垂盆草均一多糖及制备方法和用途
技术领域
本发明涉及垂盆草应用领域，尤其是涉及垂盆草均一多糖及制备方法和用途。
背景技术
垂盆草，为景天科多年生草本植物，可以作为观赏植物，其药用始载于清代赵学敏的《本草纲目拾遗》。该种全草入药，性凉、味甘淡微酸，归肝胆、小肠经，有清热解毒的功效。目前对垂盆草研究主要集中在小分子提取物，尤其是槲皮素、异鼠李亭、木犀草素等，该类成分是垂盆草的主要活性成分，具有抗炎、抗纤维化、抗血管生成和镇痛的活性。最新的研究表明，垂盆草能够通过抑制M1巨噬细胞极性而减轻肾损伤。垂盆草是很好的抗肝炎中药，已用于临床处方中治疗各种肝炎，包括传染性肝炎、脂肪性肝炎、免疫性肝炎等。现代研究表明垂盆草抗炎活性主要基于其小分子活性成分，而对其多糖类大分子成分研究较少。部分研究仅局限于垂盆草的粗多糖或提取物，关于其结构研究的内容较少，至今还没有关于从垂盆草中提取纯化获得均一多糖并对其均一多糖化学的研究报道。更没有进行详细的结构表征和活性验证。
因此，我们通过对其垂盆草多糖从提取分离纯化，化学结构表征以及功能应用，进行了详细的介绍。同时筛选其均一多糖的抗肿瘤作用调节和抗氧化活性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种具有抗肿瘤作用的垂盆草均一多糖，以及垂盆草均一多糖的制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明垂盆草均一多糖的技术方案是：
一种垂盆草均一多糖，所述均一多糖的纯度为99％以上，均一多糖的分子量为1-30kDa。
所述均一多糖由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。垂盆草均一多糖是阿拉伯半乳葡聚糖，且糖苷键为1,5-Ara、1,3,5-Ara、1,4-Glc和1,4-Gal组成
为实现上述目的，本发明垂盆草均一多糖的制备方法所采用的技术方案是：
一种制备垂盆草均一多糖的方法，包括如下步骤：
a)取干燥垂盆草全草，脱脂，提取，沉淀，干燥获得垂盆草多糖粗品；
b)对步骤a)获得的垂盆草多糖粗品用蒸馏水溶解后，上样阴离子纤维素层析柱，蒸馏水进行洗脱，获得垂盆草水洗组分多糖；
c)将步骤b)获得的垂盆草水洗组分多糖用凝胶色谱柱纯化，利用NaCl溶液洗脱，获得垂盆草均一多糖。
将步骤b)获得的水洗组分多糖用6000-10000Da的透析袋流水过夜透析，浓缩冻干，获得垂盆草水洗组分多糖；获得的垂盆草水洗组分多糖用0.05～0.25mol/L的NaCl溶液溶解，离心机离心，取上清液上样，过凝胶柱，用0.05～0.25mol/L的NaCl溶液洗脱，利用示差检测器进行实时监测，根据峰形进行收集、浓缩，采用1000Da的透析袋进行流水透析，浓缩冻干，即获得垂盆草均一多糖。
步骤a)中，首先对干燥的垂盆草全草进行乙醇脱脂操作，脱脂后的垂盆草全草进行热水提取和乙醇过夜沉淀操作。
步骤a)如下具体操作：先对干燥的垂盆草全草进行乙醇回流脱脂，脱脂后的垂盆草全草鼓风干燥，热水提取2～5次，合并提取药液，进行浓缩，离心，收集上清液进行乙醇沉淀，干燥，获得垂盆草多糖粗品。离心采用5000rpm以上的高速离心10min。
步骤a)中，脱脂采用乙醇的质量分数为50～95％，脱脂时的物料比例(g/mL)为1:3～1:25，回流脱脂时间为1～18小时。脱脂后的干燥的中药垂盆草全草与水的物料比(g/mL)为1:8～1:30，加热提取的温度为60～100℃，每次提取的时间为1～8小时。
步骤a)中，沉淀时采用乙醇沉淀，加入2～5倍体积的质量分数为90～100％的乙醇，搅拌后，直到最终乙醇的质量分数为75～85％，静置4～48小时，收集沉淀物。
对步骤a)获得的垂盆草多糖粗品用水溶解后上阴离子交换纤维素层析柱，蒸馏水进行洗脱，苯酚-硫酸法实时监测，制作洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖溶液，采用旋转蒸发仪进行浓缩，6000-10000Da透析袋流水透析，冷冻干燥，获得垂盆草水洗组分多糖。阴离子交换纤维素柱(氯型)为DE-52柱。收集的水洗脱组分进行10kDa膜超滤超滤，也可以获得垂盆草均一多糖。
为实现上述目的，本发明药物组合物采用的技术方案是：
一种药物组合物，该药物组合物包含垂盆草均一多糖。
为实现上述目的，本发明垂盆草均一多糖的用途是：该垂盆草均一多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明首次从中药垂盆草全草中提取分离获得垂盆草均一多糖，并对其进行精准的结构鉴定。同时垂盆草均一多糖能够显著性抑制肝癌Huh-7细胞增殖，使Huh-7细胞停滞在S期，诱导肝癌细胞凋亡的作用。能够成为预防和治疗抗肿瘤作用低下病人的抗肿瘤作用调节剂。本发明制备方法简单，可以快速获得高纯度的均一多糖，适合于规模化生产。
附图说明
图1是实施例1的垂盆草多糖水洗脱的凝胶分离柱的色谱图。
图2是实施例2的垂盆草均一多糖的高效凝胶色谱图。
