具有RNA酶活性的多肽
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发明背景
技术领域
本发明涉及具有RNA酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用这些多肽的方法。
背景技术
包含酶混合物(包括RNA酶)的组合物描述于WO 2004/0441988(Marion Karine)中。这些组合物可用于去除医学领域中的生物膜，如用于分析仪器和其他设备。WO 2006/031554(诺维信公司(Novozymes))描述了用于防止、去除、减少或破坏表面上的生物膜的方法。所披露的方法使用α-淀粉酶，其可以与包括RNA酶在内的其他酶组合。然而，没有披露特定的RNA酶并且没有披露使用RNA酶的效果。类似的披露可以发现于例如WO 2008/153805(美国丹斯尼克公司(Danisco US))中。现有技术中没有描述在清洁过程中RNA酶用于去除织物上RNA染色的用途。本发明提供了新颖RNA酶，特别适用于减少或去除包含于有机物质(如来自织物(例如纺织品)的生物膜)中的RNA酶污垢。
发明内容
本发明涉及核酸酶(特别是核糖核酸酶)、具有RNA酶活性的多肽的方法和用途、以及包含多肽(这些多肽具有RNA酶活性)的组合物。
本发明的一个方面涉及具有RNA酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:57的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:58的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:59的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:60的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:61的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:62的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:63的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:64的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:65的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:66的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(p)与SEQ ID NO:67的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(q)与SEQ ID NO:72的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(r)与SEQ ID NO:73的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(s)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73，其中该变体具有RNA酶活性并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(t)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)或(s)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签的多肽；
(u)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)或(s)的多肽以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸的多肽；
(v)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)或(s)的多肽的片段，该片段具有RNA酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度；
(w)多肽，该多肽包含基序EYTV(SEQ ID NO:28)、[YRF]E[AYFWC]D(SEQ ID NO:29)、IGGD(SEQ ID NO:30)、YPH(SEQ ID NO:31)、HTGA(SEQ ID NO:32)或DRV(SEQ ID NO:33)中的一个或多个；和
(x)多肽，该多肽包含基序YXEYTVXTPXXXXRGXRR(SEQ ID NO:78)、[WY][YRF]E[AYFWC]D[IV](SEQ ID NO:79)、GXXIGGDXFXN(SEQ ID NO:80)、YPHX[YFA]X[ND]XE(SEQ IDNO:81)、PGXDRV(SEQ ID NO:82)或THTGA[SR]G(SEQ ID NO:83)中的一个或多个。
本发明的一个方面涉及编码本发明的多肽的多核甘酸。一个方面涉及核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含编码本发明的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码本发明的多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
本发明的一个方面涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。
一个方面涉及多肽用于深度清洁物品的用途，该多肽包含基序EYTV(SEQ ID NO:28)、[YRF]E[AYFWC]D(SEQ ID NO:29)、IGGD(SEQ ID NO:30)、YPH(SEQ ID NO:31)、HTGA(SEQ ID NO:32)或DRV(SEQ ID NO:33)中的一个或多个并且具有RNA酶活性，其中该物品是纺织品。该方面的一个实施例涉及多肽用于深度清洁物品的用途，该多肽包含基序YXEYTVXTPXXXXRGXRR(SEQ ID NO:78)、[WY][YRF]E[AYFWC]D[IV](SEQ ID NO:79)、GXXIGGDXFXN(SEQ ID NO:80)、YPHX[YFA]X[ND]XE(SEQ ID NO:81)、PGXDRV(SEQ ID NO:82)和THTGA[SR]G(SEQ ID NO:83)中的一个或多个并且具有RNA酶活性，其中该物品是纺织品。
一个方面涉及具有RNA酶活性的多肽的用途，
(i)用于防止、减少或去除物品的粘性；
(ii)用于预处理物品上的污渍；
(iii)用于在洗涤循环期间防止、减少或去除污垢的再沉积；
(iv)用于防止、减少或去除污垢在物品上的附着；
(v)用于维持或改进物品的白度；
(vi)用于防止、减少或去除物品的恶臭，
其中该物品是纺织品。
一个方面涉及用于洗涤物品的洗涤方法，该方法包括以下步骤：
a.将物品暴露于包含本发明的多肽的洗涤液或包含本发明的多肽的清洁组合物；
b.完成至少一个洗涤循环；和
c.任选地冲洗该物品，
其中该物品是纺织品。
序列综述
SEQ ID NO 1：编码来自类芽孢杆菌属物种(Paenibacillussp)-18057的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 2：来源于SEQ ID NO 1的多肽
SEQ ID NO 3：获得自类芽孢杆菌属物种-18057的成熟多肽
SEQ ID NO 4：编码来自类芽孢杆菌属物种-62770的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 5：来源于SEQ ID NO 4的多肽
SEQ ID NO 6：获得自类芽孢杆菌属物种-62770的成熟多肽
SEQ ID NO 7：编码来自天蓝色拟无枝酸菌(Amycolatopsisazurea)的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 8：来源于SEQ ID NO 7的多肽
SEQ ID NO 9：获得自天蓝色拟无枝酸菌的成熟多肽
SEQ ID NO 10：编码来自环境样品群落E的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 11：来源于SEQ ID NO 10的多肽
SEQ ID NO 12：获得自环境样品群落E的成熟多肽
SEQ ID NO 13：编码来自嗜碱枝顶孢(Acremonium alcalophilum)的全长多肽的DNA
SEQ ID NO 14：来源于SEQ ID NO 13的多肽
SEQ ID NO 15：获得自嗜碱枝顶孢的成熟多肽
SEQ ID NO 16：获得自环境样品群落E的DNA序列
SEQ ID NO 17：来源于SEQ ID NO 16的多肽
SEQ ID NO 18：具有抑制剂的类芽孢杆菌属物种-62770的DNA序列
SEQ ID NO 19：来源于SEQ ID NO 18的多肽
SEQ ID NO 20：具有抑制剂的类芽孢杆菌属物种-18057的DNA序列
SEQ ID NO 21：来源于SEQ ID NO 20的多肽
SEQ ID NO 22：具有抑制剂的天蓝色拟无枝酸菌的DNA序列
SEQ ID NO 23：来源于SEQ ID NO 22的多肽
SEQ ID NO:24：克劳氏芽孢杆菌分泌信号
SEQ ID NO 25：His-tag
SEQ ID NO:26：正向克隆引物Alca166-F
SEQ ID NO:27：反向克隆引物Alca166-R
SEQ ID NO 28：EYTV基序
SEQ ID NO 29：[YRF]E[AYFWC]D基序
SEQ ID NO 30：IGGD基序
SEQ ID NO 31：YPH基序
SEQ ID NO 32：HTGA基序
SEQ ID NO 33：DRV基序
SEQ ID NO:34：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)核糖核酸酶Barnase
SEQ ID NO 35是具有抑制剂的嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)的DNA序列。
SEQ ID NO 36是来源于SEQ ID NO 35的多肽，其中信号肽是氨基酸-20至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-139。
SEQ ID NO 37是具有抑制剂的桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)的DNA序列。
SEQ ID NO 38是来源于SEQ ID NO 37的多肽，其中信号肽是氨基酸-20至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-136。
SEQ ID NO 39是具有抑制剂的冻原类芽孢杆菌(Paenibacillustundrae)的DNA序列。
SEQ ID NO 40是来源于SEQ ID NO 39的多肽，其中信号肽是氨基酸-26至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-119。
SEQ ID NO 41是具有抑制剂的糖丝菌属物种(Saccharothrixsp)-62935的DNA序列。
SEQ ID NO 42：来源于SEQ ID NO 41的多肽，其中信号肽是氨基酸-26至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-117。
SEQ ID NO 43是具有抑制剂的内生糖多孢菌(Saccharopolysporaendophytica)的DNA序列。
SEQ ID NO 44是来源于SEQ ID NO 43的多肽，其中信号肽是氨基酸-29至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-108。
SEQ ID NO 45是具有抑制剂的circi拟无枝酸菌(Amycolatopsiscirci)的DNA序列。
SEQ ID NO 46是来源于SEQ ID NO 45的多肽，其中信号肽是氨基酸-30至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-120。
SEQ ID NO 47是具有抑制剂的类芽孢杆菌属物种-62770的DNA序列。
SEQ ID NO 48是来源于SEQ ID NO 47的多肽，其中信号肽是氨基酸-26至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-119。
SEQ ID NO 49是具有抑制剂的类芽孢杆菌属物种-18006的DNA序列。
SEQ ID NO 50是来源于SEQ ID NO 49的多肽，其中信号肽是氨基酸-27至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-117。
SEQ ID NO 51是具有抑制剂的类芽孢杆菌属物种-62724的DNA序列。
SEQ ID NO 52是来源于SEQ ID NO 51的多肽，其中信号肽是氨基酸-34至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-156。
SEQ ID NO 53是具有抑制剂的碱单胞菌属物种(Alkalimonassp)-62516的DNA序列。
SEQ ID NO 54是来源于SEQ ID NO 54的多肽，其中信号肽是氨基酸-23至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-115。
SEQ ID NO 55是具有抑制剂的迪氏野野村氏菌(Nonomuraeadietziae)的DNA序列。
SEQ ID NO 56是来源于SEQ ID NO 55的多肽，其中信号肽是氨基酸-27至-1，并且成熟多肽是氨基酸1-108。
SEQ ID NO 57是获得自嗜根寡养单胞菌的成熟多肽。
SEQ ID NO 58是获得自桃色欧文氏菌的成熟多肽。
SEQ ID NO 59是获得自冻原类芽孢杆菌的成熟多肽。
SEQ ID NO 60是获得自糖丝菌属物种-62935的成熟多肽。
SEQ ID NO 61是获得自内生糖多孢菌的成熟多肽。
SEQ ID NO 62是获得自circi拟无枝酸菌的成熟多肽。
SEQ ID NO 63是获得自类芽孢杆菌属物种-62770的成熟多肽(DNA SEQ ID NO47)。
SEQ ID NO 64是获得自类芽孢杆菌属物种-18006的成熟多肽。
SEQ ID NO 65是获得自类芽孢杆菌属物种-62724的成熟多肽。
SEQ ID NO 66是获得自碱单胞菌属物种-62516的成熟多肽。
SEQ ID NO 67是获得自迪氏野野村氏菌的成熟多肽。
SEQ ID NO 68：是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的DNA序列。
SEQ ID NO 69是来源于SEQ ID NO 68(具有信号肽和成熟多肽)的多肽。
SEQ ID NO 70：是腐皮镰孢(Fusarium solani)的DNA序列。
SEQ ID NO 71是来源于SEQ ID NO 70(具有信号肽和成熟多肽)的多肽。
SEQ ID NO 72是来源于哈茨木霉的成熟多肽。
SEQ ID NO 73是来源于腐皮镰孢的成熟多肽。
SEQ ID NO:74：正向克隆引物MDQM1692-F
SEQ ID NO:75：反向克隆引物MDQM1692-R
SEQ ID NO 76：来自金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)(公开序列SWISSPROT:P30289)的RNA酶
SEQ ID NO 77：来自藤仓赤霉菌(Gibberellafujikuroi)(公开序列SWISSPROT:A7M7A2)的RNA酶
SEQ ID NO 78：YXEYTVXTPXXXXRGXRR基序
SEQ ID NO 79：[WY][YRF]E[AYFWC]D[IV]基序
SEQ ID NO 80：GXXIGGDXFXN基序
SEQ ID NO 81：YPHX[YFA]X[ND]XE基序
SEQ ID NO 82：PGXDRV基序
SEQ ID NO 83：THTGA[SR]G基序
定义
术语“RNA酶”是术语核糖核酸酶的缩写，其意指催化RNA降解成较小的组分、具有RNA酶活性的核酸酶(EC 3.1.2.7)。核糖核酸酶可分为内切核糖核酸酶和外切核糖核酸酶；本发明涉及例如内切核糖核酸酶。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定RNA酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:3、6、9、12或15中所示的成熟多肽中任一个的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的RNA酶活性。
术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“生物膜”意指由其中细胞彼此粘附在一起或粘附至表面(如纺织品、餐具或硬表面)或另一种表面的任何群组的微生物产生的膜。这些附着细胞经常包埋在细胞外聚合物(EPS)的自身产生的基质内。生物膜EPS是通常由细胞外DNA、蛋白质、和多糖组成的聚合物团块。生物膜可以形成在活的或非活的表面上。在生物膜中生长的微生物细胞与同一有机体的浮游细胞(相比之下，浮游细胞是可以在液体介质中漂浮或浮游的单个细胞)在生理上是不同的。生活在生物膜中的细菌通常与同一物种的浮游细菌具有显著不同的特性，因为膜的密集并且受保护的环境允许它们以不同方式协作和相互作用。微生物的这一环境的一个益处是增加对洗涤剂和抗生素的抗性，因为，密集的细胞外基质和细胞的外层保护群落的内部。关于洗衣生物膜生产细菌可以在以下物种中找到，这些物种包括：不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、气微菌属物种(Aeromicrobium sp.)、短波单胞菌属物种(Brevundimonas sp.)、微杆菌属物种(Microbacterium sp.)、滕黄微球菌(Micrococcusluteus)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)以及寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonas sp.)。关于硬表面生物膜生产细菌可以在以下物种中找到：不动杆菌属物种、气微菌属物种、短波单胞菌属物种、微杆菌属物种、滕黄微球菌、假单胞菌属物种、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)以及寡养单胞菌属物种。
