一种热响应双网络水凝胶敷料的制备方法及其使用方法
技术领域
本发明涉及水凝胶敷料，具体涉及一种热响应双网络水凝胶敷料的制备方法及其使用方法，属于生物材料技术领域。
背景技术
医用缝合材料是指在外科手术中用于结扎止血、缝合止血和组织缝合的特殊医用材料。传统的医用缝合材料为医用缝合线，包括医用可吸收缝合线和不可吸收缝合线。然而，传统的缝合方法需要很强的专业技能，并且，作为一种侵入性治疗后，可能导致感染和炎症。有研究表明，利用皮肤订书机连接伤口边缘进行伤口关闭，可以明显减少手术时间，然而该方法会使风险区域直接暴露于外部环境，从而可能会增加伤口感染和污染，也很难保持伤口微环境内的水分含量，还可能会产生严重的疤痕。
形状记忆材料(SMM)是一种响应性材料，它可以用暂时的形状固定，然后在热刺激、pH值或水的刺激下恢复到最初的永久形状。已有研究确定其在伤口闭合或愈合方面的应用潜力。Lendlein等人使用形状记忆材料进行伤口闭合，加热到一定温度后，伤口闭合会收缩或收紧。Biswas等人使用形状记忆材料缝合唇部伤口以恢复生理功能。然而，尽管这些形状记忆材料能促进伤口愈合，防止疤痕组织坏死在周围组织中，但它们仍然是一种侵入性缝合材料。为成功的实现非侵入性伤口关闭，伤口需要一些必要的支撑。首先，伤口敷料应该具有可控制的形状记忆自我收缩能力，以促进伤口愈合。其次，伤口敷料应能提供适当的恢复力，如果力太强或太弱，疤痕组织就可能发生。最后，伤口敷料应该是生物相容性和保持润湿性，以促进伤口治疗。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明提供一种热响应双网络水凝胶敷料的制备方法，该方法制备的形状记忆水凝胶敷料由一个强网络和一个弱网络组成，这个弱网络可以在固定与恢复之间切换，从而通过自身机械力的作用无创地促进伤口闭合。
除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种热响应双网络水凝胶敷料的制备方法，包括氧化淀粉的制备和明胶-氧化淀粉形状记忆双网络无创伤口闭合敷料的制备，其特征在于：所述氧化淀粉的制备为在蒸馏水中溶解可溶性淀粉制备淀粉溶液，用硫酸将溶液的pH调整到3.0-3.2，将NaIO4加入到溶液中，反应液置于冰浴反应4-6小时，然后在蒸馏水中透析3-4天，最后将纯化后的氧化淀粉溶液冷冻干燥，研磨以获得氧化淀粉粉末。
根据本发明的一个实施方案，所述淀粉溶液的浓度为4.5-6.4wt％，优选为4.8wt％。进一步，所述淀粉和NaIO4的质量比为2：1。
根据本发明的一个实施方案，所述明胶-氧化淀粉形状记忆双网络无创伤口闭合敷料的制备为将氧化淀粉溶液与明胶溶液在50℃下以9:10(w/w)的比例混合，混合后倒入模具，在50-60℃加热1小时，直到混合物凝固成凝胶状态。进一步，所述明胶溶液的浓度为20wt％。
具体的说，一种热响应双网络水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：
(1)氧化淀粉的制备
在50℃蒸馏水中完全溶解可溶性淀粉制备4.8wt％溶液，用硫酸将溶液的pH调整到3.0，然后将NaIO4加入到溶液中，其中淀粉和NaIO4的比为2：1，将反应液置于冰浴反应5小时后在蒸馏水中透析4天；将纯化后的氧化淀粉溶液冷冻干燥48h，然后研磨以获得氧化淀粉粉末；
(2)明胶-氧化淀粉形状记忆双网络无创伤口闭合敷料的制备：
将4.8wt％的氧化淀粉溶液与20wt％的明胶溶液在50℃下以9:10(w/w)的比例混合，混合后倒入模具，在50℃加热1小时，直到混合物凝固成凝胶状态既得。
根据本发明的第二方面，本发明提供上述热响应双网络水凝胶敷料的使用方法。
上述热响应双网络水凝胶敷料的使用方法，其特征在于：将水凝胶拉伸后使用夹距固定，放置于4℃冰箱20min固定形状；使用时将拉伸固定后的水凝胶敷料粘附于伤口两侧(仅敷料两端粘附，中间伤口周围部分不粘附)，使用红外加热器照射水凝胶中部，水凝胶由于升温从而发生形状记忆回复，收缩的同时拉动伤口闭合，当伤口闭合后停止近红外照射。
