嵌段共聚物和由其形成的自组装纳米颗粒

嵌段共聚物和由其形成的自组装纳米颗粒

　　技术领域

　　本发明的主题涉及嵌段共聚物(BCP)，更特别地，涉及能够自组装成纳米颗粒的嵌段共聚物，所述纳米颗粒用于递送疏水性货物并在酸性和富含ROS环境(例如肿瘤和癌细胞的酸性内溶酶体区室)中触发药物释放，以及涉及此类嵌段共聚物和纳米颗粒的制造和用途。

　　背景技术

　　嵌段共聚物(BCP)包含两个或更多个共价连接的均聚物亚单元，每个均聚物亚单元由聚合的单体构成。由两个均聚物亚单元组成的嵌段共聚物称为二嵌段共聚物，具有三个均聚物亚单元的那些称为三嵌段共聚物等。在任何BCP中，均聚物单元的连接可以在一些情况下包括连接嵌段、非重复亚单元。

　　BCP可以使用许多技术形成，包括例如原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成断裂链转移(RAFT)和开环易位聚合(ROMP)，如本领域技术人员将理解的。

　　尽管BCP已经用于许多领域，但最近的兴趣是它们在包封和递送其它分子，包括药物中的用途。当用于这样的方法中时，使两亲性BCP形成胶束，其中包含待递送的分子。

　　聚合物基胶束提供了优于其它纳米载体如脂质体的若干优点。这些优点包括它们的小尺寸(10-100nm)、合理低的多分散性指数以及结合疏水核和亲水壳的能力。疏水核有利于装载疏水性货物，包括疏水性药物，而亲水壳提供在水性环境中的改善的稳定性。

　　身体组织和细胞组分具有不同的pH值。例如，血液和正常细胞外基质的pH为约7.4，而肿瘤细胞外环境的pH为约6.5，这归因于细胞间环境中较低的氧供应。核内体和溶酶体中的pH甚至更低(5.0-5.5)。

　　基于这种pH的差异，已经构建了一些基于聚合物的胶束以靶向肿瘤组织和肿瘤细胞。然而，这些方法存在各种缺陷，包括不良靶特异性和在靶位点的致死性药物释放。此外，已经发现，此类胶束必须在相对窄的尺寸范围内以在大多数应用中有效。例如，已经发现大于约100nm的颗粒不能有效地穿透大多数肿瘤的广泛脉管系统。同时，尺寸小于约10nm的胶束低于肾阈值，并且从肿瘤部位快速冲出并排泄。

　　发明内容

　　本公开提供了BCP及其制造和使用方法。

　　第一方面提供了一种嵌段共聚物，其包含：亲水嵌段；和含有至少一个硫醚官能团的疏水嵌段。

　　第二方面提供了一种形成嵌段共聚物的方法，所述方法包括：将包含聚(环氧乙烷)亲水嵌段和聚碳酸酯疏水嵌段的两亲性二嵌段共聚物溶解在溶剂中，所述聚碳酸酯疏水嵌段包括至少一个烯丙基官能团或炔丙基官能团；将聚合物溶液暴露于紫外辐射；向聚合物溶液中加入以下物质之一：一定量的3-巯基丙酸或一定量的1-(2-巯基乙基)-3-苯基脲；以及从聚合物溶液中沉淀酸官能化的二嵌段聚合物。

　　第三方面提供了形成胶束粒子的方法，所述方法包括：将治疗剂溶解在第一溶剂中；将至少一种嵌段共聚物溶解在第二溶剂中，所述嵌段共聚物包含：亲水嵌段；和含有至少一个选自以下的官能团的疏水嵌段：硫醚官能团；混合治疗剂溶液和嵌段共聚物溶液；以及将混合溶液加入水中。

　　第四方面提供了胶束粒子，其包含：亲水壳；和在所述亲水壳内的疏水核，其中所述亲水壳和所述疏水核由选自以下的至少一种嵌段共聚物形成：

　　具有式I结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中m为114且x为5；

　　具有式I结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中m为228且x为10；

　　具有式II结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中n为114且y为10；

　　具有式II结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中n为228且y为10；

　　具有式III结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中p为114且z为5；以及

　　具有式III结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中p为228且z为5。

　　第五方面提供了在需要此种治疗的个体中治疗适于用治疗剂治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括：向所述个体内部施用胶束粒子，其包含：疏水核；包围所述疏水核的亲水壳；和包含在所述疏水核内的一定量的治疗剂，其中所述亲水壳和所述疏水核由选自以下的至少一种嵌段共聚物形成：

　　具有式I结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中m为114且x为5；

　　具有式I结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中m为228且x为10；

　　具有式II结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中n为114且y为10；

　　具有式II结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中n为228且y为10；

　　具有式III结构的嵌段共聚物：

　　

　　

　　其中p为114且z为5；以及

　　具有式III结构的嵌段共聚物：

　　

