环糊精型荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针的合成，特别是一种可用于检测铜离子的环糊精型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
Cu2+离子是人体必需的微量元素，参与很多生物化学反应过程，机体内的生化功能主要是催化作用。Cu2+离子对人体内的作用有以下几点：构成含铜酶与铜结合蛋白的成份；维持正常造血功能，参与铁的代谢和红细胞生成；促进结缔组织形成；保护中枢神经系统；促进正常黑色素形成及维护毛发正常结构；保护机体细胞免受超氧阴离子的损伤；影响激素分泌；影响糖和脂质代谢，体现在对血糖的调节作用，缺铜后葡萄糖耐量降低，对某些用常规疗法无效的糖尿病患者，给以小剂量铜离子治疗，常可使病情明显改善，血糖降低缺铜可使血中胆固醇水平升高。但若过量则会驻留体内而蓄积在各个组织导致病变引起中毒。当人体铜代谢异常时，会引发Menkes病、阿尔茨海默病，还会引发肝脏肾损伤等疾病。同时Cu2+也是过渡金属污染物质之一，所以研究检测Cu2＋的荧光传感器对生命科学以及环境污染具有重大意义。
目前，Cu2+的检测方法主要有分光光度法、原子吸收光谱法、共振散射光谱法、电化学法等，但它们存在干扰大、灵敏度差和仪器昂贵等缺点，而且这些方法需专业人员操作，成本高。因此，开发操作简单、成本低廉的Cu2+检测方法具有重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种环糊精型荧光探针，及其制备方法和应用，从而达到提高荧光检测铜离子的灵敏度和专一性的目的。
为解决以上技术问题，根据本发明的一个方面，提供了一种环糊精型荧光探针，是在β-环糊精6位引入氨基硫脲基团，其结构式为：
根据本发明的另一方面，提供了一种以上所述的环糊精型荧光探针的制备方法，包括：
步骤一，在β-环糊精的6位引入醛基，获得环糊精醛；
步骤二，取步骤一获得的环糊精醛和氨基硫脲溶于无水甲醇中，70-80℃温度下搅拌反应；反应结束后，待反应液温度下降到20-30℃，有固体析出，减压抽滤获得滤饼，滤饼用无水乙醇洗涤，洗涤后的产物进行干燥，即得所述的环糊精型荧光探针。
优选地，步骤二中，环糊精醛和氨基硫脲溶于无水甲醇后，在75℃温度下搅拌反应；反应结束后，待反应液温度下降到25℃，有固体析出。
进一步地，步骤一中，获得环糊精醛的第一方法，包括步骤：
β-环糊精溶解于NaOH溶液中，向上述溶液中加入对甲苯磺酰氯，搅拌反应；反应完全后抽滤，滤液用盐酸调节pH至7，搅拌、抽滤得白色沉淀；将上述白色沉淀溶于去离子水中，搅拌加热至80-90℃，过滤去除少量白色不溶固体；滤液冷却重结晶析出大量白色沉淀，抽滤得粗产物，即单-6-苯磺酰基-β-环糊精；
称取获得的单-6-苯磺酰基-β-环糊精溶于二甲基亚砜中，在N2保护下，将温度升至130-140℃搅拌反应；将获得的红棕色反应液滴加到乙酸乙酯中后，析出棕色沉淀，抽滤去滤液；随后真空干燥，所得产物即为环糊精醛。
优选地，白色沉淀溶于去离子水中，搅拌加热至85℃。
优选地，单-6-苯磺酰基-β-环糊精溶于二甲基亚砜中，在N2保护下，将温度升至135℃搅拌反应16 h。
进一步地，步骤一中，获得环糊精醛的第二方法，包括步骤：
称取β-环糊精和IBX溶于二甲基亚砜中，置于干燥密闭的圆底烧瓶中搅拌反应，抽滤去除滤饼；滤液滴加到乙酸乙酯中析出白色沉淀，继续搅拌后减压抽滤去滤液；去离子水加入到上述白色沉淀中，使其溶解，抽滤去除白色不溶固体；真空冷冻干燥得产物为白色粉末固体，所得产物即为环糊精醛。
