冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工艺学，具体涉及一种冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法，该冠突散囊菌孢子多糖组分可用于制备预防和/或治疗肝癌的药物。
背景技术
有研究报道，冠突散囊菌分泌多糖是一种很好的免疫调节剂，能够有效地激活免疫细胞，调节机体的免疫功能，同时也发现多糖具有抗肿瘤活性，以及降血脂、抗氧化的功效。冠突散囊菌子囊孢子有一层较厚的孢子壁，其质地坚韧、不易分解，对孢子在干燥环境下的休眠具有积极意义，但另一方面也阻碍了人体对其中物质的有效利用。探寻一种高效、对活性成分影响小的冠突散囊菌孢子活性成分提取方法，是研究冠突散囊菌子囊孢子的各种活性成分的功能并加以利用的重要前提。
发明内容
发明人经过深入研究，开发了一种冠突散囊菌孢子多糖活性组分的制备方法，并发现通过该方法制备得到的冠突散囊菌孢子多糖组分(冠突孢子多糖-4)具有下述功能：
a.体外实验表明，冠突孢子多糖-4明显抑制高转移人肝癌细胞株HepG2的增殖，有时间依赖关系。
b.体外实验表明，冠突孢子多糖-4对WB-F344细胞体外恶性转化有抑制作用。
c.体外实验表明，冠突孢子多糖-4对TPA诱导WB-F344细胞间隙连接通讯(GJIC)抑制效应有阻断作用。
d.体外实验表明，冠突孢子多糖-4可明显降低转化细胞的恶性程度。
e.体内实验表明，冠突孢子多糖-4具有保护大鼠肝脏，以免其受到化学诱变剂的损伤的功效。
因此，本发明包括：
1.一种冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法，其包括下述步骤：
步骤A：将冠突散囊菌孢子破壁后进行干燥，研磨成粉末，按每1g菌丝加30-50mL的水并混匀，于80℃-100℃水提1-4小时，然后抽滤取上清；
步骤B：对于步骤A所得的上清，加5-10倍(优选8倍)体积的95％的乙醇醇沉24-48小时，于4-8℃过滤沉淀后，在3000rpm条件下离心10min，弃上清液，取沉淀，得到冠突粗多糖；
步骤C：对于步骤B所得的冠突粗多糖，按每100mg冠突粗多糖加蒸馏水3-5mL溶解，10000-12000rpm离心10min，将上清液上样于C18色谱柱进行分离纯化，按保留时间由短至长依次收集冠突孢子多糖-1，冠突孢子多糖-2，冠突孢子多糖-3和冠突孢子多糖-4，其中冠突孢子多糖-4即为所制备的冠突散囊菌孢子多糖组分。
2.根据项1所述的制备方法，其中，所述步骤C中的C18色谱柱为ZORBXA EclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm，安捷伦公司产品)。
3.根据项1或2所述的制备方法，其中，所述步骤C中的所述C18色谱柱进行分离纯化的条件为流速：1.0mL/min，进样体积：20μL，柱温：25℃。
4.根据项1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤C中收集的冠突孢子多糖-1的保留时间为3.712分钟，冠突孢子多糖-2的保留时间为4.887分钟，冠突孢子多糖-3的保留时间为7.352分钟，冠突孢子多糖-4的保留时间为12.178分钟。
5.根据项1～4中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤A之前还包括：
步骤D：从冠突散囊菌菌落取菌，在PDA培养基上划线接种，28℃培养，待平板长满，用无菌水轻轻冲洗平板放入无菌管里，即为孢子种子；用涂布棒把孢子种子涂布到平板上，25-37℃下培养9-14天后，用无菌水冲洗平板收孢子，于-80℃冷冻3小时以上，在真空冷冻干燥机中冻干，得到冠突散囊菌孢子。