　　其中p为228且z为5。

　　附图说明

　　从下面结合附图对本发明的各个方面的详细描述中，将更容易理解本发明的这些和其它特征，其中：

　　图1显示了根据本发明的各种实施方案的用于制造BCP的化学反应方案的示意图；

　　图2显示了在H2O2或NaOCl处理之前和之后，根据本发明的两种BCP的1H NMR光谱；

　　图3显示了响应于用过氧化氢处理本发明的BCP的胶束稳定性和流体动力学尺寸(插图)的图；

　　图4显示了响应于用过氧化氢处理本发明的另一种BCP的胶束尺寸的图；

　　图5A-D显示了使用本发明的两种BCP，过氧化氢对装载阿霉素的胶束尺寸和尺寸分布的影响的图；

　　图6显示了pH和过氧化氢对阿霉素从使用本发明的四种BCP形成的胶束中释放的影响的图；

　　图7显示了游离阿霉素与通过根据本发明的各种实施方案的混合胶束递送的阿霉素相比的体外细胞毒性的图；

　　图8显示了根据本发明的各种实施方案的未负载胶束的体外细胞毒性效应图；以及

　　图9显示了根据本发明的实施方案，阿霉素在小鼠中体内递送的放射照相图像。

　　附图不一定是按比例的。附图仅仅是示意性表示，而不是要描绘本发明的特定参数。附图仅旨在描述本发明的典型实施方案，因此不应被认为是对本发明范围的限制。在附图中，相同的标号表示相同的元件。

　　具体实施方式

　　申请人已经开发了一种能够自组装成纳米颗粒的新型嵌段共聚物(BCP)。这些纳米颗粒具有能够包封和运输疏水性货物的疏水核以及亲水冠或壳，其使得能够延长纳米颗粒的施用后循环以及疏水性货物的靶向溶解和释放。

　　更具体地说，申请人的BCP包括含有易受氧化影响的硫醚官能团的疏水嵌段。根据一些实施方案，疏水嵌段可进一步包括羧酸官能团。这些官能团的氧化将嵌段的溶解度从疏水性转化为亲水性，从而释放纳米颗粒的疏水性货物。

　　由本发明的BCP形成的纳米颗粒是可用于药物递送应用的纳米尺寸的胶束颗粒。在治疗剂(例如，药物化合物)存在下这些纳米颗粒的自组装导致形成"负载颗粒"，该"负载颗粒"包含通过非共价相互作用(例如，氢键结合、疏水相互作用)结合的BCP和治疗剂。

　　如本文所用，自组装BCP可以称为治疗剂的"载体"，而治疗剂本身称为"货物"。负载的颗粒能够将货物递送至靶细胞，穿过细胞膜，然后响应于pH的变化(例如，响应于遇到更酸性的内体环境或更酸性的肿瘤组织)和/或通过与能够氧化包括在BCP的疏水嵌段中的硫醚官能团的细胞内或细胞外氧化剂反应而在细胞内部或肿瘤组织内释放货物。

　　例如，申请人已经证明了使用本发明的BCP来开发肿瘤组织的增强的渗透性和保留效果(ERP)的能力，将治疗剂递送到肿瘤部位而不需要细胞表面上的配体受体。ERP效应涉及肿瘤组织的高血管密度和广泛外渗，其增强了癌血管对大分子的渗透性，同时还削弱了它们自间质间隙的清除。结果是大分子保留在肿瘤组织中。

　　然而，利用ERP效应要求大分子大于约10nm但不是远大于约100nm。较小的颗粒被迅速从肿瘤部位冲出并排泄。较大的颗粒在穿透肿瘤脉管系统方面是低效的。

　　将治疗剂直接递送至肿瘤部位的能力，例如通过使用本文所述的BCP，提供了许多显著的优点。这些包括控制试剂的生物分布的能力，从而减少副作用，以及增加试剂对靶细胞的暴露，这可以补偿试剂的可能相对短的半衰期。

　　本发明的BCP形成和维持含有治疗剂的胶束，然后在靶向位置选择性释放该治疗剂的能力提供了例如上述那些优点。

　　嵌段共聚物合成和胶束形成

　　为了实现治疗剂的这种选择性释放，本发明的BCP被设计成在疏水嵌段中具有可氧化的硫化物基团，特别是硫醚基团。在一些实施方案中，疏水嵌段可以进一步包括一个或多个羧酸官能团。

　　根据本发明的BCP可以使用有机催化开环聚合(OROP)方法制备，该方法使得能够在不使用在其它方法中常见的有毒金属的情况下，以高度控制的聚合度(DP)合成官能聚碳酸酯。形成非共价相互作用(例如氢键、离子和π-π相互作用)的官能团的引入使得能够产生足够小和足够稳定以利用肿瘤脉管系统的EPR效应的胶束载体。

