一种微生物矿化增强水凝胶的方法
技术领域
本发明涉及一种微生物矿化增强水凝胶的方法，属于水凝胶制备领域。
背景技术
水凝胶是具有三维网络结构的亲水性材料。形状一定、性质柔软，可以吸收大量的水，由于其生物相容性很好，因此水凝胶最初广泛应用于医药领域，如：药物传输释放、组织工程等；而今，由于其具备的高吸水高保水性，其应用早已扩大到生活用品、工农业保水除尘等多个领域。相应的，不同领域使用的凝胶基材也不尽相同，大体可分为天然和合成两大类，其中天然凝胶生物相容性好、价格较低，但是稳定性较差，易于降解；而合成凝胶的结构、性能可调控。但是水凝胶也存在着它的劣势——机械性能差，因此限制了其应用，尤其是组织工程。
目前已有一些凝胶增强的方式，主要有：双网络水凝胶、纳米复合水凝胶以及大分子微球水凝胶。双网络一般是将一个刚性网络与一个柔性网络复合从而可以赋予凝胶一定的自修复性能，但是对第一网络要求较高，如今通过研究改进了这一劣势，但是使用的化学结合剂大多存在毒性，降低基体的生物相容性；纳米复合一般是有机-无机复合，可以通过改变复配纳米粒子种类赋予凝胶特殊的性能，如：Ag+抗菌，但是这类无机纳米粒子在凝胶中易出现团聚现象从而对强度产生负面影响，而且对引发剂的要求相对较高；大分子微球凝胶可以很好的实现应力分散的作用，因此常用于压缩强度的提升，但是相应的对拉伸强度的效果较差。
因此，对于凝胶性能增强的方法还有很多地方值得深入研究及改进的，而本发明便是基于双网络以及纳米复合技术提出的一种微生物矿化的方式在凝胶内部生成细小、均匀的碳酸钙网络，实现凝胶增强的目的。
发明内容
技术问题：本发明主要针对水凝胶自身力学性能较差导致的应用局限性这一劣势进行改进，提出一种微生物矿化增强水凝胶的方法，该方法主要是依附于凝胶支架生长出一层碳酸钙层从而实现增强的目的；相较于传统的纳米复合凝胶，对凝胶基体的均一性影响较小，对大多数凝胶基体均存在可操作性，此外，还可以通过这种方式赋予凝胶一定的自愈合性能，因此具有较好的社会价值。
技术方案：本发明提供了一种微生物矿化增强水凝胶的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
1)脲酶菌菌液的培养以及浓缩菌液的制备；
2)配制均一透明的凝胶基体溶液，之后加入尿素及氯化钙搅拌均匀，室温下加入浓缩菌液搅拌均匀得到混合液；
3)将混合液真空抽滤除泡后模具成型，冻融循环后置于室温下反应，得到微生物矿化增强的水凝胶。
其中：
步骤1)所述的浓缩菌液的浓度为(1～10)×109cell/mL，OD600值为1.8～2，通过脲酶菌菌液在7000～10000rpm转速条件下离心8～15min得到。
步骤2)所述的均一透明的凝胶基体溶液为聚乙烯醇(PVA)溶液或者聚乙烯醇-单宁酸(PVA-TA)溶液。
当凝胶基体溶液为聚乙烯醇溶液时，步骤2)所述的混合液中聚乙烯醇的浓度为4wt％～10wt％；当凝胶基体溶液为聚乙烯醇-单宁酸溶液时，步骤2)所述的混合液中聚乙烯醇浓度为4wt％～10wt％、单宁酸为聚乙烯醇浓度的5wt％～20wt％。
步骤2)所述的混合液中尿素和钙离子的浓度均为0.5～1.5M，且二者的浓度比为1:1～3:1，浓缩菌液的掺入量按照体积百分数为混合液的5％～30％。
步骤3)所述的将混合液真空抽滤除泡后模具成型是指将其抽真空至0.1±0.02MPa除泡5～10min，重复2～4次后模具成型，其中使用的模具尺寸为90mm×10mm×3mm。
步骤3)所述的冻融循环是指-18±2℃冷冻16～20h后室温融化4～8h，交替循环3～5次。
步骤3)所述的冻融循环后置于室温下反应中，是指在室温下发生矿化沉积作用，反应时长为3～7d。
上述制备过程中加入了脲酶菌浓缩菌液及其代谢所需的营养物质以及钙源，凝胶富有水可以刺激脲酶菌活性，从而实现完整的微生物矿化沉积作用，在凝胶内部原位生成微小碳酸钙沉积实现凝胶增强的效果。
有益效果：本发明提供了一项利用生物矿化增强凝胶的技术，可以拓宽凝胶的应用场景，该方法不仅能应用于大多数凝胶基体的矿化增强，且具有制备工艺简单、环境友好的优点，因此具有较好的经济和社会效益。与现有技术相比，该技术具有以下优点：
1、本发明以微生物矿化作为凝胶的增强机制；
2、本发明中采用传统无机材料对有机材料进行内部结构增强，使其性能更好；
3、本发明中采用的微生物矿化增强机制所使用的试剂均无毒无害，基本符合环境友好、绿色发展理念。
附图说明
图1为实施例1、2、3制备得到的水凝胶的XRD表征；
图2为实施例1制备得到的水凝胶SEM表征(1000×)；
图3为实施例2制备得到的水凝胶SEM表征(4000×)；
图4为实施例1和实施例2制备得到的水凝胶的FTIR表征。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面对本发明作进一步说明，但不能理解为本发明仅适用于下面实例，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1(空白组凝胶1)