图3是实施例3的垂盆草均一多糖的红外谱图。
图4是实施例4的垂盆草均一多糖的单糖组成谱图。
图5是实施例5的垂盆草均一多糖的甲基化图。
图6是实施例6的垂盆草均一多糖的碳谱分析。
图7是实施例7的垂盆草均一多糖抑制肝癌Huh-7细胞增殖。
图8是实施例7的垂盆草均一多糖能够使Huh-7细胞停滞在S期。
图9是实施例7的垂盆草均一多糖的诱导肝癌细胞凋亡。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
1.垂盆草均一多糖的制备与鉴定
a)取干燥垂盆草2KG，加入10L水，在煮沸的条件下，提取3次，后加入4倍体积的乙醇进行醇沉，24小时，过滤，收集沉淀物进行干燥，除去残留乙醇。
b)取制得的多糖粗品10g,加入100mL蒸馏水溶解，上样于氯型阴离子交换树脂DE-52层析柱，使用蒸馏水洗脱，使用硫酸-苯酚法检测糖含量并在酶标仪490nm处检测，获得洗脱曲线，收集含糖溶液，干燥，用8000Da的透析袋透析24小时后，冷冻干燥，制得垂盆草水洗多糖。
c)获得的垂盆草水组分多糖用0.2mol/L的NaCl溶液溶解，离心，取上清液过0.22μm的滤膜，上样。用0.2mol/L的NaCl溶液的氯化钠溶液进行洗脱，利用示差检测器进行检测，根据峰形(见图1)进行收集、浓缩。采用1000Da的透析袋进行透析，即获得均一垂盆草均一多糖，简称CPCW。
2.纯度与分子量测定
采用高效液相凝胶色谱法(HPGPC)：色谱柱为BRT105-104-102，检测器为示差检测器，流动相是0.05mol/L氯化钠溶液，柱温40℃，流速：0.6mL/min，进样体积：20uL。
精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中，进样量20μl。仪器流动相为0.05M氯化钠溶液，流速为0.6mL/min。以不同相对分子质量的葡聚糖(Mw1152、11600、23800、48600、80900、148000、273000、409800)作为标准品，做出标准曲线，测定多糖的纯度及相对分子质量(见图2)。
如图2所示，得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。
lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1833x+11.843R2＝0.9961；
lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.1969x+12.469R2＝0.9949；
lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1816x+11.716R2＝0.9951。
根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小。图2获得垂盆草多糖的高效液相凝胶色谱图(HPGPC)，图中为单一对称峰，表明为均一多糖。通过公式计算出CPCW多糖的峰位分子量为29.0kDa；重均分子量为34.8kDa和数均分子量25.4kDa。
3.红外分析
通过FT-IR分析多糖的官能团
精密称取样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成。分别置于傅里叶变换红外光谱仪FT-IR650(天津港东科技发展股份有限公司)进行扫描记录。
结果：如图3所示，多糖组分的红外结果。垂盆草多糖在3600-3200cm-1区域内有一个糖类特征吸收峰3407cm-1归属于-OH的伸缩振动，在2927cm-1处的吸收峰，归属于多糖-CH2-,-CH3和-CHOH中的C-H伸缩振动。而在1423cm-1处的吸收峰可归属于亚甲基的弯曲振动。另外，在1243cm-1的吸收峰主要是由C-O伸缩振动引起的。而在1200-1000范围内的吸收峰，尤其是1022cm-1的吸收峰，主要是由C-O-C,C-O-H,C-C和糖环的伸缩振动引起的，表明该组分为吡喃糖环。
4.单糖组成分析
如图4所示，精密称量垂盆草均一多糖3mg，然后加入2mL的三氟乙酸，120℃的金属浴水解2h，旋蒸蒸发到无酸味，然后加入还原剂硼氢化钠进行还原过夜，加入乙酸中和多余的硼氢化钠。采用旋蒸蒸发仪，蒸直粘稠状，加入甲醇溶液3-5mL，重复3次。然后加入1mL的乙酸酐，101℃条件下反应1h。然后加水终止反应，采用二氯甲烷进行萃取。水洗3次，每次用10mL蒸馏水。最后吸取二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，采用岛津气相质谱联用仪(ShimadzuGCMS-QP 2010)进行分析。
GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。其中标准品顺序为：鼠李糖，岩藻糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖。