　　本文所述的BCP可以是生物可降解的和/或生物相容的。术语"生物可降解的"由美国材料试验协会(ASTM)定义为经受由生物活性，尤其是酶促作用引起的降解，导致材料的化学结构的显著变化。如本文所用，如果材料根据ASTM D6400在180天内经历60％的生物降解，则其为"生物可降解的"。如果材料可通过酶催化的反应降解(例如解聚)，则其为"酶促生物可降解的"。

　　如本文所述，"生物相容的"材料是指在特定应用中能够与适当的宿主相适应的材料。

　　图1显示了合成根据本发明的实施方案的BCP的一般化学反应方案。这里，使用具有通过二价连接基团(-O-)连接到聚乙二醇(PEG)的聚(环氧乙烷)(PEG)嵌段和具有烯丙基官能团和炔丙基官能团的聚碳酸酯嵌段的两亲性二嵌段共聚物。图1中所示的反应的细节提供如下。

　　将两亲性二嵌段共聚物溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中，并用催化量的自由基引发剂2,2'-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和3-5当量之间的3-巯基丙酸或1-(2-巯基乙基)-3-苯基脲在254nm下进行UV照射2小时。然后将该溶液在冷醚中再沉淀以产生酸官能化的BCP。

　　实施例

　　实施例1酸和脲官能化的PEG-P(MTC-MAC)

　　将100mg(0.5mmol)5-甲基-5-烯丙氧基羰基-1,3-二氧杂环己-2-酮(MTC-MAC)加入到含有溶解在无水二氯甲烷(1mL)中的1-(3,5-双(三氟甲基)-苯基)-3-环己基-2-硫脲(TU)催化剂(9.25mg，0.025mmol)的反应小瓶中。在混合物中加入聚乙二醇(PEG)(250mg，0.025mmol，Mn 10,000g/mol，PDI 1.04)，然后加入1,8-二氮杂双环-[5,4,0]-十一碳-7-烯(DBU)(3.8μL，0.025mmol)，并在室温下搅拌约45分钟。

　　在反应结束时，加入过量的苯甲酸(5mg，0.04mmol)以淬灭催化剂。然后将粗聚合物在冷醚中沉淀两次，倾析出上清液，以89％的收率得到松散的白色粉末状固体。

　　酸官能化

　　将200mg(0.22mmol烯烃)PEG-P(MTC-MAC)聚合物溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(1mL)中，然后加入3-巯基丙酸(57μL，0.66mmol)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(2.8mg，0.011mmol)并混合。

　　将混合物在254nm下照射两小时，然后在冷醚中沉淀两次，倾析出上清液，以93％的收率得到粘性的白色粉末状固体。

　　脲官能化

　　将1-(2-巯基乙基)-3-苯基脲(216mg，1.1mmol)溶于无水DMF中，然后加入PEG-P(MTC-MAC)(200mg，0.22mmol烯烃)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(2.8mg，0.011mmol)并混合。

　　将混合物在254nm下照射两小时，然后通过在LH-20柱上用甲醇作为洗脱剂的柱色谱法纯化，以82％的收率得到纯白色结晶固体。

　　实施例2-酸官能化的PEG-P(MTC-MPC)

　　将99mg(0.5mmol)5-甲基-5-炔丙氧基羰基-1,3-二氧杂环己-2-酮(MTC-MPC)加入到含有溶解在无水二氯甲烷(1mL)中的TU催化剂(9.25mg，0.025mmol)的反应小瓶中。在混合物中加入PEG(500mg，0.05mmol，Mn 10,000g/mol，PDI 1.04)，然后加入DBU(3.8μL，0.025mmol)，并在室温下搅拌约45分钟。

　　在反应结束时，加入过量的苯甲酸(5mg，0.04mmol)以淬灭催化剂。然后将粗聚合物在冷醚中沉淀两次，倾析出上清液，以89％的收率得到白色粉末状固体。

　　酸官能化

　　将198mg(0.12mmol炔烃)PEG-P(MTC-MPC)溶解在无水DMF中，然后加入3-巯基丙酸(114μL，1.3mmol)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(1.7mg，0.007mmol)并混合。

　　将混合物在254nm下照射两小时，在冷醚中沉淀两次，倾析出上清液，以93％的收率得到粘性白色粉末状固体。

　　这些BCP在这里和图1中表示为5U5、10U10、5S10、10S10、5D5和10D5，取决于PEG和聚碳酸酯嵌段的长度-其各自包括在酸性或高度氧化环境中易受氧化的硫化物基团(在图1中圈出)。这些基团的氧化将聚碳酸酯嵌段从疏水性改变为亲水性，从而自胶束核释放疏水性货物。

　　根据图1的合成方案和上述实施例合成了许多PEG/酸和脲官能化的含硫醚的聚碳酸酯二嵌段共聚物。这些聚合物用于形成具有疏水核和亲水壳的混合胶束。在疏水性治疗剂存在下自组装成此类胶束导致将治疗剂装载到核中，从而允许治疗剂受保护地运输到靶位点。

