一种地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
角蛋白是一种不溶于水、盐液、稀酸或稀碱的蛋白质，自然界中主要来源为动物的毛发和指甲等，其不易被常见的蛋白酶降解，属于硬性蛋白物质。区域性积累的富含角蛋白残留物存在潜在的环境问题，如在厌氧条件下会产生硫化氢和氨。废物管理方式通常是焚烧，成本高昂，对环境危害也大。利用微生物的降解角蛋白，不仅成本低，并且对角蛋白的降解较为彻底，可以用来获取动物饲料或氮肥。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种革兰氏阳性嗜热菌。活性地衣芽孢杆菌是一种高活性微生物品种，繁殖能力快。地衣芽孢杆菌有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，在食品加工、废弃物降解等方面有巨大潜能。地衣芽孢杆菌在发酵过程中产生的角蛋白酶，对角蛋白的降解与利用有着重要影响。
例如：中国专利201410841868.4中公开了一株产耐高温角蛋白酶的地衣芽孢杆菌UTM107及其应用，该菌生物保藏编号为CGMCC No.9678，可在下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体及畜禽粪便等废弃物中进行好氧堆肥发酵。中国专利201010574642.4公开了一种地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis F4，保藏编号为：CGMCC NO.4229，其脱毛及降解羽毛角蛋白效果明显，但其发酵24小时才有完整羽枝脱落，60小时才能达到较好的降解效果，耗时较长。
目前已公开的获得纯培养保藏的具备实际应用价值的地衣芽孢杆菌种类并不多，对于本领域而言，充足的微生物资源储备毫无疑问对其产业化应用有重要的实际意义。开发一种用途更广泛，制备方法更适于工业化的产角蛋白酶菌种，有利于为角蛋白的高值化利用等提供良好的技术支持。
发明内容
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，及其发酵培养方法，其作为食品或食品添加剂的用途、其作为饲料或饲料添加剂的用途、其作为肥料或肥料添加剂的用途、其作为洗涤剂或洗涤剂添加剂的用途。
一方面，本发明提供的一种地衣芽孢杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为：CGMCC No.18082的地衣芽孢杆菌FK002(Bacilluslicheniformis FK002)。
本发明的地衣芽孢杆菌FK002(Bacillus licheniformis FK002)于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18082。
另一方面，本发明提供了地衣芽孢杆菌FK002的发酵工艺，包括以下步骤：
(1)菌种活化；
(2)一级种子液制备；
(3)发酵液制备。
具体地，所述步骤(1)的菌种活化使用的培养基包括细菌培养基中的一种或多种。
具体地，所述的步骤(2)一级种子液制备使用的培养基包括：葡萄糖、蛋白胨、黄豆粉、硫酸铵、硫酸镁、小球藻中的一种或多种。
具体地，所述步骤(3)发酵液制备采用分段控风控温的发酵工艺。
具体地，所述的分段控温发酵工艺发酵前期(0h-8h)温度为38-40℃，在发酵中后期(8h-发酵结束)逐渐降低温度至34-36℃。所述的分段控风工艺，发酵前期(0h-8h)控制通风量在1-2vvm/min，中期(8h-20h)通风量提高至2-3vvm/min，后期(20h-发酵结束)通风量降低至0.5-1vvm/min。
所得发酵液有效活菌数量为280-350×108/mL，蛋白酶活性最高为10000U/mL。
具体地，发酵培养基的碳氮源包括但不限于：糖蜜、黄豆粉、硫酸铵、玉米浆、玉米淀粉、葡萄糖、小球藻中的一种或多种。与现有技术相比，本发明的优点在于添加小球藻。小球藻含有丰富的氨基酸、核苷酸以及CGF生长因子，可以促进菌体生长，提供代谢途径所需的营养物质。
再一方面，本发明还提供了地衣芽孢杆菌FK002在制备食品或食品添加剂方面的应用。
具体地，所述应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002的发酵液作为必要原料制备食品或其添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002的发酵液生产的角蛋白酶制剂作为必要原料制备食品或其添加剂。
再一方面，本发明还提供了地衣芽孢杆菌FK002在制备饲料或其添加剂方面的应用。
具体地，所述应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002的发酵液作为必要原料制备饲料或其饲料添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002的发酵液制备成地衣芽孢杆菌FK002菌粉，用于制备饲料或饲料添加剂。
更具体地，所述的饲料或其添加剂包括但不限于富含角蛋白酶的饲料或饲料添加剂。
