木姜叶柯多糖的提取以及纯化方法
技术领域
本发明涉及从植物中提取多糖的方法，尤其涉及木姜叶柯多糖的提取以及纯化方法，属于木姜叶柯多糖的提取以及纯化领域。
背景技术
木姜叶柯(学名：Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun)是壳斗科，柯属乔木，分布于中国秦岭南坡以南各省区。嫩叶有甜味，嚼烂时为粘胶质，长江以南多数山区居民用其叶作茶叶代品，通称甜茶。木姜叶柯甜茶在中国民间已有上千年的食用历史，是一种药食两用、兼具茶、糖、药三种功能的植物，其中以四川、湖南和云南资源最为丰富。木姜叶柯生物资源量巨大，仅中国木姜叶柯年产量可达数万吨。关于甜茶的药用功能，据《中药志》记载及有关文献资料报导：“能防治高血压、治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等症。并具有滋养肝肾和胃降逆、润肺止咳、解困醒酒等作用”。《本草纲目》记载:“气味甘、平”、“无毒、疗痔、止血及血痢、止渴、活血、利小便”。2107年，木姜叶柯已被批准为新食品原料。
多糖(Polysaccharides)是一种由10个以上的单糖通过糖苷键聚合而成的生物高分子化合物，通式为[C6(H2O)5]m，通常m远大于20。目前，植物多糖已受到越来越多科研工作者的关注，国际科学界甚至提出21世纪是多糖的世纪；大量的研究表明，植物多糖具有多种生物活性，包括抗氧化、降血脂、降血糖、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抗菌抗病毒、免疫调节、保护肝脏等保健作用。所以植物多糖早已被广泛运用到食品药品领域中。多糖的提取制备是其产品精深加工的关键。
到目前为止，尚未有报道木姜叶柯叶多糖的提取方法。因此，提供一种高效制备木姜叶柯叶多糖的方法成为木姜叶柯叶多糖产业化发展亟待解决的首要问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种高效从木姜叶柯中提取多糖的方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种木姜叶柯多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)将木姜叶柯叶预处理得到木姜叶柯叶粉；(2)去除木姜叶柯叶粉中的脂溶性化合物；(3)以水为提取溶剂，将去除脂溶性化合物的木姜叶柯叶进行加压提取；(4)提取物离心取上清，得到木姜叶柯叶粗多糖提取物。
作为本发明一种优选的具体实施方式，还包括：将得到的木姜叶柯叶粗多糖提取物进行如下的纯化处理得到木姜叶柯叶多糖提取物纯品：(a)将木姜叶柯叶粗多糖提取物浓缩；(b)去除浓缩产物中的淀粉和蛋白；(c)加入乙醇进行醇沉，沉淀用水复溶后进行透析处理、干燥。
其中，所述的去除浓缩产物中的淀粉和蛋白的方法包括：加入α-淀粉酶进行水解反应去除木姜叶柯叶粗多糖提取物中的淀粉，将淀粉酶灭活后，离心去除变性的酶及其它的蛋白；优选的，向木姜叶柯叶粗多糖提取物中加入95％乙醇进行醇沉；将醇沉产物离心后取沉淀用水复溶，用分子量截留量3.5kDa的透析袋进行透析处理。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(1)中所述木姜叶柯叶的预处理方法包括：将木姜叶柯叶干燥，粉碎，过筛，即得；其中，所述的过筛最优选为过60目筛。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(2)中去除木姜叶柯叶粉末中的脂溶性化合物的方法包括：将木姜叶柯叶粉与乙醇混均后进行超声处理；超声处理后的产物离心，取沉淀，即得。为了实现更好的去除脂溶性化合物的效果，优选将所得的沉淀与乙醇混均后再次进行超声处理，超声处理后的产物离心，取沉淀；所述的乙醇可以为20-95％乙醇；按照g:mL计，木姜叶柯茶叶粉与乙醇的比例1：(5-30)；所述的超声处理的条件为：超声功率为500-800W，超声处理的时间为10-60min；优选的，所述的乙醇为80％乙醇；按照g:mL计，木姜叶柯茶叶粉与乙醇的比例1：10；所述的超声处理的条件为：超声功率为640W，超声处理的时间为300min。
作为本发明一种优选的具体实施方式，步骤(3)中提取溶剂所加入的量依据木姜叶柯叶粉的用量来计算，按照g:mL计，木姜叶柯叶粉与提取溶剂的比例为1：(10-50)；木姜叶柯叶粉与提取溶剂的比例可以为1：(20-30)，优选的，木姜叶柯叶粉末与提取溶剂的比例为1：20-24；所述的加压提取的时间可以为20-60min，优选为30-50min，最优选为40-41min；所述加压提取的压力可以为0.02-0.10Mpa；优选为0.08-0.09Mpa。
