一种许氏平鲉种群的鉴别方法
技术领域
本发明属于海洋资源保护领域，具体涉及一种许氏平鲉种群的鉴别方法。
背景技术
许氏平鲉(Sebastes schlegelii Hilgendorf，1880)属鲉形目、鲉科、平鲉属，俗称黑鲪、黑头等，系中国北方近海习见冷温性底层经济鱼类，主要分布于渤海、黄海和东海近海。许氏平鲉营半定居性生活，不做长距离洄游，常栖息于近海岩礁地带及海藻丛生的海区、洞穴中。近年来开展的许氏平鲉资源增殖放流，避免了捕捞过度和渔场环境变化造成的许氏平鲉资源衰退，增加了其种群多样性。
鱼类形态学是种群或群体判别的重要依据。传统方法中，基于对鱼体的形态学测量及外形特征等建立了一系列判别方法。然而由于鱼体形态和其生理情况和发育阶段关系密切，其中存在很大的变异性；不同种群间一些可数的外形性状存在交叉。与传统方法相比，分子生物学方法从遗传和生化角度更精确的分析鱼类的种群结构，不过其在时间、资金和工作量的消耗上较大，对于标本的保存也有较高的要求，造成遗传学方法对于一些种群内不同生态群体的调查存在困难。
目前，以耳石为媒介进行信息分析已应用于鱼类生态学研究，耳石形态分析方法具有操作可重复性、样品保存方便、受外界环境影响小等优点，在种内、种间鉴别方面具有明显优势。耳石是内耳中碳酸钙的结晶体，存在于硬骨鱼类内耳的膜迷路内。耳石有微耳石、矢耳石和星耳石之分。耳石的摘取特别是获得洁净易读的样本在分析中显得尤其重要。然而，实际工作中尤其是野外工作中，耳石的采集及保存尤为重要。从活鱼或腐鱼体中取出的耳石通常会带上部分组织和粘液等污垢，耳石又极脆，不但在干燥后难以剥离，还会影响解剖视线，为后续检测带来极大干扰。而现有的耳石处理方法如乙醇和蒸馏水中浸泡数日以去污，但上述方法会加重耳石周边污垢的不透明化，很难达到除污目的，效率极低；如二甲苯浸泡去污，虽起到一定的透明作用，但毒性极大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种克服了传统形态学方法判别率低的局限，客观性和鉴别准确率高，结果稳定性好，可重复性高，降低成本的许氏平鲉种群的鉴别方法，该方法中耳石样品制备是利用酶解清除耳石表面杂质，酶解效率高用时短，透明作用好，减少了干扰因素，降低检测值误差，增加鉴别准确率，且溶剂使用量少毒性低；能利用固定剂提高耳石透明性、稳定性，固定剂凝固效率高，缩短了固化时间，且易清除而不损伤耳石样品，使得耳石能长期保存，在野外工作中具有实践价值。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种许氏平鲉种群的鉴别方法，包括：提供上述许氏平鲉的种群样品，提供蛋白酶和清洗剂，提供透明指甲油作为固定剂，以及，使采集自上述种群样品的新鲜耳石与上述蛋白酶和清洗剂接触进行去污处理，然后将耳石封存于固定剂中保存；上述保存所得耳石进行形状指标测定和分析以获取种群信息。该方法样品保存方便且受外界环境影响小，可重复性高，系统误差小，客观性和鉴别准确率强，结果稳定性好，克服了传统形态学方法判别率低的局限，显示出快速、简便、低成本的优势。该方法中耳石的去污和保存处理能避使得杂质组织易去除，增加酶解效率，缩短酶解用时，且能对耳石起到透明作用，使得杂质被彻底清除而减少了干扰因素，固定剂能避免机械损伤，凝固效率高，检测值误差变小，增加鉴别准确率。