再一个方面，本发明还提供了地衣芽孢杆菌FK002在制备肥料方面的应用。
具体地，所述应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002的发酵液作为必要原料制备肥料或其添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002的发酵液制备成地衣芽孢杆菌FK002菌粉，用于制备肥料或肥料添加剂。
更具体地，所述的应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002生产的角蛋白酶制剂制备肥料或肥料添加剂。
再一个方面，本发明还提供了地衣芽孢杆菌FK002在洗涤、制革、纺织领域上的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于纺织品去污，皮革去毛等。
具体地，所述的应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002的发酵液制备成菌粉应用于洗涤剂或洗涤剂添加剂。
具体地，所述的应用包括但不限于将地衣芽孢杆菌FK002生产的角蛋白酶制剂制备洗涤剂或洗涤剂添加剂。
保藏说明
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2019年07月08日
菌种名称：地衣芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus licheniformis
菌株编号：FK002
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18082
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌FK002发酵液酶解羽毛0h的羽毛状态；
图2为地衣芽孢杆菌FK002发酵液酶解羽毛6h后的效果；
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1地衣芽孢杆菌FK002的保藏与培养
地衣芽孢杆菌FK002的保藏信息为：
地衣芽孢杆菌FK002(Bacillus licheniformis FK002)于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.18082。
地衣芽孢杆菌FK002的发酵培养：
方法1、对于甘油管或冻干管地衣芽孢杆菌FK002
(1)菌种活化
把甘油管或冻干管纳豆芽孢杆菌FK001接种到配置好的营养琼脂平板，于36℃-40℃恒温培养箱，培养12-16小时；
营养琼脂平板培养基组成：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15-20g、蒸馏水补足至1000mL；
挑取一环菌落形态完整的较大菌落划线于斜面培养基，于36℃-40℃恒温培养箱，培养12-16小时；
斜面培养基组成：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15-20g、蒸馏水补足至1000mL；
(2)摇瓶菌种制备
在斜面菌种或平板菌种挑取1-2环接种于摇瓶培养基，于37℃-40℃恒温震荡摇床，培养12-16小时，即得摇瓶种子液；
液体摇瓶培养基组成：葡萄糖10-50g/L、酵母提取物5-20g/L、氯化钙1-10g/L、蛋白胨10-50g/L、维生素B12 0.001-0.005g/L、生物素0.01-0.05g/L蒸馏水补足至1000mL；
(3)一级种子制备
以接种量1％-10％将摇瓶种子液接种到一级种子培养基，温度37℃-40℃，转速80-200rpm，培养6-12小时，即得一级种子液；
一级种子培养基组成：葡萄糖10-80g/L、蛋白胨5-20g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵0.5-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、玉米浆1-5g/L、小球藻0.5-2g/L，pH7.2；
(4)发酵液制备
以10％-20％接种量将一级种子液接种到发酵培养基，调节转速150-250rpm，发酵前期(0h-8h)控制通风量在1-2vvm/min，温度为38-40℃；发酵中后期温度逐渐降低至34-36℃，中期(8h-20h)通风量提高至2-3vvm/min，发酵后期(20h-发酵结束)通风量降低至0.5-1vvm/min。
发酵培养基组成：糖蜜40-150g/L、黄豆粉40-150g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵10-15g/L、硫酸镁0.1-5g/L、硫酸锰0.1-2g/L、玉米浆1-5g/L、磷酸二氢钾0.5-3g/L、小球藻5-20g/L、pH6.5-7.5；
采用国标有效活菌数的测定方法测得，地衣芽孢杆菌FK002发酵液中有效活菌数在280-350×108/mL。
方法2、对于斜面或者平板地衣芽孢杆菌FK002
(1)摇瓶菌种制备