本发明以成品木姜叶柯茶叶研磨制得的茶粉为原料，使并以称重法计算木姜叶柯叶多糖的提取率为参考指标，通过单因素多水平实验结合Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化了加压溶剂提取木姜叶柯叶多糖的最佳提取工艺条件，主要包括木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比、提取时间和提取压力，最终确定提取料液比1：24、提取时间为41min、提取压力为0.09Mpa为加压提取的最佳工艺参数，在此条件下进行三次验证试验，测得木姜叶柯叶多糖提取率为4.65±0.12％。
与现有技术相比，本发明主要具有如下的有益效果：
(1)本发明采用加压溶剂辅助提取方法从木姜叶柯叶中提取多糖，该方法能够有效降低溶剂的表面张力和粘度，从而更好地渗透到木姜叶柯叶中，实现高效提取多糖的目的；本发明方法提取效率高，提取成本低，提取时间短，提取工艺简单且稳定可靠，提取能耗低，本发明方法的推广和应用将对木姜叶柯叶多糖产业化发展起到重要的推动作用。
(2)本发明所提供的加压溶剂辅助提取木姜叶柯叶多糖工艺条件的响应面优化方法将为加压溶剂辅助提取在木姜叶柯叶多糖实际生产中的应用提供可靠的参考，为木姜叶柯叶多糖作为功能性食品的研发提供技术支撑。
附图说明
图1为高效制备木姜叶柯叶(甜茶)多糖的加压溶剂辅助提取方法流程图。
图2为木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比对木姜叶柯叶多糖提取率的影响图。
图3为提取时间对木姜叶柯叶多糖提取率的影响图。
图4为提取压力对木姜叶柯叶多糖提取率的影响图。
图5为提取料液比和提取时间对木姜叶柯叶多糖提取率的响应面三维图。
图6为提取料液比和提取压力对木姜叶柯叶多糖提取率的响应面三维图。
图7为提取时间和提取压力对木姜叶柯叶多糖提取率的响应面三维图。
图8为提取料液比和提取时间对木姜叶柯叶多糖提取率的响应面等高线图。
图9为提取料液比和提取压力对木姜叶柯叶多糖提取率的响应面等高线图。
图10为提取时间和提取压力对木姜叶柯叶多糖提取率的响应面等高线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1木姜叶柯茶叶多糖的提取
(1)将成品木姜叶柯茶叶在45℃的恒温热风烘箱中干燥至恒重，再用Super Mill-1500打粉机进行研磨，随后过60目筛，木姜叶柯茶叶粉末装入密封袋中，置于-20℃保存备用。
(2)准确称量2g木姜叶柯茶叶粉，加入到50mL离心管中，并涡旋混匀，加入20mL80％乙醇(1：10，w/v)，使用PL-S80T超声波清洗机在640W的功率下超声30min。样品配平后通过X3R型高速冷冻离心机在4000g下离心10min，弃去上清液后的沉淀再加入20mL 80％乙醇，使用PL-S80T超声波清洗机在80％的功率下超声30min。样品配平后通过X3R型高速冷冻离心机在4000g下离心10min，弃去上清液保留沉淀。
(3)准确量取60mL(1：30，w/v)超纯水，将步骤(2)得到的去除脂溶性化合物的沉淀从离心管中洗涤到250mL锥形瓶中，摇匀；随后，使用GI54DS高压灭菌器对木姜叶柯叶多糖进行辅助提取，设置提取时间为40min，提取压力为0.06MPa；提取结束后将锥形瓶中的样品分装在两个50mL的离心管中，配平，4000g下离心15min，离心后收集上层清液(木姜叶柯粗多糖水提物)，沉淀按上述步骤再提取一次。第二次提取结束的沉淀再加入20mL超纯水，摇匀后于4000g下离心15min，收集上清液。最后，混合两次提取液和洗涤沉淀的清液，使用旋转蒸发仪在80℃旋蒸，浓缩至原体积的1/3。
(4)将上述木姜叶柯粗多糖水提物中加入17.5mg高峰α-淀粉酶(高峰α-淀粉酶即耐高温α-淀粉酶，40000U/g，购自北京索莱宝科技有限公司)(5U/mL)在80℃的水浴锅中反应4h，以去除木姜叶柯粗多糖水提物中的淀粉；反应结束后，将水浴锅温度升至95℃，水浴30min将高峰α-淀粉酶灭活，然后取出样品冷却至室温，通过4000g离心15min去除变性的酶及样品中少量的蛋白。
(5)将步骤(4)获得的提取液用三倍体积的95％乙醇醇沉，醇沉步骤在恒温加热式磁力搅拌器上完成，注意逐滴加入95％乙醇，完成该步骤后将样品置于4℃冰箱沉淀过夜；次日，通过4000g离心15min获得木姜叶柯叶多糖沉淀；接着，沉淀加入30mL 80％的乙醇，摇匀，通过4000g离心15min洗涤沉淀；最后，用60℃超纯水复溶沉淀(若出现无法溶解的沉淀，则需要通过4000g离心15min去除不溶物)。
