一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
酯酶(esterase)是一类重要的酯键水解及合成酶，能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油，还可以催化其逆反应，在酯化、酯交换、酸解和醇解等过程中都有重要作用。酯酶来源较为广泛，在微生物、动物、植物中均可以分离得到，其中，微生物来源的酯酶分离效果较好，应用更为广泛。与其他催化剂相比，酯酶有较高的催化效率。由于酯酶的底物专一性广，催化效率高，稳定性较好，在食品、医药、化工等领域均有广泛应用。有些酯酶还可以特异性催化合成手性分子，在手性化合物的工业生产方面潜力巨大。
如今，在生物体中不同的对映体要作为不同的化合物来慎重对待已经成为了学界的普遍共识。在天然药物和合成药物中，有很大一部分化合物属于手性化合物。虽然手性化合物具有相同的分子式，但是由于构象不同，在生物体内的活性、毒理性以及代谢途径都可能有很大的差异，甚至完全相反。单一异构体给药具有更加精准的治疗效果，能降低构象不同带来的风险。现阶段，获得单一异构体主要依靠一般的分离分析方法，成本较高，而且效率极低。由于酯酶具有较高的底物选择性、区域选择性以及对映选择性，在药物合成和手性化合物的拆分领域有极强的应用前景。利用酯酶获得手性化合物不会产生其他副反应，无需辅酶，而且反应条件温和，近些年来已经成为了研究的热点。
南极独特的气候特征和环境条件，赋予了南极微生物独特的生理特性。南极微生物进化出了不同于热带和温带微生物的生理结构特征，以及生长代谢途径，可以适应南极严酷的气候条件，成为生物资源宝库。因而，从南极土壤来源微生物中分离出来的酯酶比一般环境条件下的微生物酯酶具有更加独特的特性。通过探究其酶学性质，可以发掘出更广泛的应用领域。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用。本发明通过从南极土壤中筛选克隆获得编码酯酶E19-3664的基因，通过对其表达蛋白研究发现，该蛋白能选择性降解L-乳酸甲酯，而对D-乳酸甲酯无活性；同时对短链的酯类表现出较高的降解活性，同时在60-100℃范围内酶活力仍保持在80％以上，热稳定性良好，对高温的耐受性极强。因此具有良好的实际应用价值。
本发明的第一个方面，提供一种名为E19-3664的蛋白质，经试验验证，其具有选择性降解L-乳酸甲酯以及短链酯类的能力，同时良好的热稳定性。
具体的，所述E19-3664是如下(a1)或(a2)：
(a1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.1由317个氨基酸残基组成。
本发明第第二个方面，提供一种编码所述E19-3664蛋白质的基因。所述名为E19-3664的蛋白质的编码基因从南极土壤中筛选克隆获得。
其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：
(b1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；
(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明的第三个方面，含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组细胞亦在本发明的保护范围之内。
本发明的第四个方面，所述蛋白质E19-3664作为酯酶的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明的第五个方面，提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明的第六个方面，提供上述蛋白质E19-3664、编码基因、重组表达载体、表达盒或重组细胞具有如下(c1)-(c3)中的应用：
(c1)手性酯合成；
(c2)洗涤剂生产；
(c3)短链酯降解。
本发明有益技术效果：
本发明所述的南极土壤来源酯酶在较高温度下仍然保持了较好的酶活性，碱性条件下酶活性也较高，在洗涤剂的生产方面有较强的应用前景。
本发明所述的南极土壤来源酯酶E19-3664能高效选择性地降解手性酯，具有合成重要手性化合物的工业应用潜力，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1、本发明实施例2中经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E19-3664电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；
图2、本发明实施例3中酯酶E19-3664的降解底物活性分析柱状图；
图3、本发明实施例3中南极土壤来源酯酶的酶活温度曲线图；
其中：(A)温度对酶活性的影响；(B)温度对酶稳定性的影响；
图4、本发明实施例3中南极土壤来源酯酶的酶活性pH曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种名为E19-3664的蛋白质，经试验验证，其具有选择性降解L-乳酸甲酯以及短链酯类的能力，同时良好的热稳定性。
具体的，所述E19-3664是如下(a1)或(a2)：
(a1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.1由317个氨基酸残基组成。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种编码所述E19-3664蛋白质的基因。所述名为E19-3664的蛋白质的编码基因从南极土壤中筛选克隆获得。
本发明的又一具体实施方式中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：
(b1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；
(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明的又一具体实施方式中，SEQ ID NO.2由954个核苷酸组成，其中第1-951为编码序列，第952-954位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。
本发明的又一具体实施方式中，含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组细胞亦在本发明的保护范围之内。
本发明的又一具体实施方式中，所述重组表达载体为重组原核表达载体，所述重组原核表达载体包括在表达载体pET22b中插入上述编码基因后所得。