在斜面菌种或平板菌种挑取1-2环接种于摇瓶培养基，于37℃-40℃恒温震荡摇床，培养12-16小时，即得摇瓶种子液；
液体摇瓶培养基组成：葡萄糖10-50g/L、酵母提取物5-20g/L、氯化钙1-10g/L、蛋白胨10-50g/L、维生素B12 0.001-0.005g/L、生物素0.01-0.05g/L蒸馏水补足至1000mL；
(2)一级种子制备
以接种量1％-10％将摇瓶种子液接种到一级种子培养基，温度37℃-40℃，转速80-200rpm，培养6-12小时，即得一级种子液；
一级种子培养基组成：葡萄糖10-80g/L、蛋白胨5-20g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵0.5-5g/L、硫酸镁0.1-5g/L、玉米浆1-5g/L、小球藻0.5-2g/L，pH7.2；
(3)发酵液制备
以10％-20％接种量将一级种子液接种到发酵培养基，调节转速150-250rpm，发酵前期(0h-8h)控制通风量在1-2vvm/min，温度为38-40℃；发酵中后期温度逐渐降低至34-36℃，中期(8h-20h)通风量提高至2-3vvm/min，发酵后期(20h-发酵结束)通风量降低至0.5-1vvm/min。
发酵培养基组成：糖蜜40-150g/L、黄豆粉40-150g/L、氯化钙0.1-1g/L、硫酸铵10-15g/L、硫酸镁0.1-5g/L、硫酸锰0.1-2g/L、玉米浆1-5g/L、磷酸二氢钾0.5-3g/L、小球藻5-20g/L，pH6.5-7.5；
采用国标有效活菌数的测定方法测得，地衣芽孢杆菌FK002发酵液中有效活菌数在280-350×108/mL。
实施例2地衣芽孢杆菌FK002角蛋白酶粉剂和菌粉的制备
将实施例1得到的地衣芽孢杆菌FK002发酵液采用高速离心或自然沉降或加入沉降剂的方法，分离获取清液(上清部分)和重液(下沉部分)，清液即为高含量角蛋白酶菌液，重液即为地衣芽孢杆菌菌体；清液经过浓缩，添加本领域常规使用的蛋白保护剂后，喷雾干燥获得高含量角蛋白酶粉剂产品；重液添加本领域常规使用的蛋白保护剂和/或菌体保护剂后，喷雾干燥获得高含量地衣芽孢杆菌粉剂产品。
将得到的地衣芽孢杆菌FK002发酵液，添加本领域常规使用的蛋白保护剂和/或菌体保护剂后，喷雾干燥获得含有地衣芽孢杆菌和角蛋白酶的混合产品。
实施例3一种饲料或饲料添加剂
根据实施例1制备得到的地衣芽孢杆菌FK002发酵液，加入到冷水暂存罐，加入与发酵液的质量比为1:0.01-0.5的辅料，辅料为二氧化硅、沸石粉、硅藻土、麦芽糊精中的一种或几种，并搅拌均匀；使用高速离心喷雾干燥机，控制进口温度120-160℃，出口温度70-90℃，把上述混合液体喷雾干燥至水分含量≤10％；取喷干后菌粉适量与大米蛋白粉混合制成有效活菌数在200-2000×108CFU/g、角蛋白酶活＞50000U/g的饲料添加剂。
实施例4一种肥料或肥料添加剂
根据实施例1制备得到的地衣芽孢杆菌FK002发酵液，加入至腐殖酸溶液，搅拌均匀后，即得肥料产品，所得新型肥料有效活菌数可根据需要进行调配，使用此方式制备的新型肥料具有状态稳定、不分层，不胀气的特点；所述的腐殖酸溶液的制备方法为：制备浓度为10-40％的腐殖酸或腐殖酸钾或腐殖酸钠水溶液于搅拌罐，并调节pH至4.0-8.0；添加1-10％的分散剂NF，0.5-10％的甘油，并搅拌均匀。
根据实施例2制备得到的地衣芽孢杆菌FK002粉剂，按照10-30％的比例均匀包覆于颗粒有机肥或大量元素颗粒肥的表面，制得含有地衣芽孢杆菌的肥料产品。使用的包覆剂有大豆油、菜籽油、花生油、海藻酸钠等及具有粘性的胶类或聚丙烯酰胺类物质。
实施例5一种角蛋白酶制剂及其应用
根据实施例1制备得到的地衣芽孢杆菌FK002发酵液，向其中加入辅料，辅料为按照占发酵液质量分数为0.5％碳酸钙、1％硅藻土、0.5％沙石粉、0.5％聚谷氨酸中的一种或几种；静置，待出现明显分层现象后；使用高速离心机离心，收集离心清液，弃去下沉淀(去除菌体及残留培养基)；把离心清液经过板框压滤机再次过滤除渣，制备得到高纯度角蛋白酶发酵液，经过低温浓缩设备，浓缩至固形物为10％-30％；浓缩液中加入与浓缩液质量比为1:0.01-0.5的辅料，辅料为西瓜汁粉和麦芽糊精中的一种或几种，并搅拌均匀；使用高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，控制进口温度90-140℃，出口温度60-80℃，喷雾干燥至水分含量5％以下，即得角蛋白酶产品。
所得角蛋白酶产品可用作饲料添加剂或食品加工使用。角蛋白酶具有溶解羽毛等角质蛋白的独特效果，可以用于羽毛蛋白肽、水解毛发、食品用鱼肉蛋白肽、鱼粉加工等行业，减少设备、人员、能源及环保的投入。
角蛋白酶产品的酶活性实验：
(1)采集动物新鲜羽毛，洗净晾干后，备用；
(2)每支试管放置一只处理好的羽毛，高温90-130℃处理；
(3)依次加入0g、0.2g、0.4g、0.8g角蛋白酶后，分别加入无菌水30mL；
(4)于50℃水浴锅保温6h后，结果见图1、图2。少量的角蛋白酶即可达到较好的酶解效果，说明地衣芽孢杆菌FK002发酵得到的角蛋白酶的活性较高。
实验例现针对多个具有角蛋白酶活性的菌株各项性能进行对比：
