为采用分离手段从生物材料中直接获取组分均一、结构明确的糖链非常困难。因此，制备结构多样的HS寡糖对深入理解HS结构与功能的关系有重要的意义。
据以往的文献报道，HS寡糖的制备多采用酶解法，化学修饰和合成的方法，但制备的寡糖结构种类少、较单一。化学修饰的方法步骤繁多，不易操作，多采用改变溶剂的极性，选择性地脱除肝素长链上不同位置上的硫酸基团，从而获得目标产物。同样化学合成方法存在类似问题，且制备的寡糖结构和生物体内合成的HS寡糖差异较大。酶解方法由于价格昂贵并且酶解过程中生成的HS寡糖难以分离，并且由于肝素酶对底物作用具有的特异性和持续性，导致原材料利用率低，寡糖得率少。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法，包括以下步骤：
向搅拌式过滤装置中加入Tris-HCL缓冲液、硫酸乙酰肝素、肝素酶I进行第一超滤反应，收集第一反应滤液；
对所述第一反应滤液进行冷冻干燥，获得第一硫酸乙酰肝素寡糖产品。
优选地，还包括以下步骤：
所述第一超滤反应结束后，向所述搅拌式过滤装置中再次加入Tris-HCL缓冲液、肝素酶I进行第二超滤反应，收集第二反应滤液；
对所述第二反应滤液进行冷冻干燥，获得第二硫酸乙酰肝素寡糖产品。
优选地，还包括以下步骤：
所述第二超滤反应结束后，向所述搅拌式过滤装置中再次加入Tris-HCL缓冲液、肝素酶I进行第三超滤反应，收集第三反应滤液；
对所述第三反应滤液进行冷冻干燥，获得第三硫酸乙酰肝素寡糖产品。
优选地，所述搅拌式过滤装置中超滤膜的孔径为3000 D-10000 D。
优选地，所述第一超滤反应的反应时间为1h~3h，反应温度为36℃~40℃。
优选地，所述第二超滤反应的反应时间为1h~3h，反应温度为36℃~40℃。
优选地，所述第三超滤反应的反应时间为1h~3h，反应温度为36℃~40℃。
优选地，还包括以下步骤：所述第三超滤反应结束后，向所述搅拌式过滤装置中的超滤膜截留部分产物中加入超纯水水洗，收集水洗产物并进行冷冻干燥，获得第四硫酸乙酰肝素寡糖产品。
与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
本发明的一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法以硫酸乙酰肝素为原料，结合肝素酶I的底物特异性，建立了一种以超滤为手段的多级制备硫酸乙酰肝素寡糖的新方法。本发明的制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法将制备反应与超滤相结合，实现制备反应与超滤同时进行，利用这一动态反应方法可以制备系列不同结构的硫酸乙酰肝素寡糖，使得硫酸乙酰肝素寡糖产品中寡糖的结构种类更丰富；且该制备方法操作简便，解决了传统化学裂解法和酶解法制备的HS寡糖种类少、结构单一 、原材料利用率低的难题，并且成功解决了肝素/硫酸乙酰肝素（Hep/HS）酶解过程中生成的硫酸乙酰肝素寡糖难以分离的难题，为制备系列不同结构的硫酸乙酰肝素寡糖提供一种崭新高效高回收率的方法，成功地制备并富集了结构多样且具有生物学活性的Hep/HS稀有结构寡糖，进而为研究Hep/HS结构与功能的关系提供重要的样品糖库。
附图说明
图1为本发明实施例提供的聚丙烯酰胺凝胶色谱柱（Bio-Gel P-10）分离HS寡糖色谱图；
图2为图1中的分离罐内样HS寡糖色谱图的放大图。
图中，A—第一硫酸乙酰肝素寡糖产品，B—第二硫酸乙酰肝素寡糖产品，C—第三硫酸乙酰肝素寡糖产品，D—第四硫酸乙酰肝素寡糖产品。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本发明提供一种运用超滤技术，动态多级制备系列不同结构的硫酸乙酰肝素（HS）寡糖的方法。该方法以猪肠来源的硫酸乙酰肝素为原材料，利用肝素酶I的底物特异性，结合超滤技术控制酶解反应，制备了系列不同结构的HS寡糖。最后通过凝胶色谱法分离收集不同聚合度和结构的HS寡糖，去除流动相中的NH4HCO3，得到系列不同结构的HS二糖、四糖、六糖、八糖和十糖。
近几年来制备HS/Hep寡糖的方法时有报道，但未见利用超滤技术动态多级制备系列不同结构的HS寡糖，这为HS寡糖在药物、临床医学研究中的广泛使用提供一个崭新高效高回收率的制备方法，因此本发明在制备方法上具有原始创新性。