一种水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)1.8g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌2h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后将1.8g尿素、3.33g氯化钙溶解于PVA溶液中，冷却至室温得到混合液，其中PVA的浓度为6wt％，尿素、氯化钙浓度均为1M；
(2)将混合液在0.1MPa真空抽滤7min、3次，除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-18℃冷冻20h后室温融化4h，交替循环3次，得到所述的空白组凝胶。
将得到的空白组凝胶1置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，凝胶拉伸性能为0.43MPa。
实施例2
一种微生物矿化增强水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)脲酶菌培养所使用的培养基为0.13M Tris buffer、10g/L(NH4)2SO4、20g/L酵母提取物，120℃下灭菌25min后降温至室温，1％体积接种原始菌液，摇床200rpm、30℃培养24h得到培养成熟的菌液；而后8000rpm高速离心12min得到浓缩菌液，菌液浓度调至5×109cell/mL，OD600值为1.9；
(2)1.8g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌3h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后将1.8g尿素、3.33g氯化钙溶解于PVA溶液中，冷却至室温，加入3mL浓缩菌液并采用磁力搅拌器搅拌30min使之均匀分散得到混合液，最终混合液中PVA浓度为6wt％，尿素和氯化钙的浓度均为1M，浓缩菌液掺量为10％；
(3)将混合液在0.1MPa真空抽滤7min、3次除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-18℃冷冻20h后室温融化4h，交替循环3次，得到所述的微生物矿化增强的水凝胶。
相较实施例1，仅掺入了10％浓缩菌液，制得的微生物矿化增强的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，掺入微生物组的拉伸强度为0.56MPa。
实施例3
相较于实施例2，仅改变菌液掺量至5％，即浓缩菌液掺量为1.5mL。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.51MPa。
实施例4
相较于实施例2，仅改变菌液掺量至20％，即浓缩菌液掺量为6mL。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.53MPa。
实施例5
相较于实施例2，仅改变菌液掺量至30％，即浓缩菌液掺量为9mL。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.45MPa。
实施例6
相较于实施例2，仅改变PVA浓度，即使混合液中PVA浓度为8％。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.61MPa。
实施例7
相较于实施例2，仅改变尿素及钙离子掺量，即掺加2.7g尿素、1.665g氯化钙，最终混合液中二者浓度分别为1.5M和0.5M。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.53MPa。
实施例8(空白组凝胶2)
一种水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)1.8g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌4h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后降温至60℃温度平衡半小时；同时制备单宁酸(TA)溶液，0.18g TA超声分散于4mL去离子水中；将制备好的TA溶液用胶头滴管缓慢滴入PVA溶液中，剧烈搅拌半小时，使其形成均一溶液即聚乙烯醇-单宁酸溶液；将1.8g尿素、3.33g氯化钙溶解于PVA-TA溶液中，完全溶解后静置降温至室温得到混合液，混合液中PVA浓度为6wt％，TA为PVA浓度的10wt％，尿素及钙浓度均为1M；
(2)将混合液在0.1MPa真空抽滤7min、3次除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-18℃冷冻20h后室温融化4h，交替循环3次，得到所述的空白组凝胶2。
将得到的空白组凝胶2置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，空白组凝胶2的拉伸强度为0.45MPa。
实施例9
一种微生物矿化增强水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)脲酶菌培养所使用的培养基为0.13M Tris buffer、10g/L(NH4)2SO4、20g/L酵母提取物，120℃下灭菌25min后降温至室温，1％体积接种原始菌液，摇床200rpm、30℃培养24h得到培养成熟的菌液；而后8000rpm高速离心12min得到浓缩菌液，菌液浓度调至5×109cell/mL,OD600值为1.9；