术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
在本上下文中，术语“深度清洁”意指破坏、减少或去除有机组分，如多糖、蛋白质、RNA、DNA、污垢或存在于有机物质(如生物膜)中的其他组分。
术语“洗涤剂佐剂成分”是指不同于本发明的RNA酶的成分。这些另外的佐剂组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的操作的性质。适合的佐剂材料包括，但不限于：以下描述的组分，如表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合剂、粘土去污剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、和/或颜料。
术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(如纺织品)去除不希望的化合物的组合物。术语“洗涤剂组合物”和“清洁组合物”在本申请中可互换使用。该洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品，用于家用清洁和工业清洁两者。这些术语涵盖选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物，如液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织品和衣物预去污剂/预处理。除了包含本发明的酶之外，该洗涤剂配制品还可以含有一种或多种另外的酶(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物)，和/或洗涤剂佐剂成分，如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物柔顺剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂。
术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
“His-标签”是指典型地包含至少6个组氨酸残基的多组氨酸标签，其可以添加到N-或C-末端上。His标签在本领域已知用于例如蛋白质纯化，但也可以用于改进低pH值下的溶解度。类似地，如本领域已知的，“HQ-标签”(即组氨酸-谷氨酰胺标签)也可以用于纯化目的。
术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。
术语“洗涤”涉及家用洗涤和工业洗涤两者并且意指用一种包含本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。
关于术语“恶臭”意指在清洁物品上不希望的气味。清洁的物品应气味清新并且干净，而没有附着于该物品上的恶臭。恶臭的一个实例是具有令人不快的气味的化合物，其可以由微生物产生并且被在生物膜内捕获或粘附到生物膜的“胶”上。令人不快的气味的其他实例是附着于已经与人或动物接触的物品的汗味或体味。恶臭的其他实例是来自香料的气味，其粘附于物品，例如气味强烈的咖喱或其他异国香料。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等)之后处于其最终形式的多肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至144。SEQ ID NO:2的氨基酸-29至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸1至119。SEQ ID NO:5的氨基酸-26至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸1至134。SEQ ID NO:8的氨基酸-22至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸1至158。SEQ ID NO:11的氨基酸-24至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸1至114。SEQ ID NO:14的氨基酸-17至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:36的氨基酸1至139。SEQ ID NO:36的氨基酸-20至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:38的氨基酸1至136。SEQ ID NO:38的氨基酸-20至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:40的氨基酸1至119。SEQ ID NO:40的氨基酸-26至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:42的氨基酸1至117。SEQ ID NO:42的氨基酸-26至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:44的氨基酸1至108。SEQ ID NO:44的氨基酸-29至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:46的氨基酸1至120。SEQ ID NO:46的氨基酸-30至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:48的氨基酸1至119。SEQ ID NO:48的氨基酸-26至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:50的氨基酸1至117。SEQ ID NO:50的氨基酸-27至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:52的氨基酸1至156。SEQ ID NO:52的氨基酸-34至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:54的氨基酸1至115。SEQ ID NO:54的氨基酸-23至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:56的氨基酸1至108。SEQ ID NO:56的氨基酸-27至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:69的氨基酸1至116。SEQ ID NO:69的氨基酸-15至-1是信号肽。
在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:71的氨基酸1至112。SEQ ID NO:71的氨基酸-19至-1是信号肽。
在本领域已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域还已知的是，不同的宿主细胞以不同的方式加工多肽，且因此表达多核苷酸的一种宿主细胞当与表达相同多核苷酸的另一种宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有RNA酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸88至519，并且SEQ ID NO:1的核苷酸1至87编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:4的核苷酸79至435，并且SEQID NO:4的核苷酸1至78编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸67至468，并且SEQID NO:7的核苷酸1至66编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:10的核苷酸73至546，并且SEQID NO:10的核苷酸1至72编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:13的核苷酸52至280和348至460，并且SEQ ID NO:13的核苷酸1至51编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:35的核苷酸61至477，并且SEQID NO:35的核苷酸1至60编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:37的核苷酸61至468，并且SEQID NO:37的核苷酸1至60编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:39的核苷酸79至435，并且SEQID NO:39的核苷酸1至78编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:41的核苷酸79至429，并且SEQID NO:41的核苷酸1至78编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:43的核苷酸88至411，并且SEQID NO:43的核苷酸1至87编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:45的核苷酸91至450，并且SEQID NO:45的核苷酸1至90编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:47的核苷酸79至435，并且SEQID NO:47的核苷酸1至78编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:49的核苷酸82至432，并且SEQID NO:49的核苷酸1至81编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:51的核苷酸103至570，并且SEQID NO:51的核苷酸1至102编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:53的核苷酸70至414，并且SEQID NO:53的核苷酸1至69编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:55的核苷酸82至405，并且SEQID NO:55的核苷酸1至81编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:68的核苷酸46至283和350至459，并且SEQ ID NO:69的核苷酸1至45编码信号肽。
在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:70的核苷酸129至354和418至527，并且SEQ ID NO:70的核苷酸1至15和87至128编码信号肽。
术语“核酸构建体”意指单-链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标志的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
术语“变体”意指具有RNA酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。
命名法
出于本发明的目的，命名法[E/Q]或简单的[EQ]意指在该位置的氨基酸可以是谷氨酸(Glu，E)或谷氨酰胺(Gln，Q)。同样，命名法[V/G/A/I]或[VGAI]意指在此位置的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)，对于如本文所描述的其他组合，依次类推。除非进一步另有限制，否则氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。
具体实施方式
具有RNA酶活性的多肽
本发明涉及具有RNA酶活性的多肽，即RNA酶。本发明的RNA酶可以用于清洁组合物，并且可有效深层清洁表面如织物。本发明的RNA酶可有效减少或去除生物膜。生物膜是由不同微生物产生的细胞外基质。细胞外聚合物基质由多糖、细胞外RNA、DNA和蛋白质组成。生物膜可以是粘性的或粘合的，当其存在于纺织品上时，可引起污垢的再沉积或反染色，从而导致该纺织品灰化。另一个缺点是生物膜经常引起恶臭，这是由于生物膜结构内捕获多种恶臭相关分子。因此，本发明的RNA酶可以用于防止、减少或去除恶臭以及用于防止或减少再沉积和改进白度。
具有RNA酶活性的本发明的多肽包含来自RNA酶Barnase(Swiss Prot P00648(SEQID NO 34)，PF00545家族)的结构域以及如进化枝的簇。进化枝是一个具有共同系统发育的分组，其包括一个共同的祖先和该祖先的所有后代(现存的和灭绝的)(http://evolution.berkeley.edu/evolibrary/article/0_0_0/evo_06)。因此，在本上下文中，进化枝是指密切相关的RNA酶的亚组。
如PFAM(PF000545，Pfam版本30.0，Finn(2016)Nucleic Acids Research[核酸研究],Database Issue[数据库卷]44:D279-D285)中所定义的，构建含有Barnase结构域的多肽序列的系统发育树。系统发育树是从包含至少一个Barnase结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar,2004.Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5):1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人,2010,PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用iTOL(Letunic和Bork,2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1):127-128)对树进行可视化。包含Barnase结构域的多肽可以分成多个如下列出的我们表示的不同的子簇或进化枝。实例10中描述了每个进化枝的不同基序。
在本发明的一个实施例中，本发明的RNA酶属于包含基序EYTV(SEQ ID NO:28)、[YRF]E[AYFWC]D(SEQ ID NO:29)、IGGD(SEQ ID NO:30)、YPH(SEQ ID NO:31)、HTGA(SEQ IDNO:32)或DRV(SEQ ID NO:33)中的一个或多个的特定亚组或进化枝。
在一个方面，具有RNA酶活性的本发明的多肽属于EYTV进化枝并且包含基序EYTV(SEQ ID NO:28)。在该方面的一个实施例中，多肽包含延伸基序YXEYTVXTPXXXXRGXRR(SEQID NO:78)，其中每个X可以独立地是任何天然存在的氨基酸。
在一个方面，具有RNA酶活性的本发明的多肽属于EAD进化枝并且包含基序[YRF]E[AYFWC]D(SEQ ID NO:29)或IGGD(SEQ ID NO:30)中的一个或多个。在该方面的一个实施例中，多肽包含延伸基序[WY][YRF]E[AYFWC]D[IV](SEQ ID NO:79)。在另一个实施例中，该多肽包含延伸基序GXXIGGDXFXN(SEQ ID NO:80)，其中每个X可以独立地是任何天然存在的氨基酸。
在一个方面，具有RNA酶活性的本发明的多肽属于YPH进化枝并且包含基序YPH(SEQ ID NO:31)、HTGA(SEQ ID NO:32)或DRV(SEQ ID NO:33)中的一个或多个。在该方面的一个实施例中，多肽包含延伸基序YPHX[YFA]X[ND]XE(SEQ ID NO:81)，其中每个X可以独立地是任何天然存在的氨基酸。在另一个实施例中，该多肽包含延伸基序PGXDRV(SEQ ID NO:82)，其中X可以是任何天然存在的氨基酸。在另一个实施例中，该多肽包含延伸基序THTGA[SR]G(SEQ ID NO:83)。
本发明的一个方面涉及具有RNA酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：