有益效果：
本发明提供一种热响应双网络水凝胶敷料的制备方法，制备的水凝胶敷料由两个部分组成，分别为一个脆弱而刚性的物理交联网络作为可逆开关(物理交联的明胶网络)和一个柔软而灵活的化学交联网络(希夫碱交联结构)。为了赋予凝胶形状记忆能力，本发明通过在聚合物结构中引入希夫碱(-N＝C)作为网状点，成功地制备了本发明OSG。由于形状记忆净点的成功引入，本发明OSG在Ttrans(38℃)接近生理温度时表现出了有效的热响应形状记忆特性，从而进一步确定了在形状记忆激活前后大分子团簇的取向，从平行取向变为随机线圈，在此过程中材料获得了变形过程中丢失的熵。此外，本发明OSG水凝胶对创面愈合具有足够的机械能力和组织相容性，促进创面组织重塑。本发明OSG创面敷料可在热刺激后将附着的皮肤从细长形状自我收缩，以无创闭合切口。组织学分析进一步证实了创面修复成功的发生。因此，本发明OSG使用简单，是一种有吸引力的缝合线替代品，是一种多功能的伤口敷料，用于无创伤口愈合，促进伤口愈合。
附图说明
图1是OS和OSG的化学结构和表征图，其中(A)是OSG水凝胶合成示意图；(B)是原始淀粉、OS、原始明胶和OSG的FT-IR光谱；(C)是原始淀粉的拉曼散射光谱。
图2是OSG的形状记忆特性图，其中(A)是马松三色OSG染色(原始、暂时和恢复形状)和明胶水凝胶(原始和拉伸形状)，由于原始的明胶没有形状记忆能力，所以没有呈现凝胶的恢复形状；(B)是OSG样品和盒装切片的原始、临时和恢复状态的SEM图；(C)是用应变控制模式在四个热机械循环中确定形状恢复力。
图3是体内伤口愈合能力效果图，其中(A)是在背侧全层切口模型上应用自收缩OSG的无创创面闭合效果；(B)是术后不同天数(第0、3、7、10天)创面痕迹示意图；(C)是未经处理或OSG水凝胶或医用缝线处理的伤口图，术后第3、7、10天拍照前取出OSG。
图4是创面愈合的组织学评价图，其中(A)是H&E染色组织学分析；(B)是剖面图取样；(C)是三组术后3、7、10天创面深度，误差条表示s.d.(n＝4)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
(一)、氧化淀粉/明胶水凝胶(OSG)的合成
实施例1
氧化淀粉的制备
在50℃蒸馏水中完全溶解可溶性淀粉制备4.8wt％溶液，用硫酸将溶液的pH调整到3.0，然后将NaIO4加入到溶液中(淀粉和NaIO4的质量比为2：1)，将反应液置于冰浴反应5小时后在蒸馏水中透析4天；将纯化后的氧化淀粉溶液冷冻干燥48h，然后研磨以获得氧化淀粉粉末。
明胶-氧化淀粉形状记忆双网络无创伤口闭合敷料的制备：
通过氧化淀粉与明胶之间的席夫碱反应制备OSG。首先将氧化淀粉溶液(4.8、5.6和6.4wt％)与明胶(20wt％)溶液在50℃下以9:10(w/w)的比例混合，混合后倒入模具，在50℃加热小时，直到混合物凝固成凝胶状态。
(二)、对实施例1制备的氧化淀粉/明胶水凝胶(OSG)进行性能测定
化学结构测定
利用傅里叶变换红外光谱仪(Bruker,Daltonics，德国)测定了OS和OSG的化学官能团。FT-IR光谱记录在4cm-1分辨率范围4000-600cm-1，背景为KBr和环境空气。拉曼光谱仪(LabRamHREvolution,Japan)也被用来验证OS和OSG的结构。用514nm的激发激光和10s的积分时间记录光谱。