　　疏水嵌段的长度从五至15个碳酸酯单体变化。这提供了足够长的疏水嵌段以促进自组装，但其不会在水中引起沉淀。如本领域技术人员将理解的，所用的聚合度(DP)将取决于例如待递送的治疗剂的大小和类型。

　　在本文所述的实施例中，所用的治疗剂是阿霉素(DOX)。然而，如本领域技术人员所知的，可以使用其它试剂。DOX的使用仅仅是为了说明的目的，不应被看作是对本发明范围的限制。

　　在本文所述的实施例中，负载DOX的胶束的制备通常按照以下所述的程序。

　　载DOX胶束制备

　　用3摩尔过量的三乙胺中和DOX(5mg)，并将其溶解在1.5mLN，N-二甲基乙酰胺(DMAc)中。将10mg聚合物溶解在0.5mL DMAc中，并通过涡旋与DOX溶液混合，然后将DOX和聚合物溶液滴加到10mL去离子水中，同时使用基于探针的超声波仪在130W下超声两分钟。

　　然后使用截留分子量(MWCO)为1000Da的透析袋，在3小时、6小时和第二天再次改变水的条件下，将溶液针对1L去离子水进行透析。在48小时时收集透析袋内的溶液并冻干两天。所有实验一式三份进行。

　　将已知量的负载DOX的胶束溶解在1mL二甲亚砜(DMSO)中。使用UV-Vis分光计在480nm处测量溶液的吸光度以测定DOX含量。在1-100mg/L范围内构建标准线，针对DMSO中DOX浓度线性绘制的480nm处吸光度的r2值至少为0.99。DOX负载水平根据以下等式1确定。

　　等式1

　　

　　以下表1和2显示了根据本发明实施方案制备的各种BCP的性质(表1)，然后将其用于形成负载DOX的胶束(表1)或负载DOX的混合胶束(表2)。酸官能化BCP中引入酸基团以促进DOX负载。脲官能化BCP中的苄基团环通过π-π堆积有助于DOX的稳定包装，并提供更刚性的疏水性胶束核。脲基通过与羧酸基团或与其它脲基形成氢键而使胶束稳定化。

　　表1

　　

　　

　　如表1中所示，酸官能化胶束具有高DOX负载能力。尽管在水中形成小胶束，但由于在DOX负载后形成聚集体，酸官能化的聚合物导致纳米颗粒接近或大于200nm。这大于利用EPR效应的体内肿瘤靶向所期望的，并且表明尽管长的疏水烷基链能够自组装，DOX的包封不是很有序。

　　表2

　　

　　

　　表2中所述的混合胶束的尺寸小于100nm，具有单峰尺寸分布，这使得它们更适合体内使用。20-27wt％的DOX负载量相当好，5KPEG混合胶束的DOX负载量大于10KPEG混合胶束(即MM5S对MM10S，MM5D对MM10D)。后一观察结果可归因于5KPEG BCP的相对较高的疏水嵌段。

　　还值得注意的事实是，BCP的羧酸基团与DOX上的伯胺基团形成静电相互作用。当酸基团的数目固定时，获得了相似的药物负载水平(即，MM5S对MM5D，MM10S对MM10D)。

　　表2的冻干的负载DOX的混合胶束易于分散在水中，而不使用冷冻保护剂。胶束的粒径接近冻干前的尺寸。

　　为了适合体内使用，胶束必须在血清存在下稳定。血清蛋白结合可导致免疫系统的识别、调理作用和网状内皮系统的去除。表2的负载DOX的胶束的尺寸在采用10％血清温育48小时后没有显著变化。

　　此外，既没有观察到沉淀也没有观察到聚集。这可归因于胶束的PEG冠，其中分子量大于1000的PEG随机地和短暂地捕获水分子。这种捕获产生了排除体积，其阻止血清蛋白的紧密接近。

　　通过活性氧(ROS)的氧化

　　硫化物在强氧化剂的存在下氧化成亚砜和砜。图2显示了在H2O2或NaOCl处理(37℃下4小时)之前和之后，10S5(上图)和10U10(下图)聚合物(15mg溶解于水中)的1H NMR谱。在信号中观察到的低场位移表示与原始硫化物基团相邻的质子。图2显示了浓度依赖性的氧化和摩尔当量。

　　如图2的上图所示，在10S5聚合物中，用10当量的10mM H2O2处理仅导致与硫相邻的一些质子发生低场位移，表明硫化物基团仅部分氧化。当过氧化氢浓度为100mM时，硫化物基团被完全氧化。

　　相比之下，如图2的下图中可见，当10U10聚合物与1当量的13.3mM(1000ppm)NaOCl一起温育时，与硫相邻的质子向低场移动至远大的程度。这可归因于过氧化氢需要较高的活化能，导致较慢的氧化率。