优选地，置于干燥密闭的圆底烧瓶中25℃下24 h搅拌反应。
根据本发明的另一方面，提供了所述的环糊精型荧光探针用于识别铜离子的应用。
本发明运用两种化学合成方法，在β-CD的6位引入醛基，得到活性高的β-CD衍生物，再与发色基团氨基硫脲缩合，获得在水溶液中识别Cu2＋荧光猝灭型探针。所述探针用于荧光检测铜离子的含量，克服了现有方法灵敏度不高的缺点，对铜离子有较好的识别能力，其他离子对其几乎不会产生干扰，具有较高的灵敏度和专一性。
附图说明
图1为本发明实施例3制备的探针L在其他阳离子中对Cu2+的选择性识别；
图2为本发明实施例3制备的探针L在其他阴离子中对Cu2+的选择性识别；
图3为本发明实施例3制备的探针L的Cu2+滴定曲线图；
图4为本发明实施例3制备的探针L的工作曲线的测定；
图5为本发明实施例3制备的探针L与Cu2＋结合比的实验；
图6为本发明实施例3制备的探针L在其他阳离子中对Cu2＋的干扰分析；
图7为本发明实施例3制备的探针L在其他阴离子中对Cu2＋的干扰分析。
具体实施方式
本发明一种典型的实施方式提供的一种环糊精型荧光探针，是在β-环糊精（β-CD）6位引入氨基硫脲基团，其结构式为：
上述环糊精型荧光探针，可用于检测铜离子的含量，能够克服现有方法灵敏度不高的缺点，对铜离子有较好的识别能力，其他离子对其几乎不会产生干扰，具有较高的灵敏度和专一性。环糊精是一类可以将各种有机或生物分子包裹在疏水腔中的环状寡糖，这种寡糖是水溶性的，具有生物相容性。环糊精特殊的外壁亲水内腔疏水的结构，在水溶液中它可以与金属离子形成配位增强荧光信号。
本发明另一种典型的实施方式提供了以上所述的环糊精型荧光探针的制备方法，其包括：
步骤一，在β-环糊精的6位引入醛基，获得环糊精醛；
步骤二，取步骤一获得的环糊精醛和氨基硫脲溶于无水甲醇中，70-80℃温度下搅拌反应；反应结束后，待反应液温度下降到20-30℃，有固体析出，减压抽滤获得滤饼，滤饼用无水乙醇洗涤，洗涤后的产物进行干燥，即得所述的环糊精型荧光探针。优选地，在步骤二中，环糊精醛和氨基硫脲溶于无水甲醇后，在75℃温度下搅拌反应；反应结束后，待反应液温度下降到25℃，有固体析出。
步骤二中所述的氨基硫脲包括取代或未取代的氨基硫脲，R选自H、CH3、C2H5、Ph、Bn或杂环。以未取代的氨基硫脲为例，其合成路线为：
上述制备方法的基本构思是在β-CD的6位引入醛基，得到活性高的β-CD衍生物，再与发色基团氨基硫脲缩合，设计能够在水溶液中识别Cu2＋荧光猝灭型探针。通过1H-NMR、FTIR及CD对探针进行结构表征，并通过荧光光谱滴定实验、Job’s曲线以及离子干扰试验研究在Tris-HCl、pH＝7.4体系下，表明所述探针能够特异性识别Cu2＋离子。
本发明提供了两种合成环糊精醛的方法。
合成环糊精醛的第一方法，包括步骤：
β-环糊精溶解于NaOH溶液中，向上述溶液中加入对甲苯磺酰氯，β-CD和对甲苯磺酰氯的摩尔比在1:0.6-1:1.8，搅拌反应；反应完全后抽滤，滤液用盐酸调节pH至7，搅拌、抽滤得白色沉淀；将上述白色沉淀溶于去离子水中，搅拌加热至80-90℃，优选地，搅拌加热至85℃。过滤去除少量白色不溶固体；滤液冷却重结晶析出大量白色沉淀，抽滤得粗产物，即单-6-苯磺酰基-β-环糊精。
称取获得的单-6-苯磺酰基-β-环糊精溶于二甲基亚砜中，在N2保护下，将温度升至130-140℃搅拌反应，优选地，将温度升至135℃搅拌反应16 h。将获得的红棕色反应液滴加到乙酸乙酯中后，析出棕色沉淀，抽滤去滤液；随后真空干燥，所得产物即为环糊精醛。
针对该方法，环糊精型荧光探针的合成路线为（R为H）：