(2)1.8g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌5h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后降温至60℃温度平衡半小时；同时制备单宁酸(TA)溶液，0.18g TA超声分散于4mL去离子水中；将制备好的TA溶液用胶头滴管缓慢滴入PVA溶液中，剧烈搅拌半小时，使其形成均一溶液即聚乙烯醇-单宁酸溶液；将1.8g尿素、3.33g氯化钙溶解于PVA-TA溶液中，完全溶解后室温静置降温至30～40℃以后，加入3mL浓缩菌液并采用磁力搅拌器搅拌30min使之均匀分散得到混合液，混合液中PVA浓度为6wt％，TA为PVA浓度的10wt％，尿素和氯化钙的浓度均为1M，浓缩菌液掺量为10％；
(3)将混合液在0.1MPa真空抽滤7min、3次除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-18℃冷冻20h后室温融化4h，交替循环3次，得到所述的微生物矿化增强的水凝胶。
相较实施例8，仅添加10％浓缩菌液，制得的微生物矿化增强的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，掺入微生物组的拉伸强度为0.59MPa。
实施例10
相较于实施例9，仅改变菌液掺量至30％，即浓缩菌液掺量为9mL。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.46MPa。
实施例11
相较于实施例9，仅改变菌液掺量至5％，即浓缩菌液掺量为1.5mL。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.52MPa。
实施例12
相较于实施例9，仅改变菌液掺量至20％，即浓缩菌液掺量为6mL。将制得的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，试样拉伸强度为0.55MPa。
实施例13
一种微生物矿化增强水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)脲酶菌培养所使用的培养基为0.13M Tris buffer、10g/L(NH4)2SO4、20g/L酵母提取物，120℃下灭菌25min后降温至室温，1％体积接种原始菌液，摇床200rpm、30℃培养24h得到培养成熟的菌液；而后10000rpm高速离心8min得到浓缩菌液，菌液浓度调至1×109cell/mL，OD600值为1.8；
(2)1.2g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌2h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后将0.9g尿素、1.665g氯化钙溶解于PVA溶液中，完全溶解后静置至室温，加入3mL浓缩菌液并采用磁力搅拌器搅拌30min使之均匀分散得到混合液，混合液中PVA浓度为4wt％，尿素和氯化钙的浓度均为0.5M，浓缩菌液掺量为10％；
(3)将混合液在0.12MPa真空抽滤5min、2次，除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-20℃冷冻16h后室温融化8h，交替循环4次，得到所述的微生物矿化增强的水凝胶。
将得到的微生物矿化增强的水凝胶置于室温反应7d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，掺入微生物组的拉伸强度为0.46MPa。
实施例14
一种微生物矿化增强水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)脲酶菌培养所使用的培养基为0.13M Tris buffer、10g/L(NH4)2SO4、20g/L酵母提取物，120℃下灭菌25min后降温至室温，1％体积接种原始菌液，摇床200rpm、30℃培养24h得到培养成熟的菌液；而后10000rpm高速离心9min得到浓缩菌液，菌液浓度调至10×109cell/mL，OD600值为2；
(2)1.8g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌5h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后降温至60℃温度平衡半小时；同时制备单宁酸(TA)溶液，0.36g TA超声分散于4mL去离子水中；将制备好的TA溶液用胶头滴管缓慢滴入PVA溶液中，剧烈搅拌半小时，使其形成均一溶液即聚乙烯醇-单宁酸溶液；将2.7g尿素、3.33g氯化钙溶解于PVA-TA溶液中，完全溶解后室温静置降温至30～40℃以后，加入3mL浓缩菌液并采用磁力搅拌器搅拌30min使之均匀分散得到混合液，混合液中PVA浓度为6wt％，TA占PVA的20wt％，尿素和氯化钙的浓度分别为1.5M和1M，浓缩菌液掺量为10％；