对本发明而言，许氏平鲉的种群包括地理种群，上述种群还包括野生种群和人工养殖群体。地理环境对种群的生长发育及遗传变异具有一定影响，人工养殖种群和野生种群也具有环境影响导致的差异，如头长、体长、胸鳍条数等生理特征不足以形成划分种群结构的特征，因此提供了本发明中新的种群鉴别方法。
对本发明而言，种群信息还包括鱼体样品的生物学特征。上述生物学特征包括但不限于上颌骨长、头长、全长、体高、臀鳍条数、胸鳍条数等。
对本发明而言，蛋白酶为中性蛋白酶；上述中性蛋白酶使用量为新鲜耳石重量的1-5％，中性蛋白酶的使用条件为：温度37-45℃，pH为6.5-7.5。使用蛋白酶将耳石表层组织液等杂质清理掉，避免因耳石干燥后污垢剥除困难而干扰测定结果的问题，增加样品测定结果准确度，降低系统误差，提高鉴别准确率。
对本发明而言，清洗剂为1,3-双(羟甲基)脲和核黄素磷酸钠，清洗剂使用量为新鲜耳石重量的0.05-0.5％；上述1,3-双(羟甲基)脲和核黄素磷酸钠的重量比为1:1-2。清洗剂能破坏耳石表面杂质的表面黏度，渗入杂质内部，使杂质中蛋白质结构中的氢键发生断裂，既能减少蛋白质的疏水作用，又能使得杂质组织变得透明松散易去除，且能对耳石起到透明作用，另外，由于蛋白质结构被破坏后杂质内部松散，使得蛋白酶能更快速地进入杂质内部进行酶解，能有效增加酶解效率，酶解所用时间缩短了10-30％，使得杂质被彻底清除而减少了干扰因素，使得检测值误差变小，增加鉴别准确率。
对本发明而言，新鲜耳石的采集步骤如下：将不同种群样品的鱼体清洗干净后，截取鱼头，使用解剖针和弯头镊子将许氏平鲉鱼类耳石取出，再清除耳石表面的周围组织和淋巴液，然后用体积浓度为75-90％的乙醇溶液清洗1-2次，再使用蒸馏水进行清洗2-3次即得。
对本发明而言，采集自种群样品的新鲜耳石为左右矢耳石，研究对象为左矢耳石。对左右矢耳石进行独立样本t检验，结果显示许氏平鲉左右矢耳石差异不显著，故统一使用左矢耳石的测量指标进行数据分析，右矢耳石备用。
对本发明而言，去污处理步骤如下：将新鲜耳石浸泡于蒸馏水中，向其中添加入清洗剂并搅拌均匀，然后添加入中性蛋白酶酶解2-6h，将耳石取出并清洗干净，于50-60℃烘干至恒重，即得洁净耳石。该去污步骤的清污效果优异，能去除耳石表层的组织液等杂质，且不使用高浓度乙醇或二甲苯进行长时间浸泡即能达到去污的目的，既能减少溶剂使用量，避免使用毒性极大的二甲苯，又能节约时间、人工等成本，提高了工作效率。
对本发明而言，耳石封存步骤如下：将洁净耳石置于1-2倍重量的透明指甲油中包埋1-2min，然后取出凝固，即得到固化耳石。耳石极脆，容易在运输途中因震荡等外力破碎、折断，固定后在外层包埋的固定剂能避免此类机械损伤，且能使耳石长期保存，在野外工作中具有实践价值。
对本发明而言，耳石形状指标包括耳石质量和由尺寸参数分析计算所得的8个指标；上述8个指标包括面密度、形态因子、半径比、幅形比、椭圆率、矩形趋近率、Feret比、环率和圆度。
对本发明而言，尺寸参数采用拍照和图像分析的方式获取，上述尺寸参数包括耳石面积、耳石最大和最小半径、耳石长、耳石宽、耳石周长、耳石最大和最小Feret径长。
对本发明而言，形状指标的分析方法采用单因子方差分析、判别分析、主成分分析、傅里叶分析中的至少一种。优选地，采用傅里叶分析。傅里叶形态分析法对耳石进行研究，能消除耳石图形的位置、大小、测量基点和旋转角度对耳石形态分析的影响，减小了分析误差，增加了测定结果准确性。