本发明使明胶在生理温度下获得形状记忆特性的策略包括将网状点引入其聚合物网络，该网络通过明胶的氨基和OS的醛基之间的席夫碱反应实现(图1A)。通过FT-IR和拉曼光谱分析，将制备的水凝胶与原始原料的分子结构进行了比较。首先，在FT-IR光谱中，在1738cm-1处出现了一个明显的新的-C＝O伸缩振动带(图1B)，表明OS已成功合成。拉曼光谱也证实了OS结构中-C＝O的存在(图1C)，在1717～1748cm-1之间有一个明显的峰，可以认为是-C＝O基团。这些结果证实了原始淀粉已被NaIO4成功氧化。在图1B中，FT-IR光谱中1661cm-1处的新特征波段可以被指定为希夫碱基键(-C＝N)的吸收，这也被拉曼光谱中1591cm-1处-C＝N的特征吸收(图1C)所证实。值得注意的是,根据图1B吸收峰的酰胺和二酰胺转移到低波数(从1655到1634cm-1,从1552到1547cm-1)分别用OSG的傅立叶变换红外光谱的明胶相比，表明亲核试剂发生取代反应，导致用OSG中C＝N键的形成。这些结果表明-C＝N结构作为形状记忆网点被成功地引入到OSG聚合物网络中。
形状记忆行为考察
将样品(46×7×2mm3)拉伸到一个临时形状，然后冷却到4℃时固定。卸载外部拉伸力后，将样品加热到38℃以上，以激活形状恢复。这个过程中记录了样本的长度，计算了形状固定度(Rf)和形状恢复比(Rr)
其中，L1，L2，L3，L4分别代表样品的初始长度，拉伸后的长度，在4℃处释放应力后的长度，在加热后恢复的长度。
在电子万能试验机上，采用应变-温度控制模式(dT/dt＝2℃min-1)，通过热机械循环来评价形状恢复力。实验测量在加热条件下恢复力的变化。实验涉及两个阶段，其中矩形OSG样品(20×7×2mm3)：(1)在38℃拉伸至50％应变，速率5毫米/分钟；(2)四个具有恒定伸长率的热循环。每个热循环由冷却和加热过程组成：首先，温度冷却到4℃，并保持10分钟，在保持应变不变的情况下，对样品进行加热10min，以产生恢复应力。
此外，利用Masson三色染色法研究了OSG在伸长和恢复过程中的聚合物团簇取向。将原形、固定临时形(100％伸长率)和恢复形的OSG水凝胶制备成长方体(10×7×2mm3)。原始和拉伸形状(20％伸长率)的原始明胶水凝胶也被制备作为相同Masson三色染色程序的对照。所有标本均采用冷冻切片法，将冷冻的6μm横切面沿拉伸方向切开，进一步染色。用扫描电子显微镜(SEM)测定了形状记忆激活前后孔结构的变化。将原始形态、暂时形态和回收形态的OSG样品冻干后浸泡在液氮中得到横切面。横切OSG水凝胶的图像使用JSM-6610扫描电镜(Shimadzu)获得。
Masson三色染色法经常用于检测胶原纤维，遵循的一般规律是，多孔性较小的组织由最小的染料分子染色，然后是大分子染色。特别是，先前的一项研究得出结论，芳基甲烷染料在渗透、保留和置换方面的差异可能导致胶原/明胶的红色染色，其中带更多正电荷的氨基染料结合位点是可用的。在本发明中，使用马尾松三色染色法对凝胶基水凝胶进行染色，以检测基质材料在形状恢复过程中取向的变化。
如图2A所示，原形状的明胶基板(深色)呈近似各向同性排列。在伴随熵损失的拉伸固定后，临时OSG的大分子团簇在力方向上表现出明显的取向，呈平行取向。形状记忆激活后，聚合物网络结构重排回到基材各向同性结构的初始状态，在此过程中材料恢复了之前失去的熵。相比之下，未观察到形状记忆变形和固定在原始明胶水凝胶之前或之后的明显变化。因此，这些结果表明形状记忆能力可以归因于分子尺度上的熵弹性。
原始明胶水凝胶没有形状记忆性能，因为在其聚合物结构中没有稳定的物理交联作为网状点。通常有两种方法来提供这种热稳定的净点：增加分子量形成热稳定的物理交联或引入化学交联剂形成稳定的化学交联。在本发明中，OS作为化学交联剂被引入以形成一个热响应的凝胶基网络。如图2B所示，OSG在4C时表现出有效的形状记忆固定(Rf＝94.7％)，在38C触发形状记忆约30秒后，其形状恢复(Rr＝95.5％)。扫描电镜显示了OSG水凝胶的孔隙结构，平均孔隙尺寸为150μm。OSG可以被固定在一个拉长的形状，显示沿应力加载方向排列的狭窄孔隙结构。在38℃以上再加热激活形态恢复后，孔隙结构恢复到原始状态。结果表明，OSG水凝胶的微孔结构在形状变形和恢复过程中没有受到破坏，这支持了OSG在伤口闭合和愈合应用中的可行性。