(a)与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(b)与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(c)与SEQ ID NO:9的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(e)与SEQ ID NO:15的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(f)与SEQ ID NO:57的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(g)与SEQ ID NO:58的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(h)与SEQ ID NO:59的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(i)与SEQ ID NO:60的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(j)与SEQ ID NO:61的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(k)与SEQ ID NO:62的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(l)与SEQ ID NO:63的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(m)与SEQ ID NO:64的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(n)与SEQ ID NO:65的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(o)与SEQ ID NO:66的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(p)与SEQ ID NO:67的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(q)与SEQ ID NO:72的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(r)与SEQ ID NO:73的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；
(s)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73，其中该变体具有RNA酶活性并且包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；
(t)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)或(s)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签的多肽；
(u)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)或(s)的多肽以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸的多肽；
(v)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)或(s)的多肽的片段，该片段具有RNA酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度；
(w)多肽，该多肽包含基序EYTV(SEQ ID NO:28)、[YRF]E[AYFWC]D(SEQ ID NO:29)、IGGD(SEQ ID NO:30)、YPH(SEQ ID NO:31)、HTGA(SEQ ID NO:32)或DRV(SEQ ID NO:33)中的一个或多个；和
(x)多肽，该多肽包含基序YXEYTVXTPXXXXRGXRR(SEQ ID NO:78)、[WY][YRF]E[AYFWC]D[IV](SEQ ID NO:79)、GXXIGGDXFXN(SEQ ID NO:80)、YPHX[YFA]X[ND]XE(SEQ IDNO:81)、PGXDRV(SEQ ID NO:82)或THTGA[SR]G(SEQ ID NO:83)中的一个或多个。
本发明的RNA酶可用于清洁组合物，并且可有效深层清洁表面如织物，并有效地减少或去除RNA污垢(例如有机物质)。有机物质的一个实例是生物膜，其是由多种微生物产生的细胞外基质。如上所描述的，有机物质(像生物膜)可以是粘性的或粘合的，并且可引起污垢的再沉积或反染色，从而导致该纺织品灰化。有机物(如生物膜)的另一个缺点是恶臭，因为多种恶臭相关分子通常与有机物质(如生物膜)相关。
本发明的一个方面涉及多肽用于深度清洁物品的用途，该多肽包含基序EYTV(SEQID NO:28)、[YRF]E[AYFWC]D(SEQ ID NO:29)、IGGD(SEQ ID NO:30)、YPH(SEQ ID NO:31)、HTGA(SEQ ID NO:32)或DRV(SEQ ID NO:33)中的一个或多个并且具有RNA酶活性，其中该物品是纺织品。在一个实施例中，该多肽可以包含基序YXEYTVXTPXXXXRGXRR(SEQ ID NO:78)、[WY][YRF]E[AYFWC]D[IV](SEQ ID NO:79)、GXXIGGDXFXN(SEQ ID NO:80)、YPHX[YFA]X[ND]XE(SEQ ID NO:81)、PGXDRV(SEQ ID NO:82)或THTGA[SR]G(SEQ ID NO:83)中的一个或多个。
一个方面涉及用于洗涤物品的洗涤方法，该方法包括以下步骤：
a.将物品暴露于洗涤液或清洁组合物中，该洗涤液包含选自由以下组成的组的多肽：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:72和SEQID NO:73，该清洁组合物包含选自由以下组成的组的多肽：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73；
b.完成至少一个洗涤循环；和
c.任选地冲洗该物品，
其中该物品是纺织品。
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少70％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:5的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:8的成熟多肽的至少80％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:11的成熟多肽的至少85％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少90％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:36的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:36的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:38的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:38的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:40的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:40的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:42的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:42的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:44的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:44的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:46的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:46的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:48的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:48的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:50的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:50的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:52的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:52的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:54的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:54的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:56的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:56的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:69的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:69的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个具体实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:71的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:71的成熟多肽的至少75％的RNA酶活性。
在一个实施例中，本发明的多肽已经被分离。
本发明的优选的多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至144或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:3长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:5的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸1至119或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:6长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:8的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸1至134或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:9长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:11的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸1至158或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:12长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:14的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸1至114或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:15长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:36的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:57长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:38的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:58长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:40的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:59长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:42的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:60长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:44的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:61长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:46的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:62长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:48的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:63长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:50的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:64长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:52的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:65长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:54的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:66长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:56的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:67中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:67长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:72中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:69的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:72中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:72中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:72长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
本发明的另一种优选的多肽包含SEQ ID NO:73中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或为具有RNA酶活性的其片段。在另一个实施例中，该多肽包含SEQ IDNO:71的成熟多肽或由其组成。
在一个实施例中，该多肽优选地包含SEQ ID NO:73中所示的氨基酸序列或由其组成；包含SEQ ID NO:73中所示的氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有SEQ ID NO:73长度的至少50％，如至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:3中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ ID NO:3的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:6中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ ID NO:6中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:9中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ ID NO:9中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:12中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:12中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:15中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:15中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:57中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:57中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:58中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:58中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:59中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:59中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:60中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:60中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:61中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:61中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:62中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:62中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:63中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:63中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:64中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:64中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:65中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:65中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:66中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:66中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:67中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:67中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:72中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:72中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:73中所示的成熟多肽的变体。