一种高效提取玛咖多糖的方法
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种高效提取玛咖多糖的方法。
背景技术
玛咖(学名：Lepidium meyenii Walp，又称maca)是原产于秘鲁安第斯山脉的一种十字花科植物，叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，营养成份丰富，有“南美人参”之誉。玛咖的下胚轴可能呈金色或者淡黄色、红色、紫色、蓝色、黑色或者绿色。我国于2003年引种成功，如今在我国云南和新疆等地已形成了一定规模的种植产业，卫生部于2011年批准玛咖作为新资源食品，相关的产品开发设计功能食品和化妆品等方面。已有文献报道，玛咖酰胺、芥子油苷和玛咖多糖有抗疲劳、抗肿瘤、调节免疫能力、调节内分泌等诸多功效。玛咖作为新资源食品已广泛收到国内外保健行业的关注。
多糖是由糖苷键结合的糖链，至少由超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖作为生物大分子之一，目前的研究也越来越深入，有大量文献报道，许多天然多糖都拥有各种生物活性功能，如抗氧化活性、降血糖血脂功效、抑制癌细胞生长等。对多糖功能的研究和产品的开发也越来越多，已然成为了食品科学的前沿热点。
发明内容
本部分的目的在于提供一种高效提取玛咖多糖的方法。该方法以玛咖为原料，分离出纯度较高的三个多糖成分，该成分具有较好的抗氧化性和降血脂功效。
为实现上述目的，本发明包括如下技术方案：
一种高效提取玛咖多糖的方法，该方法包括如下步骤：
I.将玛咖根茎粉碎过筛，采用超声波辅助热水浸提的方法提取玛咖粉中的水溶性物质；
II.将步骤I获得的混合物过滤得到玛咖水提液，先后采用淀粉酶和糖化酶进行酶解，以去除淀粉，然后使酶灭活，离心取上清液；
III.将乙醇加入步骤II获得的上清液中，低温放置，使多糖沉淀；
IV.用水将步骤III获得的沉淀物用水复溶，复溶液采用Sevage法除蛋白，冻干后得到玛咖粗多糖。
如上所述的方法，优选地，所述步骤I的具体操作为：提取温度为40-60℃，提取时间为30-60min，超声功率为150-300W，料液比(重量/体积)为1∶20-40g/mL。
如上所述的方法，优选地，所述步骤II的具体操作为：在玛咖水提液中加入淀粉酶，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶(100～2000)，30～80℃下反应2～5h；再加入糖化酶，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶(50～1000)，30～80℃下反应1～4h，之后90～100℃加热5～30min使酶灭活，离心取上清液。
如上所述的方法，优选地，所述步骤II的具体操作为：在玛咖水提液中加入淀粉酶，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶1000；60℃下反应3h后再加入糖化酶，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶500，60℃下反应2h，之后100℃加热10min使酶灭活，离心取上清液。
如上所述的方法，优选地，所述步骤II的淀粉酶为α淀粉酶。
如上所述的方法，优选地，所述步骤III中，多糖溶液和乙醇的体积比为1∶(2～4)，在4～10℃放置10～14h，使多糖沉淀分离。
如上所述的方法，优选地，所述步骤IV的具体操作为：配置Sevage试剂，其中正丁醇与氯仿的体积比为1∶(2～5)；将Sevage试剂和多糖溶液按体积分数1∶(1～4)混合震荡，离心分层，保留上层溶液，之后再次加入Sevage试剂反复操作，直至上层溶液中没有蛋白检出。
如上所述的方法，优选地，所述方法还包括：
步骤V：将所述步骤IV获得的玛咖粗多糖用阴离子交换柱分离，获得三个多糖成分，分别为MPS1、MPS2和MPS3。
如上所述的方法，优选地，所述阴离子交换柱分离条件为：
离子交换柱采用的填料为聚甲基丙烯酸树脂，采用的溶剂依次为ddH2O、0.1MNaCl和0.2M NaCl；ddH2O洗脱得到MPS1，0.1M NaCl洗脱得到MPS2，0.2M NaCl洗脱得到MPS3。