　　为了测试对纳米颗粒的氧化作用，将根据本发明的聚合物溶解在水中以形成空白胶束。然后向聚合物溶液掺入过氧化氢。图3显示了关于10S10聚合物的结果。可以看出，10S10胶束在加入过氧化氢时显示出平均散射光强度的稳定下降。这表明胶束稳定性的扰动。同时，流体动力学尺寸(见图3插图)和相应的多分散性指数增加，表明聚合物亲水性的增加破坏了胶束自组装所需的亲水/疏水。

　　对于采用脲官能化的10U10聚合物形成的胶束，观察到类似的平均散射光强度的降低，尽管其速率低得多，如图4中所示。与10S10胶束相比，氧化后仅观察到流体动力学尺寸的轻微变化。这可归因于以下事实，即脲基可以在胶束核内在其自身之间形成强氢键，从而减缓氧化过程。此外，亚砜键亲水性的增加可能不能破坏脲/脲氢键相互作用。

　　对表2中的MM10S和MM5D负载DOX的混合胶束进行类似的处理，其结果示于图5A-D中。可以看出，对于两种胶束，在用过氧化氢攻击后观察到流体动力学尺寸变化。增加的过氧化氢浓度导致粒径和尺寸分布的更大变化。

　　体外药物释放

　　将冻干的负载DOX的胶束以1mg/mL的浓度溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中，并放入MWCO为1000Da的透析袋中。然后将袋浸入37℃水浴中的含有30mL PBS(pH7.4)的瓶中，同时以100转/分钟振荡。

　　在选定的时间点从透析袋外部的本体溶液中取出样品(1mL)，并用1mL新鲜PBS替换。使用UV-Vis分光光度计在480nm处测定溶液中DOX的吸光度，并使用PBS(pH7.4)中DOX的校准线计算DOX含量。构建不同时间点的校准曲线以解决溶液中DOX的摩尔衰减系数随时间降低的问题。

　　在pH 5.0和过氧化氢存在下进行类似的研究。这些研究的组合结果在图6的四个图中示出。可以看出，使用任何混合胶束都没有明显的DOX释放的初始突释。包封的DOX以持续的方式经八小时释放。八小时后，由于较低的浓度梯度，释放速率不显著。

　　使用5K PEG和10K PEG的胶束之间的释放速率也没有显著差异。虽然可预期较小的纳米颗粒由于其较高的表面积与体积比而将显示较快的释放速率，但这里流体动力学尺寸的10-20nm的差异可能不足以显著以导致扩散速率的差异。

　　对于MM5S和MM5D胶束，DOX在pH 5.0下比在pH 7.4下释放更快，并在过氧化氢存在时在pH 5.0下释放更快。从图6中可以看出，对于pH 7.4、pH 5.0和100mM过氧化氢存在时的pH5.0，DOX自MM5D的最终累积释放分别为42％、55％和72％。

　　在较低pH下较快的DOX释放是由于DOX中质子化基团的数目改变以及引入到聚碳酸酯上的羧酸。在pH 5.0时，酸和氨基都变得更为质子化。结果，使DOX保持在聚合物上的初始静电相互作用减弱。此外，质子化DOX更易溶于水，并且在浓度梯度存在下能更快地扩散出胶束核。

　　类似地，DOX自MM10S和MM10D胶束的释放在pH 5.0时比在pH 7.4时更快。然而，尽管图6中未示出，申请人发现过氧化氢对DOX释放速率没有影响。这可归因于较长的脲官能化聚碳酸酯稳定了胶束并防止它们解离。

　　体外细胞毒性

　　为了研究游离DOX、空白胶束和负载DOX的胶束的细胞毒性，将PC-3细胞(一种雄激素非依赖性人前列腺癌细胞系)以每孔2500个细胞的密度接种至96孔CellTiter-Blue测定板上，并在培养箱中在37℃下在5％CO2中放置过夜。

　　将游离DOX、聚合物和冻干的负载DOX的胶束以各种浓度溶解在细胞培养基中。使用100μL制备的溶液代替每个孔中的培养基。对于每个样品的一个浓度测试六个重复。将板温育72小时。

　　加入100μL新鲜生长培养基和20μL CellTiter-Blue试剂以替换每个孔中的样品溶液，并将板在培养箱中保持四小时。短暂地摇动板，并用微量培养板读数器记录每个孔的吸光度读数。计算每个孔中试卤灵的吸光度，为570nm处的吸光度减去刃天青在600nm处的吸光度。将细胞活力配制为未处理的对照细胞的吸光度的百分比。

　　这些研究的结果示于图7和8中。尽管已知PC-3细胞系对DOX表现出一定程度的耐药性，但当通过混合胶束递送时IC50降低。与MM5S和MM5D胶束相比，由较长的脲官能化聚碳酸酯制得的MM10S和MM10D胶束显示出更低的细胞毒性。这可归因于MM5S和MM5D通过氧化更有效的解离，增强DOX释放，从而产生更大的细胞毒性。空白胶束未显示出显著的细胞毒性(图8)，表明在负载DOX的胶束中观察到的细胞毒性可归因于包封的DOX。