本发明的又一具体实施方式中，所述重组细胞为原核细胞，优选为细菌，进一步选自大肠杆菌、芽孢杆菌等；更进一步的，所述重组细胞为含有上述基因和/或重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的又一具体实施方式中，所述转化体包括原核生物。
本发明的又一具体实施方式中，所述蛋白质E19-3664作为酯酶的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明的又一具体实施方式中，提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述蛋白质E19-3664、编码基因、重组表达载体、表达盒或重组细胞具有如下(c1)-(c3)中的应用：
(c1)手性酯合成；
(c2)洗涤剂生产；
(c3)短链酯降解。
具体的，所述(c1)应用中，蛋白质E19-3664能够选择性降解L-乳酸甲酯，而对D-乳酸甲酯无活性；
所述(c3)应用中，所述短链酯为碳链长度为2～10个碳原子的短链酯类化合物，进一步优选为碳链长度为2～4个碳原子的短链酯类化合物。
上述应用可以在高温环境下进行。所述高温环境为不低于60℃(例如60℃-70℃)；更进一步为不低于70℃(例如70℃-75℃、75-80℃、80℃-85℃、85℃-90℃或更高的温度，或者70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃)。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
培养基：
LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。
LB固体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。
实施例1：南极土壤来源酯酶编码基因序列的获取及其序列分析
菌种来源：本发明南极微生物酯酶的基因E19-3664来自南极长城站附近区域位点E19的土壤。
具体步骤如下：
1.1亚克隆文库的构建
用OMEGA公司的BAC/PAC DNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子E19-3664中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取2,000-5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coli Top10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h，构建成克隆子E19-3664的fosmid DNA的亚克隆文库。
1.2酯类水解酶基因序列的确定
选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并进行测序。用NCBIORFFinder软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBInr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子E19-3664上携带的酯酶基因序列E19-3664，基因E19-3664共954bp，其中含有一个954bp的开放阅读框架，其编码南极土壤来源酯酶E19-3664，起始密码子位于1bp，终止密码子位于952bp，共编码317个氨基酸的蛋白。南极土壤来源酯酶E19-3664前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。获得的南极土壤酯酶E19-3664编码基因E19-3664的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
1.3南极土壤来源酯酶的序列分析
GenBank中，与南极土壤来源E19-3664最相似的序列为来源于Pseudomonassp.IB20的alpha/beta水解酶，序列相似性为99％。同时，BLAST给出的序列与南极土壤来源酯酶E19-3664相似度在81％-99％之间，均为基于基因序列预测的基因，生化性质均尚未被研究。
实施例2：酯酶的克隆、异源表达及分离纯化
2.1利用PCR对基因序列进行扩增
(1)根据基因E19-3664序列设计两条特异性引物：
3664F：AAGAAGGAGA TATACATATG GCGCACACCC CCTGGCCTGCCAG(SEQ ID NO.3)；
3664R：TCGAGTGCGG CCGCAAGCTT CGAAGACTTT CCACCTGTGTAGC(SEQ ID NO.4)；
引物由济南铂尚生物技术有限公司合成。
(2)以3664F和3664R为引物，以基因E19-3664所在的fosmid为模板，用FastPfuDNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；
PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性20sec，50℃退火20sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。
(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,000bp的DNA片段。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。
(4)使用无缝克隆试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司)将回收的E19-3664基因片段连接到pET22b载体上。
(5)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。
(6)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态。
(7)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒。
上述LB固体培养基组分如下：
1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。
上述LB液体培养基组分如下：
1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。
2.2重组表达载体pET22b-E19-3664转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。