如上所述的方法，优选地，所述MPS1的单糖组成及质量比为阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖＝1.9∶1.4∶3.8∶1；MPS2的单糖组成及质量比为阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1.8∶1.3∶1；MPS3的单糖组成及质量比为鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶15.6∶24.3∶5.3。
本发明的有益效果在于：该方法以玛咖为原料分离出的多糖主要为三个多糖成分，该方法操作简单、提取温度低时间短、提取率高、纯度较高，获得的三个多糖成分具有较好的抗氧化性和降血脂功效。
附图说明
图1为采用阴离子交换柱用氯化钠水溶液梯度洗脱粗多糖的过程图。
图2为三种多糖成分吸光度值检测结果。
图3为DPPH自由基清除实验结果。
图4为羟基自由基清除实验结果。
图5为三种玛咖多糖的红外图谱。
图6a为MPS1的单糖组成；
图6b为MPS2的单糖组成；
图6c为MPS3的单糖组成。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1提取玛咖多糖(一)
1.提取过程
准确称取1g玛咖根粉末，按料液比为1∶32(g/mL)加入水中，提取时间42min，超声功率220W，提取温度50℃，提取结束之后过滤，加入α淀粉酶(诺维信公司)，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶1000，在60℃反应3h后再加入糖化酶(诺维信公司)，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶500，60℃下反应2h，之后100℃加热10min使酶灭活，离心取上清液。将上清与乙醇混合，使乙醇终浓度达到75％，在4℃下静置12h，使多糖沉淀；用水将沉淀物复溶，按正丁醇与氯仿的体积比为1∶4配置Sevage试剂，将Sevage试剂与多糖溶液混合震荡，试剂与多糖溶液体积比为1∶2，保留上层溶液，使用Sevage试剂反复多次萃取蛋白，直至上层溶液不再检测出蛋白，将去除蛋白的上层溶液冷冻干燥，获得玛咖粗多糖，玛咖多粗糖的总提取率为11.0wt％。
2.产品分离
采用阴离子交换柱(DEAE-650M，TOSOH)，氯化钠水溶液梯度洗脱，分离粗多糖过程如图1所示，每管洗脱液8ml，水洗脱获得MPS1、0.1MNaCl洗脱获得MPS2、0.2MNaCl洗脱获得MPS3，三种成分重量百分比分别为57.7％、18.3％、24.0％，其中MPS1所占比例最多，为中性多糖。
3.产品分析
(1)产品纯度
分别对三种多糖成分进行吸光度值检测，结果如图2所示，可以看出三种多糖成分在波长280nm处没有明显的吸收峰，可以判断多糖中没有蛋白质的杂质。
(2)定性检测
用离子色谱对三种多糖成分进行检测，结果如图6所示。图6a为MPS1的单糖组成，测得MPS1的单糖组成比例为阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖＝1.9∶1.4∶3.8∶1。图6b为MPS2的单糖组成，MPS2的单糖组成比例为阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1.8∶1.3∶1。图6c为MPS3的单糖组成，MPS3的单糖组成比例为鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶15.6∶24.3∶5.3。
(3)红外光谱检测
如图5所示，从上到下3条线分别表示MPS1、MPS2和MPS3的红外图谱，有大部分峰是相同的，其中，在3360cm-1左右出现的峰是-OH基团，2930cm-1出现的峰表示的是C-H链接，1600cm-1的峰表示有C＝O链接键，1400cm-1表示C＝C链接键，MPS1在1053cm-1的峰为吡喃环，MPS2在559cm-1左右出现的吸收峰表示了MPS2有α螺旋结构。
实施例2提取玛咖多糖(二)
1.准确称取1g玛咖根粉末，按料液比为1∶30(g/mL)加入水中，提取温度40℃，超声功率300W，提取时间45min，提取结束之后过滤，加入α淀粉酶(诺维信公司)，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶500，在50℃反应5h后再加入糖化酶(诺维信公司)，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶1000，50℃下反应3h，之后100℃加热20min使酶灭活，离心取上清液。将上清与乙醇混合，使乙醇终浓度达到80％，在5℃下静置14h，使多糖沉淀；用水将沉淀物复溶，按正丁醇与氯仿的体积比为1∶5配置Sevage试剂，将Sevage试剂与多糖溶液混合震荡，试剂与多糖溶液体积比为1∶4，保留上层溶液，使用Sevage试剂反复多次萃取蛋白，直至上层溶液不再检测出蛋白，将去除蛋白的上层溶液冷冻干燥，最终玛咖多糖的提取率为10.5％。