6.一种冠突散囊菌孢子多糖组分，其是通过项1～5中任一项所述的制备方法制备得到的。
7.一种用于预防和/或治疗肝癌的药物组合物，其包含预防和/或治疗有效量的项6所述的冠突散囊菌孢子多糖组分作为活性成分、以及药学上可接受的载体。
8.根据项7所述的药物组合物，其不包含所述冠突散囊菌孢子多糖组分之外的其它用于预防和/或治疗肝癌的活性成分。
9.根据项6所述的冠突散囊菌孢子多糖组分在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物组合物中的用途，其作为该药物组合物的活性成分。
10.根据项6所述的冠突散囊菌孢子多糖组分在制备用于预防和/或治疗肝癌的药物组合物中的用途，其中，所述冠突散囊菌孢子多糖组分是该药物组合物中唯一的用于预防和/或治疗肝癌的活性成分。
发明人的实验结果还表明，上述冠突孢子多糖-1，冠突孢子多糖-2，冠突孢子多糖-3基本上不具有所述冠突孢子多糖-4的所述功效。因此，通过本发明的冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法获得了冠突散囊菌子囊孢子的具有预防和/或治疗肝癌功效的活性成分。
附图说明
图1为实施例1提取的冠突散囊菌孢子粗多糖成分。
图2为实施例1纯化孢子粗多糖的产物——冠突孢子多糖-4。
图3为显示实施例2的高转移人肝癌细胞株HepG2抑制实验的结果的图。
图4为显示实施例3的冠突孢子多糖-4对WB-F344细胞体外恶性转化抑制实验实验的结果的图。A为正常细胞形态，B为3MC/TPA诱导的出现恶性转化灶的细胞的图，C为冠突孢子多糖-4对WB-F344细胞体外恶性转化抑制的图。
图5为显示实施例4的冠突孢子多糖孢子-4对TPA诱导WB-F344细胞间隙连接通讯功能抑制效应的影响的实验结果的图，A为空白组，B为90ng/mL TPA，C为50μg/mL的冠突孢子多糖-4+90ng/mL TPA。
图6为显示实施例6的突孢子多糖-4对DEN诱导大鼠体重的影响的实验结果的图。
图7为显示实施例6的冠突孢子多糖-4对DEN诱导大鼠血清中ALT、AST、ALP指标的影响的实验结果的图。
图8为显示实施例6的冠突孢子多糖-4对DEN诱导大鼠肝重比、脾重比、肾重比的影响的实验结果的图。
图9为显示实施例6的冠突孢子多糖-4对DEN诱导大鼠肝脏损伤的影响的HE染色图片。
发明的具体实施方式
实施例
下面通过具体的实施例对本发明作进一步说明,以下实施方式只以举例的方式描述本发明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1冠突散囊菌孢子多糖组分(冠突孢子多糖-4)的制备
1、冠突散囊菌孢子通过浸泡、温差、震荡等方法破壁后干燥，研磨成粉末，按1g菌丝中加30-50mL的水混匀，80℃-100℃水提1-4h，抽滤后取上清，加入8倍体积的95％的乙醇醇沉24h-48h，放4-8℃过滤沉淀后，在3000r/min条件下离心10min，弃上清液，取沉淀，即为冠突粗多糖。
2、称取100mg的冠突粗多糖，蒸馏水3-5mL溶解，10000-12000rpm离心10min，上清液上样，色谱柱：ZORBXA Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流速：1.0mL/min，进样体积：20μL，柱温：25℃。依次收集冠突孢子多糖-1(保留时间：3.712min)，冠突孢子多糖-2(保留时间：4.887min)，冠突孢子多糖-3(保留时间：7.352min)，冠突孢子多糖-4(保留时间：12.178min)，参见图1和图2。