本发明的有益效果为：
1)本发明在分析变量中引入耳石质量信息，并利用耳石形态分析的方法来说明种群或群体间的差异性，可重复性高，系统误差小，客观性和鉴别准确率高，结果稳定性好，克服了传统形态学方法判别率低的局限，显示出快速、简便、低成本的优势；
2)本发明中利用蛋白酶和清洗剂对耳石进行去污清洗，使得耳石表面杂质易去除，酶解效率高，酶解所用时间缩短了10-30％，对耳石起到透明作用，减少了干扰因素，使得检测值误差变小，增加鉴别准确率，且不使用高浓度乙醇或二甲苯进行长时间浸泡，既能减少溶剂使用量，避免使用毒性极大的二甲苯，又能节约时间、人工等成本，提高了工作效率；
3)本发明中利用固定剂包埋固定耳石，使得耳石透明性、稳定性明显提高，固定剂凝固效率高，固化时间缩短，且固定剂易清除而不损伤耳石样品，使得耳石避免外界机械损伤，且能长期保存，有利于提高结果的客观性和稳定性，在野外工作中具有实践价值。
本发明采用了上述技术方案提供一种许氏平鲉种群的鉴别方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为为许氏平鲉耳石样品图；
图2为耳石形状指标第一、第二主成分载荷散点图；
图3为耳石形状指标傅里叶数据的第一、第二主成分载荷散点图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
一种许氏平鲉种群的鉴别方法，包括：提供上述许氏平鲉的种群样品，提供蛋白酶和清洗剂，提供透明指甲油作为固定剂，以及，使采集自上述种群样品的新鲜耳石与上述蛋白酶和清洗剂接触进行去污处理，然后将耳石封存于固定剂中保存；上述保存所得耳石进行形状指标测定和分析以获取种群信息。该方法样品保存方便且受外界环境影响小，可重复性高，系统误差小，客观性和鉴别准确率强，结果稳定性好，克服了传统形态学方法判别率低的局限，显示出快速、简便、低成本的优势。该方法中耳石的去污和保存处理能避使得杂质组织易去除，增加酶解效率，缩短酶解用时，且能对耳石起到透明作用，使得杂质被彻底清除而减少了干扰因素，固定剂能避免机械损伤，凝固效率高，检测值误差变小，增加鉴别准确率。
上述许氏平鲉的种群包括地理种群，选择近海地区为青岛、烟台和日照，上述地区样品进行种群采集时还包括野生种群和人工养殖群体。地理环境对种群的生长发育及遗传变异具有一定影响，人工养殖种群和野生种群也具有环境影响导致的差异，如头长、体长、胸鳍条数等生理特征不足以形成划分种群结构的特征，因此提供了本发明中新的种群鉴别方法。
上述种群信息还包括鱼体样品的生物学特征。上述生物学特征包括但不限于上颌骨长、头长、全长、体高、臀鳍条数、胸鳍条数等。
上述蛋白酶为中性蛋白酶；上述中性蛋白酶使用量为新鲜耳石重量的1.5％，中性蛋白酶的使用条件为：温度40℃，pH为7.5。使用蛋白酶将耳石表层组织液等杂质清理掉，避免因耳石干燥后污垢剥除困难而干扰测定结果的问题，增加样品测定结果准确度，降低系统误差，提高鉴别准确率。
上述清洗剂为1,3-双(羟甲基)脲和核黄素磷酸钠，清洗剂使用量为新鲜耳石重量的0.1％；上述1,3-双(羟甲基)脲和核黄素磷酸钠的重量比为1:1.5。清洗剂能破坏耳石表面杂质的表面黏度，渗入杂质内部，使杂质中蛋白质结构中的氢键发生断裂，既能减少蛋白质的疏水作用，又能使得杂质组织变得透明松散易去除，且能对耳石起到透明作用，另外，由于蛋白质结构被破坏后杂质内部松散，使得蛋白酶能更快速地进入杂质内部进行酶解，能有效增加酶解效率，缩短了酶解所用时间，使得杂质被彻底清除而减少了干扰因素，使得检测值误差变小，增加鉴别准确率。