2.产品分离
采用与实施例1相同的阴离子交换柱和分离条件进行玛咖粗多糖的分离，三种成分重量百分比分别为51.9％、20.0％、28.1％。
3.产品分析
三种成分的纯度和定性检测检测结果与实施例1相似。
实施例3提取玛咖多糖(三)
准确称取1g玛咖根粉末，按料液比1∶30(g/mL)加入水中，提取温度50℃，超声功率200W，提取时间45min，提取结束之后过滤，加入α淀粉酶(诺维信公司)，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶800，在70℃反应2h后再加入糖化酶(诺维信公司)，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶800，70℃下反应3h，之后100℃加热30min使酶灭活，离心取上清液。将上清与乙醇混合，使乙醇终浓度达到70％，在5℃下静置13h，使多糖沉淀；用水将沉淀物复溶，按正丁醇与氯仿的体积比为1∶3配置Sevage试剂，将Sevage试剂与多糖溶液混合震荡，试剂与多糖溶液体积比为1∶3，保留上层溶液，使用Sevage试剂反复多次萃取蛋白，直至上层溶液不再检测出蛋白，将去除蛋白的上层溶液冷冻干燥，最终玛咖多糖的提取率为10％。
2.产品分离
采用与实施例1相同的阴离子交换柱和分离条件进行玛咖粗多糖的分离，三种成分重量百分比分别为52.2％、19.7％、28.1％。
3.产品分析
三种成分的纯度和定性检测检测结果与实施例1相似。
实验例1玛咖多糖的抗氧化性实验
本实验主要涉及对两种自由基清除的实验，分别是DPPH自由基和羟基自由基。
一、DPPH自由基清除实验：
取0.5mL不同浓度(1、2、4、6、8、10mg/mL)的多糖样品与0.5mL DPPH(0.04mg/mL，溶于无水甲醇)混合，充分振荡并室温静置40min，在517nm处测定吸光值。
DPPH清除率＝(1-(A3-A2)/A1)×100％
式中A1表示用无水甲醇代替样品，A2表示用无水甲醇代替DPPH溶液，A3表示DPPH溶液和样品混合反应。
玛咖多糖组成之一MPS1对DPPH自由基清除效果最佳，在5mg/mL的浓度下清除率达到了81.8％，如图3所示。
二、羟基自由基清除实验：
取0.5ml邻二氮菲溶液与1ml PBS(pH 7.4)混匀，加入0.5ml待测样品(1、2、4、6、8、10mg/mL)和0.5ml硫酸亚铁，混匀后加0.5ml过氧化氢，最后ddH2O定容至10ml，在37℃水浴1h后再536nm处测定吸光值。
羟自由基去除率＝[(A3-A1)/(A2-A1)]×100％
式中A1表示不添加样品；A2表示不添加过氧化氢；A3表示添加样品。
玛咖多糖组成之一MPS2对羟基自由基清除效果最佳，在8mg/mL的浓度下清除率达到了100％，如图4所示。
从图3、图4可以看出MPS1对DPPH自由基和羟基自由基的清除效果较佳，分别能达到81.8％(5mg/mL)和89.5％(10mg/mL)，而MPS2对羟基自由基的清除效果略高于MPS1，在8mg/mL的浓度下清除率达到了100％。
实验例2玛咖多糖的降血脂作用
取2mL不同浓度的多糖，放入试管中，加0.5mL 0.01M的HCl，37℃恒温振荡1h。以0.1mol/L NaOH调节pH至6.3，加入2ml 10mg/ml的胰蛋白酶，37℃振荡1h。每个样品加入2mL0.4mmol/L甘氨胆酸钠或0.5mmol/L牛磺胆酸钠，37℃振荡1h。4000r/min离心20min，取上清，加6ml70％的硫酸70℃反应20min，取出冰浴5min，在387nm处测定吸光值。
玛咖多糖的三种组成MPS1、MPS2、MPS3的对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合能力如表1所示。
表1玛咖多糖三种组分对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合能力
从表1可以看出，三种多糖对牛磺胆酸钠的结合能力明显高于甘氨胆酸钠，其中MPS3的结合能力最佳，达到了2.4590±0.5771(μmol/100mg)，通过结合胆酸钠可以减少胆汁酸的肝肠循环，促进肝脏降解更多的胆汁酸，使得血液中的胆固醇流入肝脏，起到了降低血脂的作用。