本发明实施例提供一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法，包括以下步骤：
（1）向搅拌式过滤装置中加入Tris-HCL缓冲液、硫酸乙酰肝素、肝素酶I进行第一超滤反应，收集第一反应滤液；第一超滤反应结束后，为了使得反应液更快的滤出，可以采用氮气加压的方式使得搅拌式过滤装置中的反应液快速滤出，一般控制反应液以100uL/min~200 uL/min的流速全部滤出；优选地，第一超滤反应的反应时间为1h~3h，反应温度为36℃~40℃。
（2）对第一反应滤液进行冷冻干燥，获得第一硫酸乙酰肝素寡糖产品。
本发明的一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法将制备反应与超滤相结合，实现制备反应与超滤同时进行，利用这一动态反应方法可以制备系列不同结构的硫酸乙酰肝素寡糖，使得硫酸乙酰肝素寡糖产品中寡糖的结构种类更丰富。
优选地，本发明实施例的一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法还包括以下步骤：
（3）第一超滤反应结束后，向搅拌式过滤装置中再次加入Tris-HCL缓冲液、肝素酶I进行第二超滤反应，收集第二反应滤液；第二超滤反应结束后，为了使得反应液更快的滤出，可以采用氮气加压的方式使得搅拌式过滤装置中的反应液快速滤出，一般控制反应液以100uL/min~200 uL/min的流速全部滤出；优选地，第二超滤反应的反应时间为1h~3h，反应温度为36℃~40℃。
（4）对第二反应滤液进行冷冻干燥，获得第二硫酸乙酰肝素寡糖产品。
更优选地，本发明实施例的一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法还包括以下步骤：
（5）第二超滤反应结束后，向搅拌式过滤装置中再次加入Tris-HCL缓冲液、肝素酶I进行第三超滤反应，收集第三反应滤液；第三超滤反应结束后，为了使得反应液更快的滤出，可以采用氮气加压的方式使得搅拌式过滤装置中的反应液快速滤出，一般控制反应液以100uL/min~200 uL/min的流速全部滤出；优选地，第三超滤反应的反应时间为1h~3h，反应温度为36℃~40℃。
（6）对第三反应滤液进行冷冻干燥，获得第三硫酸乙酰肝素寡糖产品。
由于肝素酶I对反应底物硫酸乙酰肝素具有反应特异性，且肝素酶I在反应温度36℃~40℃下反应一段时间后，肝素酶I的酶活性会下降，进而导致对反应底物硫酸乙酰肝素的利用率降低。因此，本发明实施例优选地，在进行第一超滤反应后，向反应底物硫酸乙酰肝素中继续添加Tris-HCL缓冲液、肝素酶I进行第二超滤反应，甚至继续进行第三超滤反应，一方面可以制备系列不同结构的HS寡糖，另一方面可以同时提高对反应底物硫酸乙酰肝素的利用率。在反应底物硫酸乙酰肝素供应充足的境况下，可以进行多次的超滤反应。
优选地，本发明实施例的搅拌式过滤装置中超滤膜的孔径为3000 D-10000 D。超滤作用机理主要是通过物理筛分作用和静电作用，在一定的压力下，不同分子量的物质流过膜表面时，小分子物质穿过一定孔径的特制薄膜被收集下来，而大分子溶质被截留，实现不同分子量物质的分离和浓缩。选用不孔径的超滤膜可以获得系列不同结构的HS寡糖。
在第三超滤反应结束后，还可以向搅拌式过滤装置中的超滤膜截留部分产物中加入超纯水水洗，收集水洗产物并进行冷冻干燥，获得第四硫酸乙酰肝素寡糖产品。
最后，采用凝胶色谱法分别对上述各个步骤制备的硫酸乙酰肝素寡糖寡糖产品进行分离收集，后经除流动相、冷冻干燥，得到不同聚合度的HS寡糖，并采用强阴离子交换高效液相色谱法对其进行二糖组分分析鉴定。