(3)将混合液在0.08MPa真空抽滤7min、4次，除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-16℃冷冻18h后室温融化6h，交替循环5次，得到所述的微生物矿化增强的水凝胶。
将得到的微生物矿化增强的水凝胶置于室温反应5d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，掺入微生物组的拉伸强度为0.49MPa。
实施例15
一种微生物矿化增强水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)脲酶菌培养所使用的培养基为0.13M Tris buffer、10g/L(NH4)2SO4、20g/L酵母提取物，120℃下灭菌25min后降温至室温，1％体积接种原始菌液，摇床200rpm、30℃培养24h得到培养成熟的菌液；而后7000rpm高速离心15min得到浓缩菌液，菌液浓度调至3×109cell/mL，OD600值为1.8；
(2)2.4g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌5h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后降温至60℃温度平衡半小时；同时制备单宁酸(TA)溶液，0.36g TA超声分散于4mL去离子水中；将制备好的TA溶液用胶头滴管缓慢滴入PVA溶液中，剧烈搅拌半小时，使其形成均一溶液即聚乙烯醇-单宁酸溶液；将2.7g尿素、2.50g氯化钙溶解于PVA-TA溶液中，完全溶解后室温静置降温至30～40℃以后，加入3mL浓缩菌液并采用磁力搅拌器搅拌30min使之均匀分散得到混合液，混合液中PVA浓度为8wt％，TA占PVA浓度的15wt％，尿素和氯化钙的浓度分别为1.5M和0.75M，浓缩菌液掺量为10％；
(3)将混合液在0.09MPa真空抽滤8min、3次，除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-17℃冷冻19h后室温融化5h，交替循环3次，得到所述的微生物矿化增强的水凝胶。
将得到的微生物矿化增强的水凝胶置于室温反应6d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，掺入微生物组的拉伸强度为0.59MPa。
实施例16
一种微生物矿化增强水凝胶的方法，包括以下步骤：
(1)脲酶菌培养所使用的培养基为0.13M Tris buffer、10g/L(NH4)2SO4、20g/L酵母提取物，120℃下灭菌25min后降温至室温，1％体积接种原始菌液，摇床200rpm、30℃培养24h得到培养成熟的菌液；而后9000rpm高速离心11min得到浓缩菌液，菌液浓度调至6×109cell/mL，OD600值为1.9；
(2)3g聚乙烯醇(PVA)颗粒高温(90～95℃)水浴搅拌5h完全溶解于去离子水中，制成均一透明的PVA溶液，之后降温至60℃温度平衡半小时；同时制备单宁酸(TA)溶液，0.15gTA超声分散于4mL去离子水中；将制备好的TA溶液用胶头滴管缓慢滴入PVA溶液中，剧烈搅拌半小时，使其形成均一溶液即聚乙烯醇-单宁酸溶液；将2.7g尿素、4.995g氯化钙溶解于PVA-TA溶液中，完全溶解后降温至室温，加入3mL浓缩菌液并采用磁力搅拌器搅拌30min使之均匀分散得到混合液，混合液中PVA的浓度为10wt％，TA占PVA浓度的5wt％，尿素和氯化钙的浓度均为分别为1.5M，浓缩菌液掺量为10％；
(3)将混合液在0.11MPa真空抽滤10min、2次，除去其中的气泡后注模成型(模具的尺寸为90mm×10mm×3mm)，之后经-20℃冷冻18h后室温融化6h，交替循环3次，得到所述的微生物矿化增强的水凝胶。
将得到的微生物矿化增强的水凝胶置于室温反应3d，采用万能试验机测试水凝胶拉伸强度，加载速度为100mm/min，掺入微生物组的拉伸强度为0.64MPa。
各项性能表征
将实施例1、实施例2、实施例3得到的水凝胶在-55℃下冻干2d后进行性能表征：
对实施例1、2、3进行XRD表征，扫描速度为0.02°/s，扫描范围为10°～60°，表征结果如图1，经研究发现掺入微生物组可以观测到明显的属于球霰石的峰。
图2为实施例1制备得到的水凝胶的SEM表征(1000×)、图3为实施例2制备得到的水凝胶的SEM表征(4000×)，从图中可以看出，图2为明显的多级网络状结构，图3中仍旧为网络状结构，可以观测到与预期一致的球霰石附着到凝胶支架的现象，其中也可以观测到可能是杆状微生物存在的痕迹，佐证了这部分碳酸钙是微生物矿化沉积作用产生的。
图4采用傅里叶红外光谱测得的实施例1和2制备得到的水凝胶在扫描范围为4000～500cm-1的吸收光谱，图中3329cm-1处为O-H键，2916cm-1处为C-H键，图中可以观察到掺入浓缩菌液的对比组中没有C-H键的峰，这可能是由于这一部分碳用于微生物矿化沉积，因此在凝胶支架上生成了碳酸钙，产生了如图3所示的现象。
