一种贝莱斯芽孢杆菌及其在制备烟用香料中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其在制备烟用香料中的应用。
背景技术
随着“降焦减害”的推广，使得烟草行业在追求品质的同时，必须控制焦油含量。然而，在控制焦油含量的通常伴随着烟香物质的降低，烟叶的吸食劲头也受到相应影响。目前，提高烟叶香气品质和吸食品质的措施有很多，主要包括品种选育、改善栽培技术等，但加香加料仍是主流。烟叶加香可以补充怡人的香气，赋予独特的特征香味，并能协调香味，使不同类型、不同等级烟叶香气有几组合并相互协调，掩盖或冲淡杂气。卷烟通过加香也可以增加甜润度，改善吸味，减轻烟气的刺激性，减弱一些杂气从而改善品质。
随着生物学研究的迅速发展，利用微生物发酵技术发酵烟叶制备香料，对于改善烟叶香气质量、提高香烟吸食品质具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其在制备烟用香料中的应用。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌JXQ21，其保藏编号为CGMCC NO.17833，采用所述贝莱斯芽孢杆菌JXQ21对烟草提取物进行发酵，制备的烟用香料与烟草具有良好的适配性，可以柔和烟气，改善卷烟吸味。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC NO.17833。
本发明从选取广西、重庆和桂林三个产地的三种烤烟：广西X2L、重庆 C3F和吉林C3F，从中筛选、分离出产香效果较突出的一株菌株，命名为 JXQ21，筛选分离方法为：
选取三种烟叶进行表面菌种进行富集分离，培养过程中通过观察菌落形状，最终筛选分离得到26株菌株，将初步筛选出的菌株接入基础培养基中，置于摇床培养15h。将培养好的菌液按料液比1：10接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，将配制好的种子液在37℃下摇床培养48h。将不同于对照组香味的发酵液取出进行嗅辨，综合嗅辨结果，得到产香效果较好菌株JXQ21。对其进行分子鉴定，分子鉴定方法如下：
利用常规引物，对增香微生物JXQ21进行DNA提取，采用25μL体系进行PCR扩增，将JXQ21的PCR扩增产物送至上海生工生物公司进行测序分析，所得序列与NCBI数据库进行比对。通过16S rDNA检测菌株JXQ21 与贝莱斯芽孢杆菌具有高度的同源性，故鉴定菌株JXQ21为贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)。
本发明所述贝莱斯芽孢杆菌JXQ21(Bacillus velezensis，JXQ21)已于2019 年5月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.17833。
在烟草中，烟草中多数的致香成分基本通过以下几种途径来完成，美拉德反应、类胡萝卜素降解、类西柏烷类降解产物、苯丙氨酸降解产物等。各类物质香气特征各异，醛类致香物质具有优美香气，调节烟香；酮类致香物质具有花香和清甜味；醇类物质具有清甜的花香，果香香气，使香气细腻；酯类物质具有果香、花香及蜜甜香的特征，同时能够掩盖杂气；有些酚类物质可以赋予特定香气；杂环类物质的香气特征也各有不同，如吡啶类化合物具有甜味以及烤烟香、吡啶类多具有咖啡、可可香韵。酸类物质，如高级脂肪酸具有脂肪味或蜡味，柔滑烟气。烃类物质虽然在烟草中含量丰富，但对于增香的作用和影响微乎其微。
一些实施方案中，本发明采用所述贝莱斯芽孢杆菌JXQ21发酵烟丝，经分析，JXQ21发酵液的挥发性香气成分中酯类、酮类、醇类、酚类、烃类以及其他物质含量增加，酸类和杂环类降低。其中，酸类物质含量有所降低，但其2-戊烯酸和苯甲酸对照相比具有特征性增加，且2-戊烯酸具有草莓香气，苯甲酸具有膏香韵的香气特性；杂环类明显下降，主要是4-甲酰基咪唑减少，但该物质在低浓度情况下，具有甜香、巧克力香或坚果香。这些不同种类的化合物混合叠加，所产生的一系列反应，从而使得发酵液具有特定的香气。本发以烟叶本身为原料，利用烟叶本身来发酵制备烟用香料，再运用到卷烟中，因而，香料的香气与烟草具有良好的适配性，能够很好地柔和烟气。因此，本发明提供了所述贝莱斯芽孢杆菌在发酵制备烟用香料中的应用。