　　荷瘤小鼠中混合胶束的生物分布

　　为了测试本发明胶束的生物分布，将近红外荧光团DiR包封在MM5D胶束中，并通过尾静脉内注射施用于具有皮下PC-3肿瘤的裸BALB/c小鼠。通过在七天内的不同时间点进行全身活体成像研究荧光团的体内实时生物分布。等量的游离DiR类似地施用于对照组小鼠。

　　DiR负载胶束的制备

　　DiR在MM5D胶束中的负载是根据上述DOX负载方案进行。简言之，将聚合物(10mg)和DiR(0.3mg)溶解在DMSO(2mL)中，并将混合物用滴管逐滴加入10mL去离子水中，超声处理10分钟。将溶液针对去离子水透析48小时，在3小时、6小时和24小时处变化水。DiR的负载水平通过将已知量的冻干的负载DiR的胶束溶解于DMSO中并测量其在759nm处的吸光度来证明。

　　动物模型的制备和DiR使用

　　将悬浮在Matrigel(1:1比例)中的PC-3细胞(5×106)皮下注射(200μL)入雄性BALB/c小鼠的右胁。注射后五周，当肿瘤直径达到5-7mm时，通过尾静脉注射用8mg/kg DiR负载的混合胶束或等量的游离DiR处理小鼠。

　　在施用后30分钟至7天范围内的时间点，使用具有ICG滤器的Xenogen IVIS100(激发710-760nm，810-875nm处发射)获取全身荧光图像。将麻醉的动物(对于胶束制剂n＝3，对于游离DiR n＝2)置于加热板(37℃)上的一个侧向位置以采集图像，曝光时间设置为2秒。在施用后7天后从处死的小鼠中取出肿瘤和器官，然后成像。

　　如图9中可见，施用30分钟内，由于胶束在血流中的广泛循环，在全身检测到DiR荧光信号。24小时后，游离DiR和胶束包封DiR之间的对比变得明显，胶束包封DiR更广泛地分布于全身，游离DiR强烈地集中于肝脏中。这表明注射后游离DiR从血液中快速消除，并且本发明的胶束能够通过增加经包封治疗剂的循环时间而改善肿瘤治疗。

　　注射后48小时，与游离DiR相比，胶束包封DiR的DiR信号强度显著更大。而且，来自胶束包封DiR的信号集中在皮下肿瘤的区域。在施用游离DiR的小鼠肿瘤中几乎没有或没有观察到信号。

　　如图9中可见，施用DiR包封MM5D胶束的小鼠在肿瘤中显示最强的信号，在肝、脾和肾中显示较弱的信号。在这些动物的心脏和肺中检测到很少的信号或未检测到信号。另一方面，施用游离DiR的小鼠在肺、肝和脾中显示最强的信号，在肿瘤中具有很少信号或没有信号。

　　在上述本发明的实施方案中，描述了各种组分，本领域技术人员将认识到这些组分是可以在实践本发明时采用的更宽泛组的示例或说明。因此，上述实施方案仅意在说明可以实施本发明的许多方式中的一些，而无意于以任何方式限制本发明的范围。

　　例如，尽管注意到二氯甲烷作为根据本发明的一些方面或实施方案而使用的溶剂，但是本领域技术人员将认识到，可以类似地使用其它溶剂，例如氯仿、苯、甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯、三氟甲苯、石油醚、乙腈、戊烷、己烷、庚烷、2,2,4-三甲基戊烷、环己烷、二乙醚、叔丁基甲基醚、二异丙醚、二噁烷、四氢呋喃、或其组合或混合物。

　　类似地，尽管注意到DMF作为根据上述本发明的一些方面或实施方案而使用的有机溶剂，但是合适的替代溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、叔丁基醇、丙酮、2-丁酮、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚、二乙醚、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙二醇、甘油、二甲亚砜、乙酸、四氢呋喃和二噁烷。

　　例如，用于实施本发明的治疗剂可以是能够与BCP形成可逆复合物并诱导所需医学反应的任何试剂。这些包括但不限于DNA、核苷酸、基因、肽、蛋白质、酶、脂质、磷脂、天然或合成的有机化合物(例如药物、染料、合成聚合物、低聚物、氨基酸)、无机材料(例如金属和金属氧化物)、前述的放射性变体和前述的组合。