上述新鲜耳石的采集步骤如下：将不同种群样品的鱼体清洗干净后，截取鱼头，使用解剖针和弯头镊子将许氏平鲉鱼类耳石取出，再清除耳石表面的周围组织和淋巴液，然后用体积浓度为80％的乙醇溶液清洗2次，再使用蒸馏水进行清洗2次即得。
上述采集自种群样品的新鲜耳石为左右矢耳石，研究对象为左矢耳石。对左右矢耳石进行独立样本t检验，结果显示许氏平鲉左右矢耳石差异不显著，故统一使用左矢耳石的测量指标进行数据分析，右矢耳石备用。
上述去污处理步骤如下：将新鲜耳石浸泡于蒸馏水中，向其中添加入清洗剂并搅拌均匀，然后添加入中性蛋白酶酶解3.5h，将耳石取出并清洗干净，于50℃烘干至恒重，即得洁净耳石。该去污步骤的清污效果优异，能去除耳石表层的组织液等杂质，且不使用高浓度乙醇或二甲苯进行长时间浸泡即能达到去污的目的，既能减少溶剂使用量，避免使用毒性极大的二甲苯，又能节约时间、人工等成本，提高了工作效率。
上述耳石封存步骤如下：将洁净耳石置于1.5倍重量的透明指甲油中包埋2min，然后取出凝固，即得到固化耳石。耳石极脆，容易在运输途中因震荡等外力破碎、折断，固定后在外层包埋的固定剂能避免此类机械损伤，且能使耳石长期保存，在野外工作中具有实践价值。
上述耳石进行性状指标测定前，用丙酮浸泡，清洗掉固化耳石表面的固定剂。
上述耳石形状指标包括耳石质量和由尺寸参数分析计算所得的8个指标；上述8个指标包括面密度、形态因子、半径比、幅形比、椭圆率、矩形趋近率、Feret比、环率和圆度。面密度＝耳石质量/耳石面积；形态因子＝4π×耳石面积/耳石周长的平方；半径比＝耳石最大半径/最小半径；幅形比＝耳石长/耳石宽；椭圆率＝(耳石长-耳石宽)/(耳石长+耳石宽)；矩形趋近率＝耳石面积/(耳石长×耳石宽)；Feret比＝耳石最大Feret径长/最小Feret径长；环率＝耳石周长的平方/耳石面积；圆度＝4×耳石面积/(π×耳石长的平方)。
上述尺寸参数采用拍照和图像分析的方式获取，上述尺寸参数包括耳石面积、耳石最大和最小半径、耳石长、耳石宽、耳石周长、耳石最大和最小Feret径长。
上述形状指标的分析方法采用傅里叶分析。傅里叶形态分析法对耳石进行研究，能消除耳石图形的位置、大小、测量基点和旋转角度对耳石形态分析的影响，减小了分析误差，增加了测定结果准确性。
实施例2：
本实施例与实施例1不同之处仅在于：耳石封存步骤中固定剂透明指甲油中添加有耳石重量0.05-0.1％的2-膦酸丁烷-1,2,4-三羧酸和0.1-0.15％的淀粉乙酸酯，两者直接与指甲油中丙烯酸类物质之间形成链接，利用膦酸和羧酸等官能团，使得指甲油在耳石表面成膜而不向内渗透，起阻缓作用，使得耳石透明性、稳定性明显提高，同时能更方便去除指甲油而不损伤耳石样品，有利于提高结果的客观性和稳定性，另外两者能增加指甲油在耳石表面的分散性，使得指甲油在耳石表面分布均匀，凝固效率增加，较指甲油自然凝固时间缩短了15-35％，节省了固化时间。
实施例3：
本实施例与实施例1不同之处仅在于：去污处理步骤中未添加清洗剂1,3-双(羟甲基)脲和核黄素磷酸钠，仅单独使用中性蛋白酶酶解。
实施例4：