实施例2冠突孢子多糖-4对HepG2细胞增殖的抑制作用
MTT实验：
1、制备细胞悬液：弃旧培养基，PBS洗一遍后，加胰酶消化后，显微镜下观察大部分细胞变圆时，加完全培养基终止消化，将培养皿内细胞轻轻吹下并转移到离心管中，离心。
2、细胞计数和铺板：弃上清，加入新鲜培养基，吹打，细胞悬液吹打混匀后，用计数板在显微镜下计数，调整细胞悬液浓度为5×104cells/mL。向96孔板的每孔加入100μL浓度调整过的细胞悬液，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
3、加药：铺板后培养24h，弃去旧培养基，加入完全培养基稀释过的200μL冠突散囊菌多糖样品溶液。浓度依次为150、100、50、25、12.5、0μg/mL，每个浓度设置5个复孔。阴性对照组加等量的完全培养基。放入培养箱分别培养24、48、72h。
4、测定吸光度：待药物作用到相应时间点后，96孔板每孔加入100μL完全培养基和50μLMTT(5mg/mL)溶液，放入细胞培养箱中37℃孵育2-4h。然后，吸出上清，再加入150μLDMSO/孔，震荡10min，置多功能酶标仪中，在570nm处检测吸光度值A。
5、数据统计：按照下列公式求取细胞存活率
细胞存活率(Viability％)＝A/A0×100％
A0为加入完全培养基稀释过的200μL，浓度为0μg/mL的冠突散囊菌多糖样品溶液。
实验结果显示：12.5、25、50、100、150μg/mL的冠突孢子多糖-1、2、3作用24h、48h、72h均无抑制作用。50μg/mL冠突孢子多糖-4作用48h，HepG2的抑制率达到65％。根据MTT结果确定冠突孢子多糖-4对HepG2细胞的非毒性剂量来进行后续的实验，即冠突孢子多糖-4对HepG2的最大给药浓度为50μg/mL。参见图3。
实施例3冠突孢子多糖-4对WB-F344细胞体外恶性转化的抑制实验
1、WB-F344大鼠肝上皮肝样干细胞4000个/孔分别接种于6孔板，每孔2mL培养液。
2、细胞接种后24h，培养液中加入致癌物3-甲基胆蒽(3MC)使其终浓度为2μg/mL，第96h后，除去3MC更换新鲜培养基，继续培养3天后，加入佛波醇肉豆蔻乙酸酯(TPA)，第8～12天，TPA浓度为50ng/mL进行诱导，随后TPA浓度为80ng/mL进行诱导，第25天除去TPA。
3、第30天实验结束，用PBS液冲洗细胞，做Wright-Giemsa染色，镜下观察并计数转化灶数目。空白对照组用0.2％的DMSO代替3MC和TPA，实验组于细胞接种后24h加入50μg/mL冠突孢子多糖-4，直至实验结束，其他处理同3MC/TPA转化组。细胞在加入TPA后根据细胞状态每1～3天换一次液。
上述实验做6个平行。
结果表明：50μg/mL冠突孢子多糖-4处理组与3MC/TPA模型组相比，转化灶数目明显降低，抑制率为47.29％，如表1。参见图4。
表1冠突孢子多糖-4对3MC/TPA诱导的WB-F344细胞体外恶性转化灶的抑制
实施例4冠突孢子多糖-4对TPA诱导WB-F344细胞间隙连接通讯(GJIC)抑制的影响
1、取对数生长期的WB-F344细胞105个接种于6孔板(进行划痕实验时，细胞铺满平板)，接入24h后，加入冠突孢子多糖-4。