在应变控制模式下进行了热机械循环测试，以测试OSG水凝胶的恢复力和形状记忆能力的可重复性(图2C)。OSG被延长了50％，然后冷却了一小段时间到4℃。在持续伸长的情况下，温度升高到Ttrans(38摄氏度)时，相应产生的回复力约为4kPa，这是由储存的能量释放贡献的。在整个热机械循环试验过程中，可以观察到明显的应力向下倾斜，这可能与恒伸长控制下的应力松弛有关。值得注意的是，在所有的热-机械循环中，应力松弛与恢复力没有显著差异，表明恢复力产生的可重复性良好。这些结果证实了OSG自收缩能力在伤口愈合应用中的附加值。
在体内的自我收缩能力和无创伤口愈合性能
在评估OSG水凝胶的体内自收缩能力之前，通过细胞存活率和活/死染色来确定体外细胞的生物相容性。结果表明，不同OS浓度的OSGs具有良好的生物相容性。OSG的自收缩能力采用背侧全层切口模型进行研究。从图3A可以看出，OSG水凝胶经过延伸固定后，初步粘附在切口部位周围的兔皮肤上。在38℃触发后，OSG迅速从拉长的形状收缩，拉动切口周围的皮肤以闭合伤口。伤口的成功闭合表明OSG水凝胶为无创的伤口闭合提供了足够的恢复力。
体内伤口愈合能力如图3B和3C所示，随着时间的推移，在体内对伤口闭合和愈合过程进行监测。OSG组和医用缝合组创面愈合快于空白对照组。空白对照组愈合过程较其他组缓慢，产生更多疤痕组织。由于缺乏促进创面闭合的外力，空白组的创面愈合完全依赖于周围组织细胞的迁移。此外，OSG水凝胶的使用不需要专业技能，与传统的外科缝合相比，大大加快了手术流程。OSG处理10天后，与空白对照组相比，OSG处理的创面在视觉上更小，甚至略小于医用缝合组。值得注意的是，尽管缝合用于缝合伤口，但在第7天移除时，它有可能造成二次损伤，导致伤口未完全缝合。在术后第10天，OSG处理的伤口与缝合处理相比，皮肤光滑，无明显疤痕形成。因此，OSG水凝胶显示出了很高的形状恢复效率，并显示出强大的潜力，作为医用缝合线的一种有效替代无创伤口关闭和随后的伤口愈合。
手术过程及组织学分析
制备OSG(30×30×3mm3)进行动物实验。首先，12只新西兰大白兔(2-4个月大，体重约2.0kg)用0.5ml盐酸甲苯嗪和氯胺酮麻醉。在剃须和消毒手术区域后，在每只兔子的背部皮肤上创建三个全层切口。将OSG水凝胶伸长率固定后，用生物胶暂时固定在切口周围。随后，红外辐照触发延长OSG的形状恢复，将温度控制在38℃。在室温下将兔子单独关在笼子里，以防止伤口和材料受到其他损害。最终，每组(n＝4)在术后3天、7天、10天人道安乐死，以供后续检查。在相同的手术步骤中，建立了未处理切口和医用缝合切口兔两组对照组。用数码相机记录创面情况，用ImageJ软件计算创面面积。所有动物实验均获得西南大学动物护理与伦理委员会的批准。通过去除包含整个创面和邻近正常皮肤的皮肤，收集组织标本。标本用10％福尔马林固定，石蜡包埋，垂直切取切片(5°m)，苏木精-伊红染色(H&E)，进行组织学观察。统计分析统计分析采用单因素方差分析，在所有情况下，当概率值(p)<0.05时，认为差异显著。
采用H&E染色评估OSG的整体创面愈合能力。一般来说，正常皮肤可分为三层:表皮层、真皮层和下皮层。如图4A所示，OSG组术后第3天出现明显的肉芽组织和轻度炎症。术后第10天，缝合组和OSG组的表皮、真皮结构更加完整，愈伤组织与表皮脱离程度更大，空白对照组未处理创面结构明显紊乱。结果表明OSG促进了伤口肉芽组织的形成和再上皮化。在术后10天，空白对照组仍有明显的2.0mm深度间隙，而OSG处理组间隙深度从2.0mm急剧下降到0.5mm(图4C)。提示OSG封闭的皮肤切口愈合良好。OSG也显示出比缝合更好的伤口愈合能力，留下一个深度为1.4mm的缺口。此外，通过评分系统评估不同治疗的炎症水平。术后第3天，所有组的炎症水平相似，没有严重的免疫反应。这一结果与细胞毒性测定结果一致，表明了良好的生物相容性。但术后第7天，空白对照组和缝合组的炎性细胞数量明显多于OSG组。这可能是由于OSG促进了创面闭合，促进/加速了创面的愈合。除了有效的创面愈合能力外，这些发现还表明OSG在无创创面闭合的可行性方面优于缝合；2)减轻创面炎症程度的作用；3)伤口愈合无专业技能要求。