(6)将复溶后的木姜叶柯叶多糖提取物采用透析袋(分子量截留量3.5kDa)作进一步快速纯化，具体方法为：将木姜叶柯叶多糖提取物分装在透析袋中，将透析袋放入透析液(超纯水)中透析，每2h更换一次超纯水，换水前检测透析液的电导率，直至透析前后电导率不再改变。根据实际操作情况得出，大约透析3天可完全透析掉样品中的淀粉水解产物及其他小分子物质；最后，收集透析袋中的样品通过冷冻干燥获得纯化后的木姜叶柯叶多糖，冷冻干燥时间为48h，干燥结束后立即收集样品用分析天平称重。提取率计算公式如下：
提取率＝A/B×100％
其中，A为木姜叶柯茶叶粉末重量(2g)；B为木姜叶柯叶多糖的重量。
经过检测，本实施例的多糖提取率为4.54％，多糖提取产量为90.8mg。
实施例2木姜叶柯茶叶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中采用高压提取时的料液比是1:24，提取时间是41min，提取压力是0.09Mpa；其余均与实施例1相同。
本实施例的多糖提取率为4.65％，多糖的的提取产量93.0mg。
实施例3木姜叶柯茶叶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中采用高压提取时的料液比是1:20，提取时间是40min，提取压力是0.02Mpa；其余均与实施例1相同。
经过检测，本实施例的提取率3.29％，多糖的提取产量65.8mg。
实施例4木姜叶柯茶叶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中采用高压提取时的料液比是1:30，提取时间是40min，提取压力是0.06Mpa；其余均与实施例1相同。
经过检测，本实施例的多糖提取率3.96％，多糖的提取产量79.2mg。
实施例5木姜叶柯茶叶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中采用高压提取时的料液比是1:40，提取时间是40min，提取压力是0.06Mpa；其余均与实施例1相同。
经过检测，本实施例的多糖提取率3.82％，多糖的提取产量76.4mg。
实施例6木姜叶柯茶叶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中采用高压提取时的料液比是1:20，提取时间是50min，提取压力是0.06Mpa；其余均与实施例1相同。
经过检测，本实施例的多糖提取率为3.83％，多糖的提取产量为76.6mg。
实施例7木姜叶柯茶叶多糖的提取
与实施例1的区别在于：在步骤(3)中采用高压提取时的料液比是1:20，提取时间是20min，提取压力是0.06Mpa；其余均与实施例1相同。
经过检测，本实施例的多糖提取率为2.38％，多糖的提取产量为56.6mg。
试验例1木姜叶柯叶(甜茶)多糖的加压溶剂辅助提取工艺条件的优化试验
1.单因素多水平实验
根据实施例1的高效制备木姜叶柯叶(甜茶)多糖的加压溶剂辅助提取方法，筛选出3个影响木姜叶柯叶多糖提取率的因素，即：原料木姜叶柯叶粉与超纯水的的比例、提取时间和提取压力；以木姜叶柯叶多糖提取率为参考指标，进行单因素多水平实验。
1.1木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比的单因素实验
选取5个水平进行木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比的单因素实验：固定提取时间为40min、提取压力为0.06MPa，测量在木姜叶柯茶叶粉和超纯水的比例(g/ml)分别为1:10、1:20、1:30、1:40及1:50时木姜叶柯叶多糖的提取率。
木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比对木姜叶柯叶多糖提取率的影响如图2所示，从试验结果可以看出，当提取料液比为1:10时，木姜叶柯叶多糖的提取率仅为3.20％左右，当提取料液比为1:20时，木姜叶柯叶多糖的提取率达到了4.0％左右，随着提取料液比的增加，木姜叶柯叶多糖的提取率又呈现明显降低趋势，故最佳提取料液比为1:20。
1.2提取时间的单因素实验
选取5个水平进行提取时间的单因素实验：固定木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比为1:20(w/v)、提取压力为0.06MPa，测量在提取时间分别为20、30、40、50及60min时木姜叶柯叶多糖的提取率。
提取时间对木姜叶柯叶多糖提取率的影响如图3所示，根据该结果可以看出，随着提取时间的增加，木姜叶柯叶多糖的提取率呈上升的趋势，当提取时间为40min时，木姜叶柯叶多糖的提取率达到最大值。随后，木姜叶柯叶多糖提取率开始降低，故单因素试验确定的最佳提取时间为40min。