本实施例与实施例1不同之处仅在于：耳石样品形状指标的分析方法采用判别分析。
实施例5：
本实施例与实施例1不同之处仅在于：耳石样品形状指标的分析方法采用主成分分析。
实施例6：
本实施例与实施例1不同之处仅在于：耳石样品形状指标的分析方法采用单因子方差分析。
实施例7：
不同耳石样品制备方法对耳石样品的影响
试验方法：按照实施例1、2和3中耳石样品的制备方法进行耳石样品制备，以不去污仅封存的耳石为对照组1，以仅去污不封存的耳石为对照组2，并对制备过程中时间因素进行测定与比较，测定结果及分析如下表1所示。
表1不同耳石样品制备方法对耳石样品的影响结果
由上表可知，实施例2的凝固时间明显较其它组缩短，且表现出较其它组更高的平均压碎力，且实施例相较于对照组2能承受更高的平均压碎力，表现出更佳的抗压能力，说明实施例2的封存处理方法能缩短固定剂固化时间，且增强了固定剂对耳石样品的保护性能，样品能承受更大的压力，在运输中受到机械损伤的程度减缓，有利于样品保存和运输，也节约了原料资源和运输保存成本。实施例3在未添加清洗剂，仅延长酶解时间的情况下，所制得的耳石样品较实施例1样品的透明度低，且表面微黄，但较对照组1表现出一定的清除能力，说明实施例3中表面残留杂质未清除干净，实施例1中清洗剂能使得杂质组织变得透明松散易去除，且能对耳石起到透明作用。
实施例8：
不同形状指标的分析方法对许氏平鲉耳石样品及种群鉴别的影响
图1为许氏平鲉耳石样品图。
实施例1、4、5和6分别采用傅里叶分析，判别分析，主成分分析，单因子方差分析对耳石形状指标进行鉴别，结果如附表、附图所示。
(1)单因子方差分析
表2许氏平鲉群体9个耳石形状指单因子方差分析结果
由上表可知，单因子方差分析结果显示青岛、烟台和日照地区许氏平鲉群体的指标间差异不显著。
(2)判别分析
表3许氏平鲉群体判别分析结果
由上表可知，判别分析正确率在74.5-85.7％之间，综合判别正确率为79.2％，判别正确率达到74％以上。
(3)主成分分析
表4许氏平鲉群体耳石形状指标主成分分析结果
图2为耳石形状指标第一、第二主成分载荷散点图。由图可知，实施例中样品群体的个体随机分散于4个象限中，各群体之间存在明显的交叉现象，说明实施例中不同地区的许氏平鲉群体之间耳石形态指标差异不显著。
(4)傅里叶分析：耳石的外部轮廓形态特征主要是前20个谐值描述的，取前20个谐值进行傅里叶分析，每个谐值由4个形态变量an、bn、cn和dn表示。对20个谐值进行标准化处理后，前3个系数a1＝1，b1＝c1＝0为常数，实际用以计算的变量为77个。对77个变量进行傅里叶分析。结果如下。
表5许氏平鲉群体傅里叶方法的判别分析结果
由上表可知，判别分析正确率在65.7-70.0％之间，综合判别正确率为68.1％，判别正确率达到65％以上。
表6许氏平鲉群体傅里叶数据的主成分分析结果
由上表可知，通过对77个指标进行主成分分析，结果显示存在9个成分的特征值大于1，将他们分别作为第一到第九主成分。9个主成分的累计贡献率为95.399％。
图3为耳石形状指标傅里叶数据的第一、第二主成分载荷散点图。由图可知，实施例中样品群体的个体随机分散于4个象限中，各群体之间存在明显的交叉现象，说明实施例中不同地区的许氏平鲉群体之间耳石形态指标差异不显著。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
