从茉莉小皮伞菌株中提取香料的方法及提取的香料在烟草中的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及从茉莉小皮伞菌株中提取香料的方法及提取的香料在烟草中的用途。
背景技术
香味是能够愉悦身心、舒缓压力、改善情绪，对香味的应用已经渗入生活的各个方面，例如，食品、畜牧业、日用化妆品行业、医药行业等等。由此，香味物质的开发是一个值得被深入研究的方向。
如今香味物质的来源主要有三个方面，一方面来自芳香植物中的挥发性成分，从植物中进行提取；另一方面从具有产香功能的酵母菌、霉菌等真菌中直接获取香味成分或以生物转化的方法间接获得；第三通过化学途径实现，利用化学试剂进行人工合成的方法直接得到高纯度的香味物质。而能产香的新植物来源很有限，且植物培育周期长，香精产量低。而利用天然芳香成分作为参照物,人工合成新香料的路径具有较高的技术要求，工艺复杂，危险性高。所以利用产香微生物的生物发酵技术，通过分离纯化等技术获得香味物质的方法，因其具有高效、绿色、环保等特性，得到越来愈多的关注。
发明内容
本发明提供从新发现的茉莉小皮伞(Marasmius%20jasminodorus)菌株提取香料的方法，该菌株为最新发现，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏号CGMCC17072；其来源标本保存于中国科学院微生物研究所菌物标本馆，馆藏号为HMAS279932。从上述茉莉小皮伞提取的香料用于烟草中也是本发明保护的范围。
本发明提供一种鉴定香味菌株及其挥发性产物提取与分析的方法。
本发明提供的方法包括如下步骤：采用单孢分离法从香味菌的子实体上分离菌种，使用麦芽糖酵母粉液体培养基扩大培养菌丝，将菌丝经液体发酵、固相萃取和洗脱，得到主要呈香化合物的洗脱液，除去溶剂即得到所述香料。
本发明的技术方案如下：
本发明第一方面公开了从茉莉小皮伞菌株中提取香料的方法，包括如下步骤：
(1)从茉莉小皮伞菌株平板中取菌块接入装有液体培养基的培养容器中进行恒温培养；
(2)将步骤(1)得到的培养液过滤得到液体成分，然后将液体成分通过吸附材料进行提取与富集；
(3)用溶剂对步骤(2)的吸附材料进行洗脱，即得到含有所述香料的洗脱液；
(4)将步骤(3)的洗脱液溶剂除去得到所述香料。
优选地，步骤(1)所述的液体培养基为麦芽糖酵母粉液体培养基，所述麦芽糖酵母粉液体培养基的包括以下成分：20g麦芽糖、3g酵母粉、3g%20KH2PO4、0.01g%20VB1和1000ml水。
优选地，步骤(2)所述吸附材料为大孔树脂HP20。
优选地，步骤(3)所述溶剂为无水乙醇。
优选地，步骤(1)所述培养的条件为25-30℃，培养7-12天。
优选地，步骤(1)所述培养为将培养容器放置在摇床中，所述摇床的转速150-200r/min。
本发明第二方面公开所述的方法提取的香料用于提高烟草的烟香丰富性和香气韵调的用途
本发明的有益效果：
1、茉莉小皮伞的子实体较小，且菌盖部分较薄，普通的组织分离方法难以获得相对无菌的组织块进行培养。所以本发明采用单孢分离的方法通过单个孢子的萌发得到菌株，且孢子萌发的过程具有一定的随机性，不易获得菌株。
2、通过对野生菌的形态学和基于真菌通用条形码基因ITS序列的分子生物学分析，鉴定该菌为茉莉小皮伞(Marasmius%20jasminodorus)，该菌在子实体和菌丝形态下均具有浓郁的花香气，香味独特。
2、本发明首次从茉莉小皮伞子实体上分离培养，得到茉莉小皮伞菌株，并且从茉莉小皮伞菌株中提取香料，该香料为无色油状液体。提取方法简单，易于实现。
3、本发明选择的培养基为麦芽糖酵母粉液体培养基，使用此培养基可以促进茉莉小皮伞生长，使茉莉小皮伞的香味更浓郁，检测到更多的香味成分。培养基原料廉价易得，操作方便。
4、本发明从茉莉小皮伞菌株中提取香料，所用菌株易于保存、活化和发酵，来源丰富，成本低廉。
具体实施方式
下面的实施例体现了本发明描述的过程，但本发明并不局限于这些实例。
实施例1：香料的提取
将野外采集的茉莉小皮伞子实体，在酒精灯火焰附近取菌盖部分置于无菌的培养皿中，菌褶朝下菌盖朝上。静置过夜后取出菌盖，培养皿中获得到担孢子。使用少量无菌水冲洗培养皿上的担孢子，得到孢子悬液。通过配制不同的孢子悬液浓度梯度，获得浓度适宜的被稀释后的孢子悬液，并涂布到固体平板中，25℃避光培养，定时复检，挑取孢子萌发后的菌丝至其他培养皿中，纯化后即获得相关菌株。
使用麦芽糖酵母粉液体培养基(组成为：20g麦芽糖、3g酵母粉、3g%20KH2PO4、0.01gVB1和1000ml水)扩大培养菌丝。用250ml锥形瓶配制液体培养基，接液量约为125ml。在超净台中，用灭过菌的手术刀从原始平板中切下约0.5cm长满菌丝的菌块(每个培养瓶中接10块菌块)，接入新的培养液中，培养瓶将放入摇床，调节温度为25℃，转速150r/min培养10天。
将得到的培养液进行过滤得到液体，以大孔树脂HP20为吸附材料进行固相萃取，对香味成分进行初步提取与富集；用无水乙醇对大孔树脂HP20进行洗脱，得到含有香味成分的乙醇洗脱液，除去无水乙醇即得到香料物质。
实施例2：得到的香料应用于烟草中
将实施例1得到香料与与凝胶基质进行复配，添加量以100g香料/KG载香凝胶计，以未添加所述香料的载香凝胶作为对照样。然后载香凝胶以1.5mg/mm的添加量在卷烟滤棒成型时进行施加。
感官评价结果表明，相对于未添加对照样，添加所述香料卷烟具有明显的清香香韵，香气风格中的烤烟烟香、花香、清香和甜香等指标改善明显，烟香丰富性和香气韵调明显提升。品质特征方面：口腔刺激和干燥感、烟气细腻度和烟气浓度相比于对照卷烟有所改善，香气质提升，韵调谐调均衡，回味舒适。
采用YC/T%20497-2014《卷烟中式卷烟感官评价方法》进行感官对比指标定量评价，以未添加茉莉小皮伞香料的载香凝胶卷烟作为对照样，结果如表1所示。
表1空白对照样与试验卷烟风格感官评吸数据