1.3提取压力的单因素实验
选取5个水平进行提取压力的单因素实验：固定木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比为1:20(w/v)、提取时间为40min，测量在提取压力分别为0.02、0.04、0.06、0.08及0.10MPa时木姜叶柯叶多糖的提取率。
提取压力对木姜叶柯叶多糖提取率的影响的试验结果为图4所示，根据图4可以看出，木姜叶柯叶多糖的提取率随提取压力的增加呈现先增加后降低的趋势，提取压力为0.08MPa时木姜叶柯叶多糖的提取率最高。故单因素试验确定的最佳提取压力为0.08MPa。
2.响应面分析试验
根据上述单因素多水平实验结果，以木姜叶柯茶叶粉和超纯水料液比(A)、提取时间(B)和提取压力(C)为自变量，以木姜叶柯叶多糖提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计法设计三因素三水平的响应面分析试验，响应面试验设计因素与水平如表1所示。
表1响应面试验设计因素与水平
根据Box-Behnke试验设计原理，利用响应面设计三因素三水平进一步优化木姜叶柯叶多糖提取的反应条件，实施17个试验点，其中12个分析因子，5个中心试验以估计误差。表2列出了响应面实验矩阵和实验数据。
表2响应面实验设计与结果
采用Design Expert 8.0.6对试验结果进行回归拟合分析生成二阶多项式方程，得到具有编码因子的最终方程如下：
Y＝4.55+0.17A+0.28B+0.29C+0.11AB+0.097AC+0.043BC-0.47A2-0.52B2-0.27C2
其中，Y是木姜叶柯叶多糖的提取率；A、B和C分别是提取的料液比(mL/g)、提取时间(min)和提取压力(MPa)。
表3回归方程方差分析
注：R2＝0.9982，R2adj＝0.9959，C.V.＝0.84％，adeq.precision＝55.135；
aA,料液比(mL/g)；B,提取时间(min)；C,提取压力(MPa)；b*显著差异(p<0.05)，**极显著差异(p<0.01)。
表3为回归模型的方差分析表，二次回归模型具有较高的F值(430.96)和较低的P值(P<0.0001)表明该模型的适用性非常显著。模型的决定系数R2＝0.9982，校正决定系数R2adj＝0.9959，证明该模型与实际实验过程具有较高的拟合度。因此，该回归模型具有可行性，可以利用该模型对木姜叶柯叶多糖提取率与单因素水平变化的关系以及数据波动进行预测。
在本实验中，当p<0.05时，表明该因素显著，当p<0.01时，表明该因素极显著。失拟项P值(0.0581，p>0.05)和F值(6.00)表明残差主要有随机误差组成，对优化结果的影响可以忽略不计。此外，C.V.(方程中Y的变异系数)值代表实验的置信度，C.V.值越大，表示实验可靠性低，本试验中C.V.＝0.84％，表明实验操作可信，具有足够的准确性和普遍适用性。此外，参数优化系数表明线性系数(A，B，C)，二次项(AA，BB，CC)和相互作用系数(AB，AC，BC)对木姜叶柯叶多糖的提取率有很大影响(p<0.05)。
图5、6、7显示了响应面预测结果的三维响应面图(3D)，图8、9、10显示了响应面预测结果的等高线图。通常，带有椭圆形轮廓图的响应面表明相应变量之间的相互作用是显著的，而圆形轮廓图表明相应变量之间的相互作用是不显著的。由图5-10可知，木姜叶柯茶叶粉和超纯水的料液比(A)和提取压力(C)、提取时间(B)和提取压力(C)之间的相互作用是显著的；尽管木姜叶柯茶叶粉和超纯水的料液比(A)和提取时间(B)的二维等高线图并不完全是椭圆形的，但很明显，由表3可知，木姜叶柯茶叶粉和超纯水的料液比(A)和提取时间(B)之间的相互作用同样是显著的。
根据上述步骤构建的回归模型，应用统计学软件Design-Expert 8.0.6对木姜叶柯叶(甜茶)多糖的加压溶剂辅助提取工艺进一步优化，结果显示，在以下最佳反应条件下可以得到最大提取率的木姜叶柯叶多糖：提取的料液比为24.08mL/g、提取时间为41.31min、提取压力为0.09MPa。木姜叶柯叶多糖提取率的预测值为4.67％。考虑实际操作，将以上条件调整为提取料液比24mL/g、提取时间为41min、提取压力为0.09MPa，在提取料液比为1：24(g：mL)、提取时间为41min、提取压力为0.09Mpa的条件下进行三次验证试验，测得木姜叶柯叶多糖提取率为4.65±0.12％，与理论预测值相差不大，说明Box-Behnken中心组合设计-响应面法优化后的加压溶剂辅助提取木姜叶柯叶多糖的工艺可行，可推广于产业应用。