检测结果：所述的垂盆草均一多糖的GC-MS结果分析显示出3个峰，经过与标准单糖对比，证明为阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成。
5.多糖甲基化分析
如图5，称取冷冻干燥后的垂盆草多糖10mg，加入2mL的二甲基亚砜，然后加入NaOH粉末，用锡箔纸包裹试管，避光操作。然后加入碘甲烷试剂，冰浴条件下反应。最后加水终止反应，透析冻干。取完全甲基化的多糖1-2mg，加入2mL的2M三氟乙酸水解2h。旋蒸蒸干到无酸味，然后加入适量的硼氢化钠还原过夜，旋蒸蒸发到粘稠状，然后加入甲醇2-5mL，反复蒸干3次。然后加入乙酸酐，乙酰化，水中和。最后采用气相质谱联用仪进行分析(ShimadzuGCMS-QP 2010)。
GC-MS条件：RXI-5 SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件为：起始温度120℃，以4℃/min升温至280℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。
垂盆草多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析(表1)
通过甲基化分析，我们可以获得垂盆草多糖有5种糖苷键，见表格1；分别为：
2,3,5-Me3-Araf、2,3-Me2-Araf、2-Me1-Araf、2,3,6-Me3-Galp和2,3,6-Me3-Glcp。其对应的链接方式为Araf-(1→、→5)-Araf-(1→、→3,5)-Araf-(1→、→4)-Galp-(1→、和→4)-Glcp-(1→摩尔比分别为0.03:0.31:0.12:0.35:0.19。表明该多糖可能为主链为→5)-Araf-(1→4)-Galp-(1→和→4)-Glcp-(1→组成的阿拉伯半乳葡聚糖，更多信息需要通过解析NMR进一步确定。
6.核磁碳谱分析
精密称取垂盆草多糖45mg，加入氘代水溶解，然后冷冻干燥。再一次加入氘代水500ul，然后采用核磁共振仪器500MHz(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)进行波谱采集，如图6所示。
结果显示：β-D-Galp-1-4的C1、C2、C3、C4、C5和C6信号分别为105.71、73.21、74.67、79.01、75.90和62.11ppm；而α-D-Glcp-1-4的C1、C2、C3、C4、C5和C6信号分别为101.01、72.90、74.67、78.12、72.58和61.84ppm；α-L-Araf-1-5的C1、C2、C3、C4和C5信号分别为108.88、82.18、78.12、83.68和68.27ppm；
α-L-Araf-1的C1、C2、C3、C4和C5信号分别为110.62、82.62、77.93、85.26和62.49ppm；α-L-Araf-1-3-5的C1、C2、C3、C4和C5信号分别为108.46、80.63、85.44、85.1和67.82。综上所述，可以推断出该垂盆草多糖主要为Alpha阿拉伯糖1-5、Beta半乳糖1-4和Alpha葡萄糖1-4组成的阿拉伯半乳葡聚糖，通过阿拉伯糖1,3,5的O-3连接少量支链。
7.垂盆草均一多糖的抗肿瘤作用调节实验
a)通过不同浓度的垂盆草均一多糖作用于肝癌细胞Huh-7细胞，筛选垂盆草多糖的抗肿瘤作用活性。具体如下：Huh-7细胞进行复苏、培养、传代，用DMEM培养基进行培养，将细胞种植于96孔板内。待细胞培养24h贴壁后，加入不同浓度的垂盆草多糖提取物，置于37度培养箱内培养24h。随后，每个孔内加入20ul的MTT溶液(5mg/ml)。孵育4小时，弃去上清液，然后加入100ul的二甲基亚砜溶液。避光条件下，在摇床上振摇15分钟，采用酶标仪在570nm下测定吸光度，计算癌细胞的抑制率。结果表明垂盆草多糖具有显著抑制肝癌细胞增值的作用，如图7所示。
b)采用流式细胞仪分析垂盆草多糖对Huh-7细胞周期的影响。具体如下：将Huh-7细胞置于6-孔板内进行培养，至细胞贴壁后，加入200ug/ml的垂盆草多糖进行孵育。待共培养24h后，将细胞收集起来，用70％的冷乙醇进行固定。随后，将固定后的细胞用PBS洗涤三次，以除去乙醇。然后加入RNAase/PI混合溶液，并用流式细胞仪进行测试。结果表明，垂盆草多糖抑制肿瘤细胞增值主要通过使肿瘤细胞停滞在S期，如图8所示。
c)采用流式细胞仪分析垂盆草多糖对Huh-7细胞凋亡的诱导作用。具体如下：将Huh-7细胞置于6-孔板内进行培养，至细胞贴壁后，加入200ug/ml的垂盆草多糖进行孵育。待共培养24h后，将细胞进行离心、收集，用PBS洗涤三次。随后，分别加入5ul的FITC和5ul的PI溶液进行染色。待室温条件下培养30min后，采用流式细胞仪分析Huh-7细胞的荧光强度。结果表明，垂盆草多糖能够诱导肿瘤细胞凋亡，如图9所示。