合成环糊精醛的第二方法，包括步骤：
称取β-环糊精和IBX溶于二甲基亚砜中，β-CD和IBX的摩尔比在1:1-1:2，置于干燥密闭的圆底烧瓶中搅拌反应，优选地，在25℃下24 h搅拌反应。抽滤去除滤饼；滤液滴加到乙酸乙酯中析出白色沉淀，继续搅拌后减压抽滤去滤液；去离子水加入到上述白色沉淀中，使其溶解，抽滤去除白色不溶固体；真空冷冻干燥得产物为白色粉末固体，所得产物即为环糊精醛。
下面通过一些相对具体的实施例对本发明要求保护的技术方案和技术效果作进一步清楚、完整的说明。
实施例1：制备环糊精醛
称取25g β-CD于250 mL的NaOH溶液中，搅拌使其溶解，在冰浴条件下，向上述溶液中缓慢搅拌加入17.5 g对甲苯磺酰氯，加完后剧烈搅拌反应1 h。然后抽滤除去反应液中的白色杂质，滤液用2M盐酸调节pH至7，在冰浴条件下继续搅拌1 h，期间会出现大量白色沉淀，抽滤得白色沉淀。将上述白色沉淀溶于340 mL去离子水中，搅拌加热至85℃，待其清澈透明趁热过滤去除少量白色不溶固体。滤液冷却至25℃左右，重结晶24 h（4℃），析出大量白色沉淀，抽滤得白色沉淀即为粗产物。重复上述重结晶步骤两次进行提纯，得到白色固体，即单-6-苯磺酰基-β-环糊精。
称取2.2 g β-CD-OTS溶于18 mL的二甲基亚砜中，加入4.5 mL三乙胺作催化剂。在N2保护下，将温度升至135℃搅拌反应16 h（TLC检测反应，展开剂为异丙醇/水/氨水＝6:3:1，碘蒸气法显色）。反应液颜色逐步从淡黄色转变至红棕色。将红棕色反应液缓慢滴加到200 mL乙酸乙酯中析出大量棕色沉淀，继续搅拌15 min后抽滤去滤液。棕色沉淀用无水乙醇洗3至4次，随后真空干燥24 h（40℃）。所得产物即为环糊精醛。
实施例2：制备环糊精醛
称取0.5 g β-CD溶于4 mL二甲基亚砜中，0.161 g IBX溶于6 mL二甲基亚砜中。将两者放置干燥密闭的圆底烧瓶中25℃下24 h搅拌反应（期间用TLC检测反应，展开剂为异丙醇/水/氨水＝6:3:1，碘蒸气法显色），抽滤去除滤饼。滤液缓慢滴加到100 mL乙酸乙酯中析出大量白色沉淀，继续搅拌10 min后减压抽滤去滤液。少量去离子水加入到白色沉淀中，使其溶解，抽滤去除白色不溶固体。真空冷冻干燥滤液48 h，得产物为白色粉末固体，所得产物即为环糊精醛。
实施例3：环糊精型荧光探针L
取0.5 g β-CD-CHO和60.3 mg氨基硫脲溶于10 mL无水甲醇中。在75℃温度下，将两者混合在一起，用磁力搅拌器搅拌，使其充分反应，回流12 h。起初反应液中还存在大量不溶物，升温至45℃左右时反应液为黄色澄清透明溶液，反应30 min后，液面与圆底烧瓶壁的接触面上方会析出金黄色固体。反应结束后，等反应液温度下降到25℃，有固体析出，颜色为淡黄色。减压抽滤取滤饼，其用无水乙醇洗涤3至4次（用TLC检测，展开剂为异丙醇/水/氨水＝6:3:1，碘蒸气法显色）。淡黄色产物40℃真空干燥24 h。
实施例4
与实施例1的区别在于：抽滤得白色沉淀，将上述白色沉淀溶于340 mL去离子水中，搅拌加热至80℃，待其清澈透明趁热过滤去除少量白色不溶固体。
称取2.2 g β-CD-OTS溶于18 mL的二甲基亚砜中，加入4.5 mL三乙胺作催化剂。在N2保护下，将温度升至130℃搅拌反应16 h（TLC检测反应，展开剂为异丙醇/水/氨水＝6:3:1，碘蒸气法显色）。
实施例5
与实施例1的区别在于抽滤得白色沉淀，将上述白色沉淀溶于340 mL去离子水中，搅拌加热至90℃，待其清澈透明趁热过滤去除少量白色不溶固体。