在一些实施例中，引入SEQ IDNO:73中所示的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可以根据本领域已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴别多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的RNA酶活性以鉴别对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标志，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。通过与来自解淀粉芽孢杆菌SWISSPROT:P00648的Barnase进行的这种比对，如下在成熟序列中鉴别以下活性位点残基：SEQ ID:3His130，Glu101；SEQ ID:6His110，Glu82；SEQ ID:9His123，Glu93；和SEQ ID:12His150，Glu121。
来自核糖核酸酶的PF00545家族的RNA酶Barnase，Swiss Prot P00648(SEQ ID NO34)催化二核苷酸GpN位点处的水解。使用以下通用酸碱机制，分两步进行切割：在第一次酯交换步骤期间形成环状中间体，然后水解以释放切割的RNA。参与催化的两个最重要的残基是Glu73和His102，它们都被认为是酶活性所必需的。Glu73是通用碱，而His102是通用酸。Barnase不含二硫键，也不需要二价阳离子或非肽组分折叠。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学与生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；以及Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]，13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能和遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
具有RNA酶活性的多肽的来源
本发明的具有RNA酶活性的多肽可从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
在一个方面中,该多肽是类芽孢杆菌属(Paenibacillus)多肽。该方面的一个实施例是例如获得自类芽孢杆菌属物种-18057的多肽。该方面的另一个实施例是例如获得自类芽孢杆菌属物种-62770的多肽。该方面的另一个实施例是获得自类芽孢杆菌属物种-18006的多肽。该方面的另一个实施例是获得自类芽孢杆菌属物种-62724的多肽。该方面的另一个实施例是获得自冻原类芽孢杆菌的多肽。
在一个方面，该多肽是拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)多肽，例如获得自天蓝色拟无枝酸菌的多肽。
在一个方面，该多肽是枝顶孢属(Acremonium)多肽，例如获得自嗜碱枝顶孢的多肽。
在一个方面中，该多肽是寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)多肽，例如获得自嗜根寡养单胞菌的多肽。
在一个方面中，该多肽是欧文氏菌属(Erwinia)多肽，例如获得自桃色欧文氏菌的多肽。
在一个方面，该多肽是糖丝菌属(Saccharothrix)多肽，例如获得自糖丝菌属物种-62935的多肽。
在一个方面，该多肽是糖多孢菌属(Saccharopolyspora)多肽，例如获得自内生糖多孢菌的多肽。
在一个方面，该多肽是拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)多肽，例如获得自circi拟无枝酸菌的多肽。
在一个方面，该多肽是碱单胞菌属(Alkalimonas)多肽，例如获得自碱单胞菌属物种-62516的多肽。
在一个方面中，该多肽是野野村氏菌属(Nonomuraea)多肽，例如从迪氏野野村氏菌中获得的多肽。
在一个方面，该多肽是木霉属(Trichoderma)多肽，例如，获得自哈茨木霉的多肽。
在一个方面，该多肽是镰孢属(Fusarium)多肽，例如获得自腐皮镰孢的多肽。
应理解的是对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)两者，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的物种名称无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴别和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989，同上)分离或克隆多核苷酸。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如本文所描述的。在一个实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:35的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:43的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:45的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:47的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:49的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:51的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:53的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:55的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:68的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:70的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多核苷酸已经被分离。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],AcademicPress[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自类芽孢杆菌属、拟无枝酸菌属、寡养单胞菌属、欧文氏菌属、糖丝菌属、糖多孢菌属、拟无枝酸菌属、碱单胞菌属、野野村氏菌属或相关生物的菌株，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。多核苷酸也可以克隆自例如枝顶孢属、木霉属或镰孢属的菌株。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可用多种不同的方式操作该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，其介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,MolecularMicrobiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,ScientificAmerican[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和上文的Sambrook等人,1989中。串联启动子的实例披露于WO99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶–样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其变体、截短型、以及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选的终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，一种与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的多腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可包含对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。酵母宿主细胞的适合的标志包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标志包括但不限于：adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、以及其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的地用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标志可以是如WO 2010/039889中所描述的双选择性标志系统。在一个方面，双选择性标志是hph-tk双选择性标志系统。
载体优选地含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的一种或多种元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单孢菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens plantarum)亚种、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)以及浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如,Clewell,1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌词典],第8版,1995,CABInternational[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge,UK[英国剑桥]中定义的)。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner、Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(见上文)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、腐皮镰孢(Fusariumsolani)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
真菌细胞可以通过以下过程转化，该过程涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的方式再生细胞壁。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon，M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press，Inc.[学术出版社有限公司],纽约中；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；和任选地(b)回收该多肽。在一个方面，该细胞是类芽孢杆菌属细胞。在一个实施例中，类芽孢杆菌细胞是类芽孢杆菌属物种-18057细胞、类芽孢杆菌属物种-62770细胞、类芽孢杆菌属物种-62724细胞或冻原类芽孢杆菌细胞。在一个方面，该细胞是拟无枝酸菌属细胞，例如天蓝色拟无枝酸菌细胞。在一个方面，该细胞是寡养单胞菌细胞，例如嗜根寡养单胞菌细胞。在一个方面，该细胞是欧文氏菌属细胞，例如桃色欧文氏菌细胞。在一个方面，该细胞是糖丝菌属细胞，例如糖丝菌属物种-62935细胞。在一个方面，该细胞是糖多孢菌属细胞，例如内生糖多孢菌细胞。在一个方面，该细胞是碱单胞菌属细胞，例如碱单胞菌属物种-62516细胞。在一个方面，该细胞是野野村氏菌属细胞，例如迪氏野野村氏菌细胞。
宿主细胞还可以是例如枝顶孢属细胞，例如嗜碱枝顶孢细胞、木霉属细胞(例如哈茨木霉细胞)或镰孢属细胞(例如腐皮镰孢(Fusarium solani)细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对具有RNA酶活性的多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面，回收包含多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种不同的程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)。
在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个特定实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物。
在一个方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中描述的方法来产生。
酶组合物
本发明涉及组合物，这些组合物包含与一种或多种另外的组分组合的本发明的RNA酶。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。
本发明的一个实施例涉及组合物，该组合物包含：
a)至少0.001ppm(如至少0.01ppm或至少0.1ppm)的至少一种具有RNA酶活性的多肽，其中该RNA酶选自由以下组成的组：SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 12、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ IDNO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73和与其具有至少80％序列同一性的多肽；
b)至少一种佐剂成分。
本发明的一个实施例涉及清洁组合物，该清洁组合物包含：
a)至少0.001ppm(如至少0.01ppm或至少0.1ppm)的至少一种具有RNA酶活性的多肽，其中该RNA酶选自由以下组成的组：SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 9、SEQ IDNO 12、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ IDNO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73和与其具有至少80％序列同一性的多肽；
b)至少一种清洁组合物组分，优选地选自表面活性剂、助洗剂、漂白组分、聚合物、分散剂和另外的酶。
清洁组分的选择可以包括(用于纺织品护理)有待清洁的纺织品的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
表面活性剂
该洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性型和/或两性离子型、或其混合物。在一个具体实施例中，该洗涤剂组合物包含一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子型表面活性剂的混合物。该一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％(如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％)的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择该一种或多种表面活性剂，并且该一种或多种表面活性剂可以包括本领域已知的任何常规表面活性剂。