本发明实施例的一种制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法以硫酸乙酰肝素为原料，结合肝素酶I的底物特异性，建立了一种以超滤为手段的多级制备硫酸乙酰肝素寡糖的新方法。本发明的制备硫酸乙酰肝素寡糖的方法将制备反应与超滤相结合，实现制备反应与超滤同时进行，利用这一动态反应方法可以制备系列不同结构的硫酸乙酰肝素寡糖，使得硫酸乙酰肝素寡糖产品中寡糖的结构种类更丰富；且该制备方法操作简便，解决了传统化学裂解法和酶解法制备的HS寡糖种类少、结构单一 、原材料利用率低的难题，并且成功解决了肝素/硫酸乙酰肝素（Hep/HS）酶解过程中生成的硫酸乙酰肝素寡糖难以分离的难题，为制备系列不同结构的硫酸乙酰肝素寡糖提供一种崭新高效高回收率的方法，成功地制备并富集了结构多样且具有生物学活性的Hep/HS稀有结构寡糖，进而为研究Hep/HS结构与功能的关系提供重要的样品糖库。
下面结合一个具体实施例做进一步说明。
1、第一超滤反应：
选取孔径5000 D的聚醚砜膜，取市售猪肠来源的HS 200 mg 置于搅拌式过滤装置（超滤罐）中，加入10 mL Tris-HCl缓冲液（20 mmol /L TRIS和5 mmol /L氯化钙，HCl调pH7.40，使用之前应保持37℃左右恒温），搅拌溶解，同时加入40 mIU肝素酶于40 ℃烘箱中缓慢搅拌（烘箱半敞开，实测温度为36-37℃），反应2 h后，接着用氮气加压的方法，使罐内反应液以150 uL/min的流速全部滤出，收集滤液，-80 ℃冷冻干燥6 h，得到第一硫酸乙酰肝素寡糖产品。
2、第二超滤反应：
第一次超滤反应结束后，往超滤罐内加40 mIU肝素酶I和10 mL酶解缓冲液，在40 ℃环境下进行超滤反应2 h。反应结束后用氮气加压的方法使罐内反应液以150 uL/min的流速全部滤出，收集滤液，-80 ℃冷冻干燥6 h，得到第一硫酸乙酰肝素寡糖产品。
3、第三超滤反应：
第二次超滤反应结束后，往超滤罐内加40 mIU肝素酶I和10 mL酶解缓冲液，在40 ℃环境下进行超滤反应2 h。反应结束后用氮气加压的方法使罐内反应液以150 uL/min的流速全部滤出，收集滤液，-80 ℃冷冻干燥6 h，得到第三硫酸乙酰肝素寡糖产品。
4、超滤罐内肝素酶反应产物：
第三次超滤反应结束后，超滤罐内的肝素酶I反应产物直接用10 mL超纯水洗出，洗三次，合并洗脱液，-80 ℃冷冻干燥6 h，得到第四硫酸乙酰肝素寡糖产品。
5、硫酸乙酰肝素（HS）四糖、六糖、八糖和十糖的的分离收集：
上述步骤1、2、3、4制备的HS寡糖产品分别用凝胶色谱层析柱（Bio-Gel P-10）进行分离和收集。样品预处理：1 mL超纯水搅拌溶解，再加入1.5 mL 0.2 M NH4HCO3混合，12000 r／min离心10 min，取上清液。Bio-Gel P-10具体参数：流动相为0.2 NH4HCO3，洗脱速度为17mL/h，UV 232 nm检测，数控计滴自动收集器收集，合并各个HS寡糖对应的色谱峰。放55 ℃烘箱72 h去除NH4HCO3，得到HS四糖（dp4），六糖（dp6），八糖（dp8）和十糖（dp10）结果见附图1、附图2。
6、硫酸乙酰肝素（HS）寡糖二糖组分分析：
取上述步骤5收集的dp4、dp6、dp8和dp10各50 ug分别溶解于100 uL醋酸钠缓冲液（0.1mol/L醋酸钠、0.1 mmol/L醋酸钙和100 ug/mL牛血清蛋白，醋酸调pH 7.0），随后都加入4mIU肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，37 ℃水浴反应24 h后100 ℃灭活5 min终止反应，离心浓缩。浓缩产物用20 uL超纯水溶解直接强阴离子高效液相色谱（SAX-HPLC）分析，具体参数如下：色谱柱：ProPac PA1（4×250 mm），流速: 1 mL/min，上样量：≤100 ug，流动相：A为 pH 3.5 H2O，B为pH 3.5 2M NaCl，柱温：室温，检测器：UV检测器，检测波长：232 nm，梯度洗脱：0~0.5MNaCl （2.1-35.1 min），0.5 ~1.0M NaCl（35.1-57.1 min)。
检测图谱和标样二糖图谱比对，确定各个寡糖的二糖组分。根据检测图谱二糖峰面积进行二糖组分分析。制备的HS dp4、dp6、dp8和dp10二糖组分分析结果分别见下表1，表2，表3和表4。从表中可以看出，运用超滤技术制备的HS寡糖糖链越长，其二糖组分和肝素标样的二糖组分差别越大，表明制备的HS寡糖结构差异越大。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