　　在实施本发明时可以用作治疗剂的药物包括：13-顺式视黄酸、2-CdA(克拉屈滨)、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶)、5-FU(氟尿嘧啶)、6-巯基嘌呤、6-MP(6-巯基嘌呤)、6-TG(硫鸟嘌呤)、6-硫鸟嘌呤(硫鸟嘌呤)、(紫杉醇蛋白结合物)、(异视黄醇)、放线菌素-D(更生霉素)、(阿霉素)、(氟尿嘧啶)、(依维莫司)、(阿那格雷)、(氢化可的松)、阿地白介素、阿仑单抗、(培美曲塞)、阿利维甲酸(9-顺式视黄酸)、Alkaban-AQ(长春碱)、(美法仑)、全反式维甲酸(Tretinoin)、α干扰素(干扰素α)、六甲蜜胺、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、氨磷汀、氨鲁米特、阿那格雷、(尼鲁米特)、阿那曲唑、阿拉伯糖胞嘧啶(阿糖胞苷)、Ara-C(阿糖胞苷)、(达依泊汀α)、(帕米膦酸盐)、(阿那曲唑)、(依西美坦)、(奈拉滨)、三氧化二砷、门冬酰胺酶、ATRA(全反式维甲酸)、(贝伐单抗)、阿扎胞苷、BCG、BCNU(卡莫司汀)、苯达莫司汀(盐酸苯达莫司汀)、贝伐单抗、贝沙罗汀、(托西莫单抗)、比卡鲁胺、(卡莫司汀)、(博来霉素)、博来霉素、硼替佐米、白消安、(白消安)、C225(西妥昔单抗)、甲酰四氢叶酸钙(甲酰四氢叶酸)、(阿仑单抗)、(伊立替康)、喜树碱-11(伊立替康)、卡培他滨、(氟尿嘧啶)、卡铂、卡莫司汀、卡莫司汀晶片、(比卡鲁胺)、CC-5013(来那度胺)、CCI-779(替莫罗莫司)、CCNU(洛莫司汀)、CDDP(顺铂)、(洛莫司汀)、(道诺霉素)、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、嗜橙菌因子(甲酰四氢叶酸)、克拉屈滨、可的松(氢化可的松)、(更生霉素)、CPT-11(伊立替康)、环磷酰胺、(氨鲁米特)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体、(阿糖胞苷)、(环磷酰胺)、达卡巴嗪、(地西他滨)、更生霉素、达依泊汀α、达沙替尼、道诺霉素、柔红霉素、盐酸柔红霉素、柔红霉素脂质体、(柔红霉素脂质体)、DECADRONTM(地塞米松)、地西他滨、DELTA-(泼尼松龙)、(泼尼松)、DenileukinDiftitox、(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、(地塞米松)、右雷佐生、DHAD(米托蒽醌)、DIC(达卡巴嗪)、(地塞米松)、多西他赛、(阿霉素脂质体)、阿霉素、阿霉素脂质体、(羟基脲)、DTIC(达卡巴嗪)、DTIC-(氮烯咪胺)、Duralone(甲泼尼龙)、(氟尿嘧啶)、(亮丙瑞林)、(表阿霉素)、(奥沙利铂)、(门冬酰胺酶)、(雌莫司汀)、表阿霉素、阿法依泊汀、(西妥昔单抗)、厄洛替尼、欧文氏菌L-天冬酰胺酶(门冬酰胺酶)、雌莫司汀、(氨磷汀)、(依托泊苷)、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯、(氟他胺)、依维莫司、(雷洛昔芬)、依西美坦、(托瑞米芬)、(氟司特芬)、(来曲唑)、非格司亭、氟尿苷、(氟达拉滨)、氟达拉滨、(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、氟尿嘧啶(乳膏)、氟甲睾酮、氟他米特、亚叶酸(甲酰四氢叶酸)、(氟尿苷)、氟维西汀、G-CSF(培非格司亭)、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、(吉西他滨)、(伊马替尼甲磺酸盐)、晶片(卡莫司汀晶片)、GM-CSF(沙格司亭)、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子(培非格司亭)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(沙格司亭)、(氟甲睾酮)、(曲妥珠单抗)、(地塞米松)、(六甲蜜胺)、六甲三聚氰胺(六甲蜜胺)、HMM(六甲蜜胺)、(拓扑替康)、(羟基脲)、醋酸氢化可的松(氢化可的松)、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸盐(氢化可的松)、羟基脲、依贝妥单抗、替伊莫单抗(依贝妥单抗)、(伊达比星)、伊达比星、(异环磷酰胺)、IFN-α(干扰素-α)、异环磷酰胺、IL-11(奥普瑞白介素)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、咪唑羧酰胺(氮烯咪胺)、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、白介素-2(阿地白介素)、白介素-11(奥普瑞白介素)、A(干扰素α-2b)、(吉非替尼)、伊立替康、异维A酸、伊沙匹隆、(伊沙匹隆)、天冬酰胺酶(门冬酰胺酶)、(氢化可的松)、拉帕替尼、L-天冬酰胺酶、LCR(长春新碱)、来那度胺、来曲唑、甲酰四氢叶酸、(苯