当被包括在其中时，该洗涤剂通常将含有按重量计从约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％，或从约15％至约20％，或从约20％至约25％的阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)如十二烷基硫酸钠(SDS)、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或脂肪酸盐(皂)的二酯和单酯及其组合。
当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的阳离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。
当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化的胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及以
当被包括在其中时，该洗涤剂将通常包含按重量计从约0.1％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物，及其组合。
当被包括在其中时，该洗涤剂将通常包含按重量计从约0.1％至约10％的两性离子型表面活性剂。两性离子型表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱，如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
助洗剂和共助洗剂
该洗涤剂组合物可以包含按重量计约0％-65％(如约5％至约50％)的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域已知的用于在清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
该洗涤剂组合物还可以包含按重量计0％-50％，如约5％至约30％的洗涤剂共助洗剂。洗涤剂组合物可以包括单独的共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N”-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0％-30％，例如约1％至约20％的漂白系统。可以利用包含本领域已知的用于在清洁洗涤剂中使用的组分的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括过氧化氢源；过酸源；和漂白催化剂或增效剂。
过氧化氢源：
适合的过氧化氢源是无机过酸盐，包括碱金属盐(如过碳酸钠和过硼酸钠(通常是一水合物或四水合物))，以及过氧化氢―尿素(1/1)。
过酸源：
过酸可以是(a)直接作为预形成过酸掺入，或(b)从过氧化氢和漂白活化剂(过水解)在洗涤液中原位形成，或(c)从过氧化氢和过氧化氢酶和后者适合的底物(例如酯)在洗涤液中原位形成。
a)适合的预形成过酸包括但不限于过氧羧酸(如过氧苯甲酸)及其环取代的衍生物、过氧-α-萘甲酸、过氧邻苯二甲酸、过氧月桂酸、过氧硬脂酸、ε-邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸[邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)]、和邻-羧基苯甲酰氨基过氧己酸；脂族和芳族二过氧二羧酸，如二过氧十二烷二酸、二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧巴西基酸、2-癸基二过氧丁二酸、以及二过氧邻苯二甲酸、-间苯二甲酸和-对苯二甲酸；过亚氨酸；过氧单硫酸；过氧二硫酸；过氧磷酸；过氧硅酸；以及所述化合物的混合物。应理解的是，在一些情况下，所提到的过酸可能最好是作为适合的盐的添加，如碱金属盐(例如
b)适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺、腈类或酸酐类别的那些，以及适用时，其盐。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸钠(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸钠、4-(癸酰基氧基)苯甲酸(DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸钠(NOBS)、和/或披露于WO98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且在该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋精)具有它们是环境友好的优点。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。
漂白催化剂和增效剂
该漂白系统还可以包括漂白催化剂或增效剂。
可以用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选的锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，具体地是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。这些漂白催化剂还可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。
在其中过酸的来源包括在内的一些实施例中，可以使用具有下式之一的有机漂白催化剂或漂白增效剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基或含有从11至24个碳的直链烷基，优选地每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基或含有从11至18个碳的直链烷基，更优选地每个R1独立地选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。
其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259、EP1867708(维生素K)以及WO2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。
金属护理剂
金属护理剂可以防止或减少金属的锈蚀、腐蚀或氧化，这些金属包括铝、不锈钢和非铁金属，如银和铜。适合的实例包括以下的一个或多个：
(a)苯并三唑类，包括苯并三唑或双-苯并三唑及其取代衍生物。苯并三唑衍生物是其中芳环上可获得的取代位点被部分或完全取代的那些化合物。适合的取代基包括直链或支链Ci-C20-烷基基团(例如C1-C20-烷基基团)和羟基、硫代、苯基或卤素(如氟、氯、溴和碘)。
(b)选自由以下组成的组的金属盐和络合物：锌、锰、钛、锆、铪、钒、钴，镓和铯盐和/或络合物，这些金属处于氧化态II、III、IV、V或VI之一。在一个方面，适合的金属盐和/或金属络合物可以选自由以下组成的组：Mn(II)硫酸盐、Mn(II)柠檬酸盐、Mn(II)硬脂酸盐、Mn(II)乙酰丙酮酸盐、K^TiF6(例如，K2TiF6)、K^ZrF6(例如，K2ZrF6)、CoSO4、Co(NOs)2和Ce(NOs)3、锌盐，例如，硫酸锌、水锌矿、或乙酸锌；
(c)硅酸盐，包括硅酸钠或硅酸钾、二硅酸钠、硅酸钠、结晶层状硅酸盐及其混合物。
WO 94/26860和WO 94/26859中披露了用作银/铜腐蚀抑制剂的另外适合的有机和无机氧化还原活性物质。优选地，本发明的组合物按重量计包含从0.1％至5％的金属护理剂的组合物，优选地该金属护理剂是锌盐。
水溶助剂
洗涤剂可以包含按重量计0％-10％，例如按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0％-10％(如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％)的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。适合的实例包括来自亚什兰亚跨龙公司(Ashland Aqualon)的PVP-K15、PVP-K30、ChromaBond S-400、ChromaBond S-403E和Chromabond S-100，以及来自BASF公司的
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，如染料或颜料，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，所述洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中所描述的(通过引用特此并入)。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO2007/087243中。
酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如至少一种脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与所选洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、枝顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO99/001544中的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％同一性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％同一性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司)、CellucleanTM(诺维信公司)、CellucleanClassicTM(诺维信公司)、CellusoftTM(诺维信公司)、WhitezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
甘露聚糖酶
适合的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉。适合的甘露聚糖酶描述于WO 1999/064619中。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。
过氧化物酶/氧化酶
适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
脂肪酶和角质酶
适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括如在EP 258068和EP 305216中所描述的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(这些假单胞菌属中的一些现在重命名为伯克氏菌属)的脂肪酶(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene)(EP218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO10/065455)、来自稻瘟病菌(WO10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(US5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(WO11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(WO11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)的脂肪酶和始旋链霉菌(WO12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，如描述于EP407225、WO92/05249、WO94/01541、WO94/25578、WO95/14783、WO95/30744、WO95/35381、WO95/22615、WO96/00292、WO97/04079、WO97/07202、WO00/34450、WO00/60063、WO01/92502、WO07/87508以及WO09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
仍其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO10/100028)。
淀粉酶
适合的淀粉酶包括α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
适合的淀粉酶包括具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424中以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
不同的适合的淀粉酶包括具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包括WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置(如181和182、182和183、或位置183和184)中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO01/66712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO 13184577的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQ IDNO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K、以及G477K，和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
E187P+I203Y+G476K
E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K
其中这些变体任选地进一步包含在位置241处的取代和/或在位置178和/或位置179处的缺失。
另外的适合的淀粉酶是具有WO10104675的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQ IDNO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K、以及G478K，和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N21D+D97N+V128I
其中这些变体任选地进一步包含在位置200处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
其他适合的淀粉酶是具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ IDNO:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
其他实例是淀粉酶变体，如在WO 2011/098531、WO 2013/001078和WO 2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、StainzymePlusTM、NatalaseTM、Liquozyme X and BANTM(来自诺维信公司)，和RapidaseTM、PurastarTM/EffectenzTM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100和Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(DuPont))。
蛋白酶
适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(如胰蛋白酶)或S8家族的(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人,Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶的亚组。丝氨酸蛋白酶是特征在于在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)；以及描述于WO 89/06279中的迟缓枯草杆菌蛋白酶(subtilisin lentus)、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO 89/06270、WO 94/25583和WO 05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的糜蛋白酶(描述于WO 05/052161和WO 05/052146中)。