(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；
(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将测序正确的重组载体pET22b-E19-3664转至大肠杆菌BL21感受态；
(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。
2.3基因在大肠杆菌中诱导表达与纯化
(1)在平板上刮取菌苔，接于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～3h；
(2)按1％(v/v)接种量转接到50ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm下培养，至600nm下OD值为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.05mM，继续在16℃、180rpm下培养24h；
(3)收集经过IPTG诱导的LB培养液，在11000rpm、5℃下离心5min，收集菌体；
(4)加入含100mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬菌体；
(5)将重悬的菌液超声破碎；
(6)将破碎后的菌液11000rpm、4℃下离心30min，收集上清；再将上清液于11000rpm、4℃下离心20min，收集上清；
(7)将上清用22μm滤膜过滤，并按照说明书要求进行镍柱亲和层析；
(8)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得南极酯酶E19-3664的电泳纯酶(见图1)。通过透析除去残留的咪唑，最后置于-20℃保存备用。
实施例3：南极酯酶E19-3664的性质测定
3.1底物特异性分析
用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物C2、C4、C8、C10、C12、C14(购自Sigma公司)。
标准反应为：
20μl 10mM底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)于40℃下预热3min，加入酶液20μl，并于40℃下反应，5min后加入100μl 20wt％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应，测定405nm下的OD值，以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的pNP(购自Sigma公司)来绘制。
酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM pNP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，酯酶E19-3664能高效降解短链的pNP酯底物(C2、C4)，其中对C2底物的降解能力最强，活力达到641U/mg。
3.2最适温度及温度稳定性分析
最适反应温度的测定：以C2为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测南极酯酶在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下的酶活。最高酶活定义为100％。
结果表明该酶的最适酶活温度为70℃，其在50～100℃保留超过70％的高活力(如图3A)。
温度稳定性分析：酶液在70℃温育，2小时内每隔15min取出相同酶量检测南极酯酶E19-3664在40℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中的残余活力。0℃酶活定义为100％，结果表明，在70℃温育2h后，仍保留80％以上的酶活力(如图3B)。
3.3最适pH
最适反应pH的测定：配制pH值在4.0～11.0范围内、间隔1个或0.5个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定南极酯酶E19-3664在不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。
结果表明酯酶E19-3664是碱性酯酶，其最适pH为8.0(如图4)。
3.4对手性酯底物的活性分析
用乙腈配制多种手性酯底物(购自Sigma公司)。标准反应为：
向200μl含0.455mM Phenol red的5mM EPPS缓冲液(pH 8.0)中加入15μl 143mM手性酯，再加入10μl 0.5mg/ml纯酶，40℃反应3h，检测OD550。以不加酶液的反应作为对照。用对照和反应后OD550的差值来反应酶活力的高低，差值越大，则酶活力越高。
结果表明，酯酶E19-3664能选择性降解L-乳酸甲酯，对D-乳酸甲酯无活性，因此，酯酶E19-3664具有合成重要手性化合物的工业应用潜力。
4.结果
通过构建亚克隆文库和后期测序，确定了大肠杆菌克隆子E19-3664中fosmid上所携带的酯酶基因E19-3664的核酸序列。根据E19-3664基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E19-3664克隆子的fosmid DNA克隆了编码南极土壤来源酯酶E19-3664的基因片段，构建了含南极土壤来源酯酶基因E19-3664的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。基因E19-3664含有一个954bp的开放阅读框架，其编码新型酯酶E19-3664，起始密码子位于1bp，终止密码子位于952bp，共编码317个氨基酸的前体蛋白。将基因E19-3664在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶E19-3664。
对纯化的酯酶E19-3664进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在2～4个碳原子的短链酯类表现出较强的降解活性(图2)。其在50～100℃范围内保持很高的酶活力，且能在高于70℃条件下稳定存在(图3)。最适pH为8.0，且在pH7.0～8.5范围内稳定存在(图4)。对多种手性酯底物的活性分析表明，酯酶E19-3664对工业上的重要手性化合物前体：乳酸甲酯表现出优异的手性选择性，这表明酯酶E19-3664具有合成重要手性化合物的工业应用潜力。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala His Thr Pro Trp Pro Ala Ser Glu Pro Glu Leu Ala Glu Met