丁酸氮芥)、(沙格司亭)、亮丙瑞林、长春新碱(长春新碱)、(克拉屈滨)、阿糖胞苷脂质体、LIQUID(泼尼松)、洛莫司汀、L-PAM(美法仑)、左旋溶肉瘤素(美法仑)、(亮丙瑞林)、LUPRON(亮丙瑞林)、(丙卡巴肼)、(地塞米松)、氮芥、盐酸氮芥、Medralone(甲基强的松龙)、(甲泼尼龙)、(甲地孕酮)、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮(甲地孕酮)、美法仑、巯基嘌呤(6-巯基嘌呤)、美司钠、(美司钠)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠(甲氨蝶呤)、甲泼尼龙、(泼尼松)、丝裂霉素(丝裂霉素C)、丝裂霉素-C、米托蒽醌、M-Prednisol(甲泼尼龙)、MTC(丝裂霉素-C)、MTX(甲氨蝶呤)、(氮芥)、氮介(氮芥)、(丝裂霉素-C)、(白消安)、(羟基脲)、(吉妥单抗)、(长春瑞滨)、奈拉滨、(环磷酰胺)、(培非格司亭)、(奥普瑞白介素)、(非格司亭)、(索拉非尼)、(尼鲁米特)、尼鲁米特、(喷司他丁)、氮芥子气(氮芥)、(他莫昔芬)、(米托蒽醌)、奥曲肽、醋酸奥曲肽(奥曲肽)、(培门冬酶)、(长春新碱)、(Denileukin Diftitox)、(紫杉醇)、奥普瑞白介素(白介素-11)、(泼尼松龙)、(泼尼松)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇蛋白结合物、帕米膦酸盐、帕尼单抗、(阿利维甲酸)、(卡铂)、(泼尼松龙)、PEG干扰素、培加帕酶、培非格司亭、(干扰素α-2b)、PEG-L-门冬酰胺酶、培美曲塞、喷司他丁、苯丙氨酸氮芥(美法仑)、(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、泼尼松龙、泼尼松、(泼尼松龙)、丙卡巴肼、(阿法依伯汀)、(阿地白介素)、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan20(卡莫司汀晶片)、(6-巯基嘌呤)、雷诺昔芬、(来那度胺)、RHEUMA(甲氨蝶呤)、(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、Roferon-A(干扰素α-2a)、(阿霉素)、盐酸卢比霉素(柔红霉素)、(奥曲肽)、SANDOSTATIN(奥曲肽)、沙格司亭、(氢化可的松)、(甲泼尼龙)、索拉非尼、(达沙替尼)、STI-571(甲磺酸伊马替尼)、链佐星、SU11248(舒尼替尼)、舒尼替尼、(舒尼替尼)、他莫昔芬、(厄洛替尼)、(贝沙罗汀)、(紫杉醇)、(多西他赛)、(替莫唑胺)、替莫唑胺、西罗莫司、替尼泊苷、TESPA(噻替派)、沙利度胺、(沙利度胺)、(BCG)、硫鸟嘌呤、硫鸟嘌呤Tabloid(硫鸟嘌呤)、硫代磷酰胺(噻替派)、(BCG)、(依托泊苷)、拓扑替康、托瑞米芬、(西罗莫司)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、(盐酸苯达莫司汀)、维甲酸、(甲氨蝶呤)、(三氧化二砷)、TSPA(噻替派)、(拉帕替尼)、VCR(长春新碱)、(帕尼单抗)、(长春碱)、(硼替佐米)、(依托泊苷)、(维甲酸)、(亮丙瑞林)、(阿扎胞苷)、长春碱、硫酸长春碱、VINCASAR(长春新碱)、长春新碱、长春新碱、酒石酸长春新碱(长春新碱)、VLB(长春碱)、VM-26(替尼泊苷)、伏立诺他、VP-16(依托泊苷)、(替尼泊苷)、(卡培他滨)、(链霉菌素)、(替伊莫单抗)、(右雷佐生)、(戈塞瑞林)、唑来膦酸、(伏立诺他)和(唑来膦酸)。

　　根据本发明的负载胶束的施用将通常通过静脉内注射，但也可以通过肠胃外或肌内或皮下施用。如本领域技术人员所理解的，具体的施用途径和方法将部分取决于待施用的治疗剂和待治疗的疾病或病症。

　　本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而非限制本发明。如本文所使用的，单数形式"一"、"一个"和"该"旨在也包括复数形式，除非上下文另有清楚指示。还将理解，术语"包括"和/或"包含"在本说明书中使用时，指定所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、组分和/或其群组的存在或添加。当使用范围来表示使用两个数值限X和Y的可能值(例如，X ppm至Yppm的浓度)时，除非另有说明，该值可以是X、Y或X和Y之间的任何数。

　　已经出于说明和描述的目的给出了本发明的描述，但是该描述并非旨在是穷举的或者将本发明限制为所公开的形式。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，许多修改和变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。选择和描述实施方案是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，并且使本领域的其他普通技术人员能够理解本发明。