称取2.2 g β-CD-OTS溶于18 mL的二甲基亚砜中，加入4.5 mL三乙胺作催化剂。在N2保护下，将温度升至140℃搅拌反应16 h（TLC检测反应，展开剂为异丙醇/水/氨水＝6:3:1，碘蒸气法显色）。
实施例6
与实施例3的区别在于： 取0.5 g β-CD-CHO和60.3 mg氨基硫脲溶于10 mL无水甲醇中。在70℃温度下，将两者混合在一起，用磁力搅拌器搅拌，使其充分反应，回流12 h。起初反应液中还存在大量不溶物，升温至45℃左右时反应液为黄色澄清透明溶液，反应30 min后，液面与圆底烧瓶壁的接触面上方会析出金黄色固体。反应结束后，等反应液温度下降到20℃，有固体析出，颜色为淡黄色。
实施例7
与实施例3的区别在于： 取0.5 g β-CD-CHO和60.3 mg氨基硫脲溶于10 mL无水甲醇中。在80℃温度下，将两者混合在一起，用磁力搅拌器搅拌，使其充分反应，回流12 h。起初反应液中还存在大量不溶物，升温至45℃左右时反应液为黄色澄清透明溶液，反应30 min后，液面与圆底烧瓶壁的接触面上方会析出金黄色固体。反应结束后，等反应液温度下降到30℃，有固体析出，颜色为淡黄色。
当R选自CH3、C2H5、Ph、Bn或杂环时，可采用与实施例3相同的方法制备获得相应的环糊精型荧光探针L。
下面以实施例3获得环糊精型荧光探针L（以下简称为探针L）为例，对于该探针L用于荧光检测铜离子的各项试验进行说明。
（一）试验方法
探针L选择性试验
在2 mLTris-HCl缓冲溶液中，先加入40 μL探针L（1 eq），再分别加入160 μL各金属离子（4 eq）或各种阴离子（4 eq），测试加入各种离子后的各试样的荧光光谱。
Cu2＋荧光滴定试验
在2 mL 配制的Tris-HCl缓冲溶液中，加入20 μL探针L溶液，混匀后测荧光光谱。随后每次加入1 μL Cu2＋溶液充分混匀，测试每次加入Cu2＋后试样的荧光光谱，绘制探针L对Cu2+检出限图。
探针L与Cu2＋结合比试验
在2 mLTris-HCl缓冲溶液中加入一定的探针L溶液和Cu2＋溶液，其中加入的探针L和Cu2＋的总浓度固定为2.0×10-5M，改变二者的摩尔比（nL : nCu2＋＝9:1；8:2；7:3；6:4；5:5；4:6；3:7；2:8；1:9；0:10），测试各比例紫外光谱，绘制Job’s曲线图。
其他阳离子干扰试验
在2 mL配制的Tris-HCl缓冲溶液中加入40 μL探针L（1 eq），先分别加入160 μL其他阳离子（4 eq），再加入160 μL Cu2＋（4 eq），测试各试样的荧光光谱。
阴离子干扰试验
在2 mL配制的 Tris-HCl缓冲溶液中加入40 μL探针L（1 eq），先分别加入160 μL阴离子（4 eq），再加入160 μL Cu2＋（4 eq），测试各试样的荧光光谱。
（二）试验结果
离子选择性识别分析
通过比较探针L对各种金属离子的荧光响应来研究探针L的荧光传感选择性。在此，通过检测在380 nm激发波长下探针L的荧光强度变化来测试过量同浓度各金属离子所产生的影响。如图1所示，Cu2+显示出对探针L的荧光的10.6倍荧光猝灭现象。而探针L对于添加Ca2＋，Mg2＋，Mn2＋，Cd2＋，Ba2＋，K＋，Na＋，Li＋金属离子后，展现出较弱的猝灭现象。加入Zn2＋后，探针L无明显变化。加入Al3＋，后，探针L荧光略微增强。Cr3+，Ni2＋，Co2＋，Sn＋ 这四种金属离子的添加使得探针L的荧光猝灭，但远不及Cu2+ 产生的影响大。综上，可得出在各金属离子中，Cu2+对能引起探针L较好的猝灭现象，而其他阳离子对探针L无明显的作用。