1 5 1015
Arg Gly Phe Asn Lys Lys Leu Ala Trp Leu Pro Arg Phe Lys Ile Arg
202530
Asn Arg Ile Thr Pro Arg Val Ile Gln Ala Leu Leu Arg Val Ser Gln
354045
Thr Leu Lys Lys Ala Pro Ala Ala Gln Thr His Leu Val Gly Ser Val
505560
Pro Val Arg Ile Leu Arg Pro Ala Gly Lys Pro Lys Gly Val Val Leu
65707580
Asp Ile His Gly Gly Gly Trp Val Ile Gly Asn Ala Gln Met Asp Asp
859095
Asp Leu Asn Leu Gly Met Val Gln Ala Cys Gly Val Ala Val Val Ser
100 105 110
Val Asp Tyr Arg Leu Ala Val Asp Thr Pro Val Glu Gly Leu Met Glu
115 120 125
Asp Cys Leu Ala Ala Ala Arg Trp Leu Leu Gly Asp Cys Pro Glu Phe
130 135 140
Ala Asp Leu Pro Val Ile Ile Val Gly Glu Ser Ala Gly Gly His Leu
145 150 155 160
Ala Ala Thr Thr Leu Leu Ala Leu Lys Gln Trp Pro Gln Leu Leu Ala
165 170 175
Arg Val Ser Gly Ala Val Leu Tyr Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Thr Gly
180 185 190
Thr Pro Ser Val Arg Ala Ala Gly Pro Asp Thr Leu Leu Leu Asp Gly
195 200 205
Pro Gly Met Val Glu Ala Leu Arg Met Leu Thr Pro Gly Leu Ser Asp
210 215 220
Glu Gln Arg Arg Gln Pro Pro Leu Ser Pro Leu Tyr Gly Asp Phe Thr
225 230 235 240
Gly Leu Pro Pro Ala Leu Met Phe Val Gly Glu Leu Asp Pro Leu Lys
245 250 255
Asp Asp Thr Leu Leu Leu Ala Glu Arg Trp Gly Ala Val Ala Gln Val
260 265 270
Glu Ala His Leu Leu Pro Glu Ala Ala His Gly Phe Ile His Phe Pro
275 280 285
Val Ala Leu Ala Asn Ser Val Leu Val Tyr Ser Arg Ala Trp Ile Thr
290 295 300
Gln Gln Ile Asn Gly Arg Tyr Thr Gly Gly Lys Ser Ser
305 310 315
<210> 2
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggcgcaca ccccctggcc tgccagcgag ccggagctgg ccgagatgcg cggctttaat 60
aaaaagctcg cctggttgcc gcgctttaaa atccgcaacc gcatcacgcc gcgtgtgatc 120
caggcgctgc tgcgcgtcag tcaaacgctc aagaaggccc cggcggcgca aacccatctg 180
gtgggctcgg tacccgtgcg catcctgcgg ccggcgggta aacccaaggg cgtggtgctg 240
gatatccacg gcggtggctg ggtgatcggc aatgcgcaga tggacgatga cctgaacctg 300
ggcatggtgc aggcgtgcgg cgtggcggtg gtgtcggtgg attatcggct ggcggtcgat 360
acgccggtcg aggggttgat ggaagactgc ttggccgccg ctcgctggct gttgggcgac 420
tgtcctgagt ttgccgacct gccggtgatc attgttggtg aatcagcggg cggccatctg 480
gcggcgacga cgttgctggc gctcaagcaa tggccgcagt tgctcgcgcg ggtgagcggg 540
gcggtgttgt attacggggt ttatgatttg accggcacgc cgagcgtacg cgcagccggg 600
ccggacacgt tattactgga tggcccgggg atggtcgagg ccttgcgtat gctcacgccg 660
gggttgagtg atgagcaaag gcggcagccg ccgttgtcac cgttgtatgg cgactttacg 720
gggttgccgc cggcgttgat gtttgtcggc gagctggacc cgctgaagga tgacacgctg 780
ttgctggcag agcggtgggg ggcggtggcg caggttgagg cgcacttgct gccggaagct 840
gcccatgggt ttattcattt tccggtggcg ctggcaaata gtgtgctggt ctacagcagg 900
gcgtggatca ctcaacagat caatggccgc tacacaggtg gaaagtcttc gtag 954
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagaaggaga tatacatatg gcgcacaccc cctggcctgc cag 43
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcgagtgcgg ccgcaagctt cgaagacttt ccacctgtgt agc 43