一些实施方案中，所述发酵的底物为长白山成品烟丝制成的烟末。
本发明还提供一种烟用香料的制备方法，其特征在于，将保藏编号为 CGMCCNO.17833的贝莱斯芽孢杆菌活化培养后获得菌液，将所述菌液接种于含烟末的种子培养基中发酵。
一些实施方案中，所述烟末为长白山烟丝制成的粉末。
一些实施方案中，所述菌液中贝莱斯芽孢杆菌的浓度为 0.1005×109～0.375×109cfu/ml，所述菌液的接种量为10vol％。
一些实施方案中，所述发酵的温度为37℃，时间为48h。
一些实施方案中，所述种子培养基由烟草提取物和水组成。其中，以g:ml 计，所述烟草提取物与水的质量体积比为1:1。
本发明还提供了由本发明制备方法制得的烟用香料。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌JXQ21，其保藏编号为CGMCC NO.17833。采用所述贝莱斯芽孢杆菌JXQ21发酵烟草提取物，经分析，JXQ21发酵液的挥发性香气成分中，酯类、酮类、醇类、酚类、烃类以及醛类物质含量明显增加，酸类和杂环类物质降低。以上不同种类的化合物混合叠加，所产生的一系列反应，从而使得发酵液具有特定的香气，其香气与烟草具有良好的适配性，能够很好地柔和烟气，可以作为烟用香料用作烟草加香，可有效降低卷烟刺激性，改善卷烟吸味。
生物保藏说明
贝莱斯芽孢杆菌JXQ21，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌，Bacillus velezensis， 2019年5月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.17833。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2中JXQ21发酵液与对照组中不同种类的成分的对比分析结果。
具体实施方式
本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及其在制备烟用香料中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明贝莱斯芽孢杆菌JXQ21的分离、鉴定
选取三个产地烤烟(广西X2L、重庆C3F和吉林C3F)的烟叶进行表面菌种进行富集分离，培养过程中通过观察菌落形状，最终筛选分离得到26株菌株，将初步筛选出的菌株接入基础培养基中，置于摇床培养15h。将培养好的菌液按料液比1：10接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，将配制好的种子液在37℃下摇床培养48h。培养过程中观察并记录发酵液香味变化。将不同于对照组香味的发酵液取出进行嗅辨，综合嗅辨结果，得到产香效果较好菌株JXQ21。对其进行分子鉴定，分子鉴定方法如下：
利用常规引物，对增香微生物JXQ21进行DNA提取，采用25μL体系进行PCR扩增，将JXQ21的PCR扩增产物送至上海生工生物公司进行测序分析，所得序列与NCBI数据库进行比对。通过16S rDNA检测菌株JXQ21 与贝莱斯芽孢杆菌具有高度的同源性，故鉴定菌株JXQ21为贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)。
实施例2利用贝莱斯芽孢杆菌JXQ21制备烟用香料
将保藏编号为CGMCC NO.17833的贝莱斯芽孢杆菌活化培养，获得菌液，将菌液按照10％(v/v)的比例接种于含烟末(长白山成品烟丝)的种子培养基中发酵。
其中，种子培养基组成为：长白山成品烟丝10g、水100mL；菌液中贝莱斯芽孢杆菌的浓度为0.375×109cfu/ml；发酵温度为37℃，发酵时间为48h。