另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在(例如)WO95/23221中所描述)、以及其变体(在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993(杰能科国际有限公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 92/19729、WO 96/034946、WO98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO 04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下一个或多个位置中具有取代的变体：3、4、9、15、24、27、42、55、59、60、66、74、85、96、97、98、99、100、101、102、104、116、118、121、126、127、128、154、156、157、158、161、164、176、179、182、185、188、189、193、198、199、200、203、206、211、212、216、218、226、229、230、239、246、255、256、268和269，其中这些位置对应于WO 2016/001449的SEQ ID NO 1中所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的位置。更优选的枯草杆菌酶变体可以包括以下突变中的一个或多个：S3T、V4I、S9R、S9E、A15T、S24G、S24R、K27R、N42R、S55P、G59E、G59D、N60D、N60E、V66A、N74D、N85S、N85R、、G96S、G96A、S97G、S97D、S97A、S97SD、S99E、S99D、S99G、S99M、S99N、S99R、S99H、S101A、V102I、V102Y、V102N、S104A、G116V、G116R、H118D、H118N、N120S、S126L、P127Q、S128A、S154D、A156E、G157D、G157P、S158E、Y161A、R164S、Q176E、N179E、S182E、Q185N、A188P、G189E、V193M、N198D、V199I、Y203W、S206G、L211Q、L211D、N212D、N212S、M216S、A226V、K229L、Q230H、Q239R、N246K、N255W、N255D、N255E、L256E、L256D、T268A、R269H。这些蛋白酶变体优选地是在WO2016/001449的SEQ ID NO 1中所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶
在以下一个或多个位置(对应于WO 2004/067737的SEQ ID NO:1的位置171、173、175、179或180)处包含取代的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体与WO 2004/067737的SEQID NO:1具有至少75％但少于100％的序列同一性。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：
过氧化物酶/氧化酶
根据本发明的过氧化物酶是由酶分类EC 1.11.1.7囊括的由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(IUBMB)规定的酶，或来源于其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中所描述的那些。
适合的过氧化物酶包括卤代过氧化物酶，如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及表现出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶进行分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。已从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如，疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
还已从细菌，如假单胞菌属(例如吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
适合的氧化酶特别包括由酶分类EC 1.10.3.2所包含的任何漆酶或来源于其的展现出漆酶活性的任何片段、或展现出类似活性的化合物，如儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。优选的漆酶是微生物来源的酶。该酶可以来源于植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。来自真菌的适合实例包括可来源于以下的菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属(例如，粗糙脉孢菌)，柄孢壳菌属，葡萄孢属，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属，侧耳属，栓菌属(例如，长绒毛栓菌和变色栓菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))，斑褶菇属(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，Schytalidium(例如，S.thermophilum)，多孔菌属(例如，P.pinsitus)，射脉菌属(例如，射脉侧菌(P.radiata))(WO 92/01046)或革盖菌属(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))(JP 2238885)。来自细菌的适合的实例包括可来源于芽孢杆菌属的菌株的漆酶。优选的是来源于拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是来源于灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或来源于嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。
分散剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。特别地，粉状洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。适合的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司]中。
染料转移抑制剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂
本发明的洗涤剂组合物将优选地还包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，该增亮剂优选地以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物型的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选的是荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals andChemicals)供应。适合用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污垢释放聚合物
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉和基于聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷,第7章,马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如在WO 2009/087523中详细描述的(通过引用特此并入)。此外，随机接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO 2006/108856以及WO 2006/113314中(通过引用特此并入)。适合的聚乙二醇聚合物包括随机接枝共聚物，该随机接枝共聚物包含：(i)含有聚乙二醇的亲水主链；和(ii)选自由以下组成的组的一个或多个侧链：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和C1-C6单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯、及其混合物。适合的聚乙二醇聚合物具有聚乙二醇主链和随机接枝的聚乙酸乙烯酯侧链。聚乙二醇主链的平均分子量可以在2,000Da至20,000Da的范围内、或在4,000Da至8,000Da的范围内。聚乙二醇主链与聚乙酸乙烯酯侧链的分子量比率可以在1:1至1:5的范围内、或在1:1.2至1:2的范围内。每个环氧乙烷单元的平均接枝位数可小于1、或小于0.8，每个环氧乙烷单元的平均接枝位数可以在0.5至0.9的范围内，或每个环氧乙烷单元的平均接枝位数可以在0.1至0.5的范围内、或在0.2至0.4的范围内。适合的聚乙二醇聚合物是Sokalan HP22。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如EP 1867808或WO 2003/040279中所描述的那些(两者都通过引用特此并入)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、两性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下所描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。
流变改性剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自由以下组成的组：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度，例如，如在EP 2169040中所示。
其他适合的清洁组合物组分包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、运载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹力剂。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，膏，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。
袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合用于容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，其包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司(MonoSol LLC)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。可以用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同：US2009/0011970 A1。
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分开。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0％-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
颗粒洗涤剂配制品
本发明的一种或多种组合物可以被配制为颗粒，例如，配制为结合一种或多种酶的共颗粒。然后，每种酶将存在于多种颗粒中，这些颗粒确保酶在洗涤剂中的分布更均匀。这还减少了由于不同的粒度，不同酶的物理隔离。用于生产针对洗涤剂工业的多酶共颗粒的方法披露于IP.com披露内容IPCOM000200739D中。
通过使用共颗粒的酶的配制品的另一个实例披露于WO 2013/188331中，其涉及包含以下项的洗涤剂组合物：(a)多酶共颗粒；(b)少于10wt沸石(无水的基础上)；和(c)少于10wt磷酸盐(无水的基础上)，其中所述酶共颗粒包含从10wt％至98wt％的水分汇组分(sink component)，并且该组合物另外还包含从20wt％至80wt％的洗涤剂水分汇组分。
多酶共颗粒可以包含本发明的RNA酶和(a)一种或多种选自以下的酶：半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、玻璃酸酶、软骨素酶、淀粉酶、及其混合物。
用途
具有RNA酶活性的本发明的多肽可以用于深度清洁物品，例如纺织品。在本发明的一个实施例中，涉及根据本发明的RNA酶用于防止减少或去除恶臭的用途。本发明的一个实施例涉及本发明的RNA酶用于对经过多次洗涤的纺织品进行抗再沉积的防止或减少和/或用于改进白度的用途。当生物膜组分(例如细胞外生物膜基质的RNA)被去除或减少时，由生物膜引起的粘性也会降低。因此，当将本发明的组合物应用于清洁过程如洗衣时，本发明的RNA酶降低了纺织品的灰度。
本发明的一个方面涉及具有RNA酶活性的多肽的用途，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:72和SEQID NO:73和与其具有至少80％序列同一性的多肽，该用途为：
(i)用于防止、减少或去除物品的粘性；
(ii)用于预处理物品上的污渍；
(iii)用于在洗涤循环期间防止、减少或去除污垢的再沉积；
(iv)用于防止、减少或去除污垢在物品上的附着；
(v)用于维持或改进物品的白度；和/或
(vi)用于防止、减少或去除物品的恶臭，
其中该物品是纺织品。
实例
测定
迷你Launder-O-Meter(迷你LOM)标准洗涤系统
迷你LOM是Launder-O-Meter(LOM)的修饰的迷你洗涤系统，其是中等规模标准洗涤系统，它可以应用于同时测试多达20种不同洗涤条件。LOM基本上是大型的具有20个封闭金属烧杯在其中旋转的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的洗涤机并且在一次实验过程中，每个试管将包含一种具有特定的有待测试的洗涤剂/酶系统连同在关于其进行测试的弄脏的和未弄脏的织物。机械压力由在水浴中旋转的烧杯并且由包括在烧杯中的金属球实现。在衣物洗涤实验中使用微型洗涤测定来评估洗涤性能，该微型洗涤测定是一种测试方法，其中将弄脏的纺织品在测试溶液中连续地提起并放下并且随后冲洗。
在以下指定的实验条件下进行洗涤实验：
Δ反射值(ΔRem)：本文将术语“Δ反射”或“Δ反射值”定义为在某一波长处(典型地为460nm)的反射比或反射测量的结果。用一种具有类似颜色的小块布样，优选一种来自重复洗涤的小块布样作为背景测量该小块布样。在洗涤之前，测量代表每种小块布样类型的小块布样。Δ反射是洗涤的小块布样的反射值减去未洗涤的小块布样的反射值。
测定I：RNA酶活性的测试
使用荧光猝灭的寡核苷酸探针通过荧光确定RNA酶活性。根据供应商的手册(RNA酶警报试剂盒(RNase alert kit)，DNA集成技术公司(Integrated DNA Technology)，科拉尔维尔(Coralville)，爱荷华州(Iowa)，美国),该探针在核酸酶降解后发出信号。简言之，将RNA酶在水(硬度15°dH)中稀释以获得2ppm的浓度，并将5μl的底物添加至95μl的RNA酶样品中。在22℃使用Clariostar酶标仪(在490nm处激发，在520nm处发射)测量动力学曲线10min。
表1：2ppm处的酶活性(10min后的RFU)。
实例1：本发明的细菌RNA酶多肽的克隆和表达
RNA酶来源于通过标准微生物分离技术从环境样品分离的细菌菌株或来源于混合细菌群落。鉴别分离的纯菌株并基于16S核糖体基因的DNA测序对分类进行指定(表2)。菌株天蓝色拟无枝酸菌(DSM43854)购自德国布伦瑞克(Braunschweig)的德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)。
表2：
用来自凯杰公司(Qiagen)(希尔登，德国)的DNA酶血液和组织试剂盒(DNeasyBlood&Tissue Kit)从单个菌株的纯培养物或混合培养的群落(在环境样品群落E的情况下)中分离染色体DNA，并使用Illumina技术进行全基因组测序。基因组测序，随后的读取的组装和基因发现(即基因功能的注释)对于本领域技术人员是已知的并且这些服务是可商购的。
分析来自PFAM数据库家族PF00545(R.D.Finn等人,Nucleic Acids Research[核酸研究](2014),42:D222-D230)的推定的RNA酶的基因组序列。该分析鉴别了十五个编码推定的RNA酶的基因，这些基因随后被克隆并在枯草芽孢杆菌中重组表达。
除环境样品群落E外，所有菌株基因组中RNA酶基因周围的基因组区域分析表明，RNA酶与操纵子中的小蛋白抑制剂天然共表达，其中单个启动子驱动两个基因的表达，抑制剂基因位于RNA酶基因的下游。从文献中已知，抑制剂的共表达可以有益于潜在毒性酶的表达(Hartley RW,J Mol Biol.[分子生物杂志]1988年8月20日；202(4):913-5)，因此抑制剂包括在重组表达盒中，用于表达与抑制剂一起天然共表达的这些RNA酶。来自环境样品群落E的RNA酶不具有下游抑制剂基因，并且因此重组表达而不共表达抑制剂。
通过PCR，将编码RNA酶和任何下游抑制剂的基因扩增为单个扩增子，并将其与调节元件、亲和纯化标签和同源区融合以重组到枯草芽孢杆菌基因组的pel基因座中。
线性整合构建体是SOE-PCR融合产物(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.和Pease,L.R.(1989)Engineering hybrid genes without the use of restrictionenzymes,gene splicing by overlap extension[不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接进行的工程化杂种基因]Gene[基因]77:61-68)，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌染色体区域之间的基因连同强启动子与氯霉素抗性标志的融合制备。专利申请WO 2003/095658中也描述了SOE PCR方法。
在三联启动子系统(如WO 99/43835中所描述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyQ)和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。