2、冠突孢子多糖-4(50μg/m)作用23h后，细胞培养液中加入TPA(终浓度为80ng/mL)，作用1h，去除培养液，PBS液洗涤细胞3次，然后向孔板中加入1.5mL浓度0.05％为Lucifer Yellow(LY)，用手术刀片轻划数条，标记3min，去除染料，PBS洗涤细胞3次，然后细胞浸在PBS液中于荧光显微镜下观察，照相，并计数200倍放大每个视野中被染色的细胞数。
3、结果表明：冠突孢子多糖-4 50μg/mL提前作用24h，能恢复TPA抑制的GJIC功能，GJIC功能分别恢复对照组的34.6％，即冠突孢子多糖-4具有保护细胞之间的正常通讯功能，抑制正常细胞癌变。参见图5。
实施例5双层软琼脂培基检测方法如下
1、琼脂制备：用三蒸水分别制备1.2％和0.6％两个浓度的低溶琼脂糖液体，高压灭菌后，40℃维持，使之保持溶解状态。
2、无菌制备2×DMEM(含2×抗生素和20％小牛血清)，保存在37℃中。
3、底层琼脂制备：按1:1混合1.2％的琼脂糖和2×DMEM后，取3mL混合液注入直径6cm的培养皿中(如为10cm培养皿，则加入7-10mL)，待冷却凝固后，置入培养箱中备用
4、消化细胞，用培养液制成细胞悬液，计数。
5、顶层琼脂制备：按1:1比例将0.6％琼胎糖和2×DMEM在无菌试管中混匀后，在向管中加入0.2mL单细胞悬液，充分混匀、注入已铺有1.2％脂糖的培并皿中，加入量同上，待上层琼脂糖后，置入培养箱中，培养10-14天。
6、观察细胞克隆形成情况。
结果表明：冠突孢子多糖-4在抑制3MC/TPA细胞转化灶的同时，对转化细胞的恶性程度亦有降低，如表2。
表2.冠突孢子多糖-4对转化实验细胞在软琼脂中克隆形成率的影响
实施例6二乙胺亚硝酸铵(DEN)诱发的大鼠肝癌模型
SD大鼠按体质量进行随机区组分组，分为治疗组、模型组和正常组，每组各10只。治疗组和模型组按40、60、80mg/kg剂量腹腔注射二乙基亚硝胺，一周1次，每个剂量连续注射5周，共腹腔注射15周；正常组按等体积腹腔注射生理盐水；继续饲养至20周。治疗组给冠突散囊菌孢子，给药剂量为100mg/kg，一日1次，在腹腔注射DEN前一周给药灌胃给药连续20周，模型组和正常组以等体积溶媒灌胃。
检测指标：
1)8w、12w、16w、20w大鼠体重的变化。
2)实验进行到20w，戊巴比妥钠麻醉大鼠，动脉取血，离心得到大鼠血液上清，用ELISA试剂盒检测血清中的AST、ALT、ALP指标。
3)采血后，解刨大鼠，取肝脏、脾脏、肾脏，称重并观察脏器是否异常。
4)肝脏病理学结果观察，取肝大叶置于福尔马林中，固定用于病理观察。
5)结果表明：
(1)如图6，实验开始后，每4w测一次体重，实验第四周，模型组、空白组、冠突孢子多糖-4组体重之间差异没有统计学意义，第8w之后称重，空白组和冠突孢子多糖-4组体重无差异，都大于模型组的大鼠体重，差异具有统计学意义；
(2)第20周处死大鼠，取血清进行AST、ALT、ALP检测，模型组AST、ALP水平与空白组比较显著升高，冠突孢子多糖-4能明显降低AST、ALP的水平，有统计学意义，对ALT也有所降低，无统计学意义(如图7)。从脏器/体重比显示DEN对肝脏、脾脏、肾脏都有不同程度的损伤(如图8)。冠突孢子多糖-4在一定程度上保护脏器，被化学诱变剂的损伤(如图9)。
(3)实验20w，空白组的正常肝组织，可见正常的肝小叶，肝细胞形态结构正常，胞核、胞浆染色正常；模型组肝癌结节出现，炎症细胞浸润，不规则的肝细胞坏死变性，细胞核和细胞质染色变深。冠突孢子多糖-4组部分细胞体积增大，细胞浆增多，但病变程度教模型组对照组减轻很多。
工业实用性
本发明提供了一种冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法，通过该方法制备的冠突孢子多糖-4可用于制备治疗和/或预防肝癌的药物。