以未接种贝莱斯芽孢杆菌JXQ21的种子培养液作为对照组，其中，种子培养液组成同上述种子培养基。每个处理组设置三组重复。将JXQ21发酵液和对照组种子液同时进行蒸馏萃取，然后加入内标进行水浴浓缩，浓缩至 1mL，通过0.22μm滤膜过滤至样品瓶中。
GC-MS分析条件：
气相条件：色谱柱：HP-5，进样口：260℃，进样量：1μL，分流比： 10:1，延迟5min，升温程序：50℃保持3分钟，然后以6℃/分的速度，升到280℃保持12分钟。
质谱条件：Aux：260℃，四级杆温度：150℃，离子源温度：230℃，质量扫描范围：30～550amu。
结果根据如下方法计算：
香气成分含量计算方法：香气成分含量＝(组分峰面积*内标物含量)/内标物峰面积。结果见表1和图1。
表1 JXQ21发酵液香气成分分析结果
注：表中物质含量(μg/g)是指每克发酵液样品中所测的挥发性化学物质的质量。“-”表示挥发性香气成分含量级低或没有。
由表1和图1可以看出，JXQ21发酵液中的挥发性香气成分：酯类、酮类、醇类、酚类、烃类以及其他物质含量增加，酸类和杂环类降低。酯类物质中棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、乙酸对甲酚酯、1,1,1-三甲基-1-苯甲酸酯和丁酸苯基乙酯与对照相比有特征性增加，棕榈酸甲酯和棕榈酸乙酯均具有蜡质的脂肪香；乙酸对甲酚酯具有花香特性；1,1,1-三甲基-1-苯甲酸酯的香气特性未有相关文献报道；丁酸苯基乙酯其香气特性为水果、玫瑰香气，并具有蜂蜜似甜香味。酮类中大马士酮和茄尼酮与对照相比具有特征性增加，其中茄尼酮增加明显，具有清甜香的特征；大马士酮微有增加，能够增加浓度，有白肋烟香味。酸类物质含量有所降低，但其2-戊烯酸和苯甲酸对照相比有特征性增加，2-戊烯酸具有草莓香气；苯甲酸具有膏香韵的香气特性；与对照相比未见有棕榈酸生成。杂环类物质明显降低，主要是4-甲酰基咪唑明显降低，但在低浓度情况下，具有甜香、巧克力香或坚果香。烃类中十八烷与对照相比具有特征性增加，其具体香气特性未有相关文献报道。其他物质中烟碱含量有所增加。
以上不同种类的化合物混合叠加，所产生的一系列反应，从而使得发酵液具有特定的香气，其香气与烟草具有良好的适配性，能够很好地柔和烟气，可以作为烟用香料用作烟草加香，可有效降低卷烟刺激性，改善卷烟吸味。
实施例3感官评吸试验
将发酵后样品进行香料溶于酒精75％制备香液J1、J2、J3(表2)，按照适当比例均匀的喷洒在已经处理好的烟丝样品中。通过人工卷制，进行样品的感官评价，同时以未喷洒香料的烟丝作为对照进行卷制及评价。具体香料喷洒量分别按照烟丝重量的0.1％、0.3％、0.5％进行，通过感官评吸客观评价增香微生物发酵制备烟用香料的使用价值。感官评吸在郑州轻工业大学评吸室开展。按照卷烟感官质量评判标准GB5606-2005，以香气、协调、刺激性、杂气、余味为主来判断其使用价值，找专业评吸人员7人进行感官评吸，最终综合七人评价结果进行总结(表3)。
表2香料回溶配比表
表3加香样品感官评吸评价表
由表3可以看出：与空白对照相比，喷洒不同比例的实施例2制备的烟用香料的烟丝在香气、协调性、刺激性、杂气和余味方面均呈现不同程度改变。通过喷洒0.1％比例的三组样品同对照相比，香气、协调性、刺激性、杂气、余味整体相对变化不明显；通过喷洒0.3％比例的三组样品同对照相比，香气均有提升，刺激性略有降低，杂气和余味有所改善；通过喷洒0.5％比例的三组样品同对照相比，香气有所增加，刺激性降低，协调性、杂气和余味也有较好的改善。香料样品J-1中以0.3％为最佳选择，同时三种喷洒比例相比较，0.1％比例影响较小，0.5％比例香料香气过于浓厚，掩盖烟草本香，对余味并不友好，因此，综合评价结果以J3/0.3％为最佳组合，该比例下，香气充足稍粗糙，较协调，不会掩盖烟草本香，刺激性降低，稍有杂气，余味较舒适，与烟气能够较好融合、协调。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