用编码克劳氏芽孢杆菌分泌信号的DNA(编码以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQ ID NO 24))代替天然的分泌信号来融合基因。此外，表达构建体导致向成熟RNA酶添加由氨基酸序列HHHHHHPR(SEQ ID NO 25)组成的氨基末端聚组氨酸尾。
该SOE-PCR产物被转化进枯草芽孢杆菌中并且在染色体上通过同源重组将其整合到果胶裂解酶基因座中。随后将包含该整合表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。将培养液离心(20000xg，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开，并用于酶的纯化，或可替代的将无菌过滤的上清液直接用于测定。
实例2：通过镍亲和色谱法纯化重组酶
将澄清上清液的pH调节至pH 8，通过0.2μM滤器进行过滤，并且将上清液施加于5ml HisTrapTMexcel柱上。在加载之前，该柱已经在5个柱体积(CV)的50mM Tris/HCl pH 8中平衡。为了去除未结合的材料，将该柱用8CV的50mM Tris/HCl pH 8洗涤，并且靶标的洗脱是用50mM HEPES pH 7+10mM咪唑获得。将洗脱的蛋白在HiPrepTM26/10脱盐柱上进行脱盐，将该脱盐柱使用3CV的50mM HEPES(pH 7)+100mM NaCl进行平衡。也将此缓冲液用于靶标的洗脱，并且流速是10ml/min。选择相关级分，并且基于色谱图和SDS-PAGE分析进行合并。
实例3：来自嗜碱枝顶孢和哈茨木霉的RNA酶的克隆和表达
菌株
将购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(生命科技公司(LifeTechnologies)欧洲私人有限公司，奈鲁姆
米曲霉MT3568菌株用于异源表达核糖核酸酶多肽。米曲霉MT3568菌株是米曲霉JaL355菌株的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(描述于WO 2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。
嗜碱枝顶孢CBS114.92购自CBS-KNAW公司(真菌生物多样性中心(乌得勒支(Utrecht)，荷兰))。根据荷兰菌种保藏中心(Central Bureau vorSchnimmelkultur)，由A.Yoneda在1984年从日本的津久井湖(Tsukui Lake)附近的猪粪便堆肥的污泥中分离出alcalohilum枝顶孢(Acremonium alcalohilum)CBS114.92。
哈茨木霉CBS223.93(最初命名为A00611)以代码CBS223.93保藏在荷兰乌得勒支的荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)。该菌株于1968年从SwissFerment公司(Swiss Ferment A/G)获得。
培养基和溶液
堀越(Horikoshi)琼脂培养基由以下组成：1％(w/v)右旋糖、1％可溶性淀粉、0.5％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物、0.02％(w/v)MgSO4.7H20、0.1％(w/v)K2HPO4、以及15g(w/v)的细菌用琼脂(Bacto-agar)。在灭菌后分开添加1％(w/v)Na2CO3。
PDA板由39g马铃薯右旋糖琼脂(德国慕尼黑的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、和补足至1000ml的去离子水组成。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。
LB-肉汤(Bouillon)由以下组成：25g LB肉汤(Bouillon)(参考L3152)(德国达姆施塔特(Darmstadt)的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))、和补足至1000ml的去离子水。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological AnalyticalManual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。
氨苄青霉素LB-琼脂板由以下组成：37g LB琼脂(参考L3027)(德国达姆施塔特的西格玛奥德里奇公司)、5g可溶性淀粉、0.01M K2PO4、0.04％葡萄糖、和补足至1000ml的去离子水。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological AnalyticalManual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。该培养基冷却到50℃并且添加50mM的氨苄青霉素。
COVE-N琼脂板由以下组成：218g的山梨醇、25g的琼脂粉、50mL的COVE盐溶液、和补足至1升的去离子水。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。将该培养基冷却至50℃并且添加10mM乙酰胺和Triton X-100(50μL/500mL)。
COVE盐溶液由以下组成：26g的MgSO4.7H2O、26g的KCL、76g的KH2PO4、50mL的COVE痕量金属溶液、和补足至1升的去离子水。将溶液无菌过滤。
COVE痕量金属溶液由以下组成：0.04g的Νa2Β4Ο7.10Η2Ο、0.4g的CuSO4.5H2O、1.2g的FeSO4.7H2O、0.7g的MnSO4.H2O、0.8g的Na2MoO4.2H2O、10g的ZnSO4.7H2O、和补足至1升的去离子水。将溶液无菌过滤。
DAP4C-1培养基由以下组成：0.5g酵母提取物、10g麦芽糖、20g右旋糖、11gMgSO4.7H2O、1g KH2PO4、2g C6H8O7.H2O、5.2g K3PO4.H2O、1mL Dowfax 63N10(抑泡剂)、2.5g碳酸钙，补充有0,5mL KU6痕量金属溶液、和补足至1000mL的去离子水。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。在使用前，每150ml DAP4C-1培养基添加3.5mL无菌50％(NH4)2HPO4和5mL无菌20％乳酸。
YP 2％葡萄糖培养基由以下组成：10g酵母提取物、20g细菌用蛋白胨、20g右旋糖、和补足至1000ml的去离子水。该培养基通过在15psi高压杀菌15分钟来进行灭菌(Bacteriological Analytical Manual[细菌学分析手册],第8版,修订A,1998)。
KU6痕量金属溶液由以下组成：6.8g ZnCl2、2.5g CuSO4.5H2O、0.13g NiCl2、13.9gFeSO4.7H2O、8.45g MnSO4.H2O、3g C6H8O7.H2O、和补足至1000mL的去离子水。将溶液无菌过滤。
序列扩增和克隆
来自SEQ ID NO 14中所示的嗜碱枝顶孢的RNA酶(SEQ ID NO 15中所示的成熟多肽)：
通过JGI(https://genome.jgi.doe.gov/Acral2/Acral2.home.html)对嗜碱枝顶孢菌株JCM 7366(ATCC 90507)进行测序，并将基因组进行组装和注释。在该基因组的组装中鉴别了9521个基因模型。在这些序列中鉴别了编码具有SEQ ID NO 14的多肽的核糖核酸酶，该多肽包含预测的细胞外分泌信号(1-17)和预测的PFAM00545结构域(47-127)。对于嗜碱枝顶孢(A.alcalophilum)基因组DNA的制备，将嗜碱枝顶孢CBS114.92菌株在pH 9的堀越琼脂上在30℃繁殖7天。
来自SEQ ID NO 69中所示的哈茨木霉的RNA酶(SEQ ID NO 72中所示的成熟多肽)：
使用Illumina测序配对末端技术对哈茨木霉菌株A00611进行测序，使用IDBA-UDv1.0.9方法(Peng,Y.等人,(2012)Bioinformatics[生物信息学])生成基因组从头组装，并使用GeneMark v2.3c(Ter-Hovhannisyan,V.等人,(2008)Genome Res.[基因组研究])生成了基因组注释。在该组装内鉴别了编码具有SEQ ID NO 69的多肽的核糖核酸酶，该多肽包含预测的细胞外分泌信号(1-15)和预测的PFAM00545结构域(45-127)。为了制备哈茨木霉基因组DNA，将菌株A00611接种到PDA板上并且在26℃于黑暗中孵育8天。将若干个菌丝体-PDA塞接种到含有100ml的YP 2％葡萄糖培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶在26℃以100rpm振荡孵育5天以产生生物质。
根据用于污垢方案(Soil protocol)的
Alca166-FACACAACTGGGGATCCACCATGCACTTGTCCGCCGTCTTC(SEQ ID NO 26)
Alca166-R CCCTCTAGATCTCGAGCCCAGCTTTCCCGAGTCTCTT(SEQ ID NO 27)
MDQM1692-FACACAACTGGGGATCCACCATGAAGTTCCTCGGTCTCCTCTCC(SEQ ID NO 74)
MDQM1692-RAGATCTCGAGAAGCTTACTAAGAAGTACCGGCGCAAGCAA(SEQ ID NO 75)；
0.25μL基因组DNA模板(来自嗜碱枝顶孢或哈茨木霉)、0.5μL Phusion高保真DNA聚合酶目录号参考M0530(2000U/mL)(新英格兰实验室，生物诺沃挪第克丹麦公司，海莱乌，丹麦)；和PCR级水补充至25μL。
使用以下程序在热循环仪T100(伯乐公司(Biorad)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州，美国)上孵育PCR反应：在98℃初始变性2min，然后在98℃进行35个10sec的循环，在72℃进行0.5min，最后在72℃最终延伸10min。使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳分析五μl PCR反应，其中观察到大约500碱基对的DNA条带。根据制造商的说明，使用ILLUSTRATMGFXTMPCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(Gel Band Purification Kit)参考28-9034(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国)纯化剩余的PCR反应。
使用预先用BamHI和HindIII限制酶消化的表达载体pDAu109(WO 2005/042735)中的InFusion HD Plus EcoDry克隆系统试剂盒(宝生物公司(Takara)，草津市(Kusatsu)，日本)并按照制造商的说明书来克隆编码核糖核酸酶SEQ ID NO 15(用于嗜碱枝顶孢)和SEQID NO 72(用于哈茨木霉)的DNA序列。将2.5μL体积的五倍稀释的连接混合物用于转化25μL的大肠杆菌TOP10(参见以上菌株说明)化学感受态细胞(生命科技公司(LifeTechnologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)。从含有50μg的氨苄青霉素/mL的LB琼脂板中选择两个菌落并在3mL的补充有100μg的氨苄青霉素/mL的LB培养基中培养过夜。根据制造商的说明，使用凯杰公司旋转迷你制备型(Spin Miniprep)试剂盒(目录27106)(凯杰股份有限公司(QIAGEN GmbH)，希尔登，德国)纯化质粒DNA。通过Sanger DNA测序仔细检查通过
米曲霉MT3568菌株的原生质体是根据WO 95/002043制备的。将100μL的米曲霉原生质体与1-3μg编码核糖核酸酶多肽SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 72的质粒以及270μL的60％PEG 4000(德国达姆施塔特的艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4000)、10mMCaCl2和10mM Tris-HCl pH 7.5混合，并且轻轻混合。将混合物在37℃孵育30分钟并且将原生质体涂布在含有10mM乙酰胺的COVE板上。在37℃孵育4-7天后，将四个菌落的孢子接种到来自赛默飞世尔科技公司(生命科技公司欧洲私人有限公司，奈鲁姆，丹麦)的96孔X50微量滴定板PS中的DAP4C-1培养基中，并用半透胶带覆盖。在30℃静置培养4天后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析培养液，以鉴别产生最高量核糖核酸酶多肽的菌落。将最好的转化体的孢子涂布于含有0.01％
实例4：纯化来自嗜碱枝顶孢中的RNA酶
通过离子交换色谱法(通过将过滤的肉汤加载到预先在50mM乙酸盐pH 4.5缓冲液中平衡的CaptoTMS柱(参考17-5441-03)(通用电气医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)上)将嗜碱枝顶孢RNA酶纯化。用3CV 50mM乙酸盐pH 4.5缓冲液洗涤柱。用线性梯度100％的50mM乙酸盐和1M NaCl pH 4.5(超过5CV)进行结合蛋白的洗脱。在色谱法期间中收集10mL的级分，并在色谱法期间观察到10mL/min的洗脱流。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析所有级分，并且合并含有RNA酶的级分。使用A280/E280方法(Stoscheck,CM.Quantitation of Protein[蛋白质定量].Methods in Enzymology[酶学方法]182:50-69.1990)进行RNA酶的定量。实例5：来自腐皮镰孢的RNA酶的克隆、表达和发酵
属于PFAM蛋白家族PF00545的RNA酶编码基因(R.D.Finn等人,Nucleic AcidsResearch[核酸研究](2016),D44:D279-D285)从丹麦收集的环境样品中分离的腐皮镰孢菌株中克隆。
从腐皮镰孢菌株的纯培养物中分离染色体DNA，并将DNA样品送至丹麦维德伯克(Vedbaek)的埃克西库恩公司(Exiqon A/S)进行全基因组测序。随后用SPAdes GenomeAssembler v3.5.0组装基因组序列，并用GeneMark v2.3c基因预测软件进行注释。
搜索从已注释的基因组预测的一组肽序列与PF00545结构域的相似性，并发现具有SEQ ID NO:73的肽。从分离自腐皮镰孢的基因组DNA对相应的DNA序列(SEQ ID NO:70)进行PCR扩增，其中基因特异性引物也在起始密码子的5’附近附加Kozak翻译起始序列“TCACC”，并克隆到已经用BamHI和XhoI消化的曲霉属表达载体pMStr57(WO 2004/032648)中。
对克隆的RNA酶编码基因进行测序并确认其与基因组序列中发现的相应基因相同，并通过Christensen等人,1988,Biotechnology[生物技术]6,1419-1422和WO 2004/032648中描述的方法转化到米曲霉菌株MT3568(WO 2011/057140)中。基于由表达载体中的选择性标志赋予的能力，在从原生质体再生期间选择转化体，以利用乙酰胺作为氮源，并且随后在选择下将这些转化体再分离两次。
通过在96孔深孔微量滴定板中在30℃在0.25ml的YPG培养基(WO 05/066338)中和DAP-4C-1培养基(WO 2012/103350)中将转化体培养4天并通过SDS-PAGE监测重组表达来评估重组RNA酶的产生。为了更大规模生产重组RNA酶，基于重组产率选择单个曲霉属转化体，并在含有150ml DAP-4C-1培养基的500ml带挡板的烧瓶中进行培养。将培养物在旋转台上在30℃的温度以150RPM振荡4天。随后将培养液通过穿过0.22um过滤单元与细胞材料分离。
实例6：来自腐皮镰孢和哈茨木霉的重组RNA酶的色谱纯化
将经过滤的样品的pH调节至约pH 7.5，并添加1.8M硫酸铵。将该样品施加至
流速为5ml/min。
通过测量280nm处的吸收来估计最终样品中的蛋白质浓度。
实例7：RNA酶在标准洗涤剂中的性能。
洗涤实验A
将带有短波单胞菌属物种的五个冲洗的小块布样与五个无菌Cotton WFK10A小块布样在50mL试管中混合，并添加10mL洗涤剂洗涤溶液，该溶液含有上述浓度的以下洗涤剂组合物：标准洗涤剂A(EU，3.3g/L)，一起添加0.7g/L污垢(Pigmentschmutz，09V，wfk，克雷费尔德(Krefeld)，德国)和在合成寡核苷酸底物测定(测定I)中具有活性的SEQ ID NO 3、6、9、12和15中所示的RNA酶(0.2和1ppm)。在22℃，将试管放入斯图尔特(Stuart)旋转器(迷你LOM)中，持续1小时。将小块布样用自来水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。作为对照，平行进行用提及的洗涤剂且不添加RNA酶的洗涤。使用Color Eye(Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计)测量460nm处的缓解(L值)。在入射光中没有UV的情况下进行测量。
使用以上提到的所谓的EU条件，即3.3g/L洗涤剂和硬度为15°dH的水(Ca:Mg:NaHCO3 4:1:1.5)。Δ反射值示出于表3中。
表3：RNA酶的洗涤结果
本实例显示了RNA酶在有细菌(供体)预生长的棉小块布样品中的抗灰化作用。观察到的作用归因于RNA酶的深度清洁，因此获得对细菌细胞外聚合物(EPS)的土壤粘附性的降低。重要的是，本实例显示，RNA酶防止污垢在洗涤中在不同纺织品之间转移，并且因此允许脏衣物与不太脏的衣物一起洗涤。这确保了改进纺织品的白度。
洗涤实验B.