通过比较探针L对各种阴离子的荧光响应来研究探针L的荧光传感选择性。在此，通过检测探针L的荧光强度在380 nm激发波长处的变化用以测试过量同浓度各阴离子所产生的影响。如图2所示，探针L对Cu2+显示出10.6倍的荧光猝灭程度。添加SO42－，SO32－，HPO42－，CO32－，NO3－，H2PO4－，HSO4－，HCO3－，CH3COO－，探针L显示出轻微猝灭或略微增强。综上，可得出探针L对这些阴离子没有特殊的识别作用，对Cu2+有极强的识别。
荧光滴定
通过荧光滴定法来研究分析探针L对Cu2+产生荧光猝灭效应的敏感性，保持探针L浓度不变逐步增加Cu2+的浓度而其荧光强度也随之变化。如图3所示，伴随着Cu2+的加入，该体系最大发射波长渐渐偏移，由485 nm蓝移至475 nm处。该体系荧光猝灭变化十分突出，当Cu2+浓度达至探针L浓度半数时，荧光猝灭效应趋于缓慢。当两者浓度接近1:1时，该体系的探针L的荧光强度略微下降。紫外等下可见随着Cu2+的加入，原本探针黄色的荧光逐渐变暗淡直至无荧光。这表明，探针L与Cu2+可能为1:1配位，同时也说明探针L对Cu2+能够产生极好的荧光猝灭效应。
离子干扰分析
将探针L与含有Cu2+的其他阳离子混合物的荧光传感能力进行比较来分析其他金属离子对探针L检测Cu2+的干扰，因为荧光传感器的一个非常重要的特征就是它对被测物的响应与对环境中其他物质的响应相同。如图6所示，探针L在Tris-HCl（10 mM，pH=7.4）的体系中还显示出略高荧光猝灭因子（F/F0=0.21），其中大部分与单独的Cu2+（F/F0=0.09）荧光猝灭强度相似，缓冲溶液（K+，Na+），过渡金属离子（Ni2+，Mn2+，Co2+，Cd2+，Li＋），碱土金属离子（Ca2+，Mg2+）等。说明其他阳离子对Cu2+引起的荧光猝灭强度的干扰均不大。
探针L在进行其他阳离子干扰测试后，显示出较好的专一性。同时，我们又将探针L与含有Cu2+的阴离子混合物的荧光传感能力进行比较来分析阴离子对探针L识别Cu2+的干扰。目前实验室拥有如图7中的9种阴离子。这些阴离子在与上述阳离子同样的荧光光谱测试体系中进行荧光强度的测定。如图七所示，我们可以很容易地观察出这9种阴离子与单独的Cu2+（F/F0=0.09）荧光猝灭强度也是相似的。同样也说明了这9种常见的阴离子对Cu2+引起的荧光猝灭强度的干扰均不大。总之，我们成功地制备了能够特异性识别水溶液中的Cu2+的荧光探针。
工作曲线的测定
依据探针L对Cu2+的荧光滴定数据，用计算荧光光谱法计算出了探针L对Cu2+的检出限，溶剂体系为Tris-HCl（10 mM，pH=7.4），激发波长为380 nm，狭缝宽度（激发与发射）为5 nm/5 nm。首先，将探针L的溶液连续扫描10次，测定其470 nm处的荧光发射强度。接着，进行低当量的连续滴定实验得到其荧光发射光谱。将470 nm处的荧光发射强度对应Cu2+浓度作图得到一条曲线，对其进行拟合（图4），由其曲线方程F=800.72936-11.46869[Cu2+] +0.06446[Cu2+]2，R=0.98662。如图四所示，计算出检出范围为0-85μM，检出限度为1.37μM，结果表明探针L对的检测Cu2+有较好的灵敏度。
结合比的实验
为了进一步研究探针L与Cu2+之间的配位关系，我们用等摩尔连续变化法对探针L和Cu2+之间的相互作用进行了分析，用Job’s plot方法来测定探针L与Cu2+的结合比，结果如图5所示，当探针L摩尔比接近0.5时，荧光发射强度出现了转折点，表明探针L与Cu2+之间的化学计量比为1:1。