将带有木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)的五块冲洗的小块布样添加到50mL试管中，并添加10mL洗涤剂洗涤溶液，该溶液含有上述浓度的以下洗涤剂组合物：标准洗涤剂A(EU，3.3g/L)，一起添加0.7g/L污垢(Pigmentschmutz，09V，wfk，克雷费尔德(Krefeld)，德国)和在合成寡核苷酸底物测定(测定I)中具有活性的SEQ ID NO 3或SEQ IDNO 64中所示的RNA酶(5ppm)。在30℃，将试管放入斯图尔特(Stuart)旋转器(迷你LOM)中，持续1小时。将小块布样用自来水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。作为对照，平行进行用提及的洗涤剂且不添加RNA酶的洗涤。使用Color Eye(Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计)测量460nm处的缓解(L值)。在入射光中没有UV的情况下进行测量。
使用EU条件：3.3g/L洗涤剂和硬度为15°dH的水(Ca:Mg:NaHCO34:1:1.5)。Δ反射值示出于表4中。
表4：RNA酶的洗涤结果
洗涤实验A和B的结果显示了RNA酶在有细菌(供体)预生长的棉小块布样品中的抗灰化作用。观察到的作用归因于RNA酶的深度清洁，获得对细菌细胞外聚合物(EPS)的土壤粘附性的降低。重要的是，本实例显示，RNA酶将预防污垢在洗涤中在不同纺织品之间转移并且因此脏衣物能够与不太脏的衣物一起洗涤。这确保了改进纺织品的白度。
实例8：通过RNA酶减少来自真实物品提取物的核酸
在真实消费者洗衣研究中，使用了来自十二对不同袜子的十二只袜子(每对一只袜子)(沃里克伊奎斯特公司(Warwick Equest))。形成来自2对不同袜子的2只袜子的六个组并测试RNA酶作用。从每个袜子中随机切割八个2cm直径小块布样的样品，其中四个来自脚底部分，四个来自脚后跟。对于袜子的每个部分，将一个小块布样添加到50ml试管中。对于每组，获得装有4个小块布样的4个试管，总共24个试管和96个小块布样。向试管中添加10mL洗涤剂洗涤溶液，该溶液含有以下洗涤剂组合物：一管含有标准洗涤剂A(EU，3.3g/L)且不含酶(对照)，以及三管含有标准洗涤剂A(EU，3.3g/L)和在合成寡核苷酸底物测定(测定I)中具有活性的SEQ ID NO 64或SEQ ID NO 72中所示的RNA酶(1ppm)。使用EU条件：3.3g/L洗涤剂和硬度为15°dH的水(Ca:Mg:NaHCO3 4:1:1.5)。在30℃，将试管放入斯图尔特(Stuart)旋转器(迷你LOM)中，持续1小时。接下来，将小块布样在水(硬度15°dH)中冲洗。为了去除过量的水，将样品转移到Sartorius
为了提取，将离心的样品转移到50mL无DNA酶-RNA酶的试管(莎斯特公司(Sarstedt))中，并添加4ml无RNA酶的缓冲液(0.1％v/v DEPC，10mM EDTA，0.9％NaCl pH4.5)。在室温，将试管放入斯图尔特(Stuart)旋转器(迷你LOM)中，持续1小时。按供应商协议的建议，向每管100μl提取物样品中添加100μl Quant-ITTM
结果在下面呈现为对照和RNA酶样品之间的荧光信号减少百分比。
表5：
该实验的结果显示，RNA酶可以减少真实消费者洗衣物品中存在的核酸的量。
实例9：RNA酶活性
将RNA酶在水(硬度15°dH)或标准洗涤剂B(EU，3.3g/L)中稀释以分别获得0.1ppm和1ppm的浓度，并将5μl的底物添加至95μl的RNA酶样品中。通过溶解含有7.2％LAS、6.6％AEO Biosoft N25-7(Nl)、4.2％AEOS(SLES)、6％MPG(单丙二醇)、3％乙醇、3％TEA(三乙醇胺)、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、1.2％氢氧化钠、2％柠檬酸钠、1％甲酸钠、0.2％DTMPA和0.2％PCA(丙烯酸)的3.33g/l标准洗涤剂B来制备标准洗涤剂B洗液(100％)。所有百分比均为w/w(重量/重量)。
在22℃使用Spectramax酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices))(在490nm处激发，在520nm处发射)测量动力学曲线10min。下表6a和6b显示在水或标准洗涤剂B中测量的RNA酶活性。
表6a.水中酶活性(10min后RFU)
表6b.标准洗涤剂B中的酶活性(10min后RFU)
实例10：进化枝和系统发育树的构建
核糖核酸酶结构域包括本发明的具有RNA酶活性的多肽并且包含Barnase结构域以及如进化枝的簇。
如PFAM(PF000545，Pfam版本31.0，Finn(2016)Nucleic Acids Research[核酸研究],Database Issue[数据库卷]44:D279-D285)中所定义的，构建含有Barnase结构域的多肽序列的系统发育树。系统发育树是从包含至少一个Barnase结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar,2004.Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5):1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人,2010,PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用iTOL(Letunic和Bork,2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1):127-128)对树进行可视化。
Barnase中的多肽可以分成多个不同的子簇或进化枝，其中我们表示了下面列出的进化枝。下面详细描述每个进化枝的不同基序。
EYTV进化枝的生成
EYTV进化枝包含细菌来源的Barnase多肽，该多肽具有RNA酶活性并且包含基序实例EYTV(SEQ ID NO:28)(对应于SEQ ID NO 9天蓝色拟无枝酸菌(A.azurea)的位置93至96)，其中E(对应于SEQ ID NO 9的位置93)在该进化枝中是完全保守的。
在一个实施例中，该进化枝的多肽可包含延伸基序YXEYTVXTPXXXXRGXRR(SEQ IDNO:78)，其中每个X可以独立地是任何天然存在的氨基酸。
来自金色链霉菌(SEQ ID:76)的参考酶RNA酶Sa3的结构由包含中心五链扭曲反平行β-片层的疏水核心组成，并且基序EYTV对应于中央β片层的第二N-末端β链(SEQ ID:76的残基99-102)的一部分(J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2002；277:47325-30)。破坏β-片层中β链之间氢键的氨基酸改变会降低整体酶的稳定性。EYTV基序的Glu(E)残基充当通用碱基，并且被认为是催化所必需的。
EAD进化枝的生成
EAD进化枝包含细菌来源的Barnase多肽，该多肽具有RNA酶活性并且包含基序实例[YRF]E[AYFWC]D(SEQ ID NO:29)(对应于SEQ ID NO 3类芽孢杆菌属物种-18057的位置100至103)，其中E(对应于SEQ ID NO 3的位置101)在EAD进化枝中是完全保守的。
在一个实施例中，该进化枝的多肽可包含延伸基序[WY][YRF]E[AYFWC]D[IV](SEQID NO:79)。
该进化枝的多肽还可以包含基序IGGD(SEQ ID NO:30)，其对应于SEQ ID NO 3的位置79至82。
在一个实施例中，该进化枝的多肽(具有基序IGGD)可包含延伸基序GXXIGGDXFXN(SEQ ID NO:80)，其中每个X可以独立地是任何天然存在的氨基酸。
来自解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID:34)的参考酶Barnase的结构由包含中心五链扭曲反平行β-片层的疏水核心组成，并且基序IGGD对应于中央β片层的第一N-末端β链(SEQ ID:34的残基98-101)以及EAD基序对应于第二β链(SEQ ID:34的残基120-122)(Nature[自然]1982年5月13日；297:162–164)。破坏β-片层中β链之间氢键的氨基酸改变会降低整体酶的稳定性(J Mol Biol.[分子生物杂志]1992年6月5日；225(3):585-9)。EAD基序的Glu(E)残基充当通用碱基，并且被认为是催化所必需的。
YPH进化枝的生成
YPH进化枝包含真菌来源的Barnase多肽，该多肽具有RNA酶活性并且包含基序实例YPH(SEQ ID NO:31)(对应于SEQ ID NO 15嗜碱枝顶孢的位置45至47)，其中所有三个氨基酸在该进化枝中是完全保守的。
在一个实施例中，该进化枝的多肽(具有基序YPH)可包含延伸基序YPHX[YFA]X[ND]XE(SEQ ID NO:81)，其中每个X可以独立地是任何天然存在的氨基酸。
该进化枝的多肽还可以包含基序DRV(SEQ ID NO:33)(对应于SEQ ID NO 15的位置82至84)，其中R(对应于SEQ ID NO 9的位置83)在进化枝中是完全保守的。
在一个实施例中，该进化枝的多肽(具有DRV基序)可包含延伸基序PGXDRV(SEQ IDNO:82)，其中X可以独立地是任何天然存在的氨基酸。
该进化枝的多肽还可以包含基序HTGA(SEQ ID NO:32)，其对应于SEQ ID NO 15的位置99至102。
在一个实施例中，该进化枝的多肽(具有基序HTGA)可包含延伸基序THTGA[SR]G(SEQ ID NO:83)。
图1中显示了本发明的一些多肽(SEQ ID NO 3、6、9、12和15)的比对。
来自藤仓赤霉菌的参考酶RNA酶F1(SEQ ID:77)的结构由包含中心五链扭曲反平行β-片层的疏水核心组成。基序YPH对应于中央β片层的第一N-末端β链的一部分(SEQ ID:77的残基63-65)，以及DRV基序对应于第三β链的一部分(SEQ ID:77的残基100-102)(J MolBiol.[分子生物杂志]1993；230(3):979-96)。HTGA基序对应于RNA酶F1结构中的转角区域(SEQ ID:77的残基116-119)，并且认为HTGA基序的组氨酸残基对酶的催化活性是必需的。破坏β-片层中β链之间氢键的氨基酸改变会降低整体酶的稳定性(J Mol Biol.[分子生物杂志]1992年6月5日；225(3):585-9)。
