角质污垢清洁剂及角质污垢分解能力的评价方法
技术领域
本发明涉及一种角质污垢清洁剂及使用其的清洁方法、以及评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力的方法。
背景技术
在皮肤中，在基底层分裂的细胞随着朝向外层移动而分化，在最外层脱核之后多层化，由此形成角质层。皮肤的角质层发挥作为皮肤的重要功能之一的屏障的功能。该角质层的更新在人体约为28天，完成任务的角质层或其成分成为污垢。
附着于衣物的污垢中，白衬衫等的衣领或袖口等上产生的呈黑色～茶色的着色的污垢称为“衣领袖口污垢”、“发黑污垢”等，是非常难以去除的污垢。这些污垢由于皮肤表层的角质细胞或其成分附着于衣物而产生。报告有衣领袖口污垢的成分中包含源自角质层的蛋白质兜甲蛋白及角蛋白10(非专利文献1、2)。另外，认为衣领袖口污垢中特别不易去除的污垢是源自角质层的角蛋白(非专利文献3)。角蛋白10的两端及兜甲蛋白是具有被称为甘氨酸富集区的甘氨酸比率较高的区域的蛋白质(非专利文献4)。
一直以来，开发出以这样的所谓衣领袖口污垢等由源自角质层细胞的蛋白质所产生的污垢(以下也称为“角质污垢”)为目标的清洁剂或清洁方法。在专利文献1中，公开有一种以特定比率配合有特定的非离子表面活性剂、磺酸化合物、及聚乙二醇的清洁剂组合物。在专利文献2中，公开有一种使被清洁物接触包含螯合剂及水的液体之后，使其与包含表面活性剂、水及酶的液体接触的方法。在专利文献3中，公开有一种含有特定的非离子表面活性剂、金属离子捕捉剂、蛋白酶、烷醇胺、(甲基)丙烯酸/(甲基)丙烯酸酯共聚物、及水溶助长剂的清洁剂组合物。
近年来，提供有包含蛋白酶等蛋白质分解优异的酶的清洁剂(例如专利文献3～5)。认为蛋白酶对衣领袖口污垢的清洁也有用(专利文献3～4)。然而，现有的清洁剂对角质污垢的清洁力还不充分。为了利用现有的清洁剂有效地去除衣领袖口污垢，需要将清洁剂不如通常那样用水稀释而直接涂布于污垢，或进一步进行搓洗。期望开发出对衣领袖口污垢等角质污垢的清洁力更高的清洁剂及蛋白酶。另外，期望不使用源自人体的角质的简易的蛋白酶的角质污垢分解能力的评价方法。
另一方面，蛋白质分解优异的蛋白酶有时由于分解动物性纤维而损伤衣物。报告有一种抑制了对羊毛或蚕丝的损伤性的蛋白酶(专利文献5)。另外，近年来，随着人们卫生意识的提高，对衣物的气味和菌的除去的关心也提高。已知衣物上附着有皮肤常驻菌或环境中存在的各种菌并繁殖，作为皮肤常驻菌，已知有金黄色葡萄球菌或微球菌属菌等革兰氏阳性菌(专利文献6～7)。迄今为止报告有通过使用对金黄色葡萄球菌具有杀菌效果的酶溶葡球菌酶(Lysostaphin)，可以减轻来自洗涤物的恶臭(专利文献6)。
(专利文献1)日本特开平11-279600号公报
(专利文献2)日本特开2003-41479号公报
(专利文献3)日本特开2005-132898号公报
(专利文献4)日本特开2015-120849号公报
(专利文献5)日本特表平10-501577号公报
(专利文献6)日本特表2004-527603号公报
(专利文献7)日本特开2017-095610号公报
(非专利文献1)纤维制品消费科学，19(3)，106-115，1978
(非专利文献2)Nature Reviews Molecular Cell Biology,6,328-340,2005
(非专利文献3)J.Jpn.Oil Chem.Soc.(YUKAGAKU),42(1),p2-9,1993
(非专利文献4)蛋白质核酸酶38(16)p2711-2722，1993
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供一种角质污垢清洁剂，其以M23A亚族蛋白酶作为有效成分。
在另一实施方式中，本发明提供一种角质污垢的清洁方法，其中，使用该角质污垢清洁剂。
在又一实施方式中，本发明提供一种评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力的方法，其包括：
测定受试酶或包含其的组合物对基准肽及一种以上的底物肽的分解活性的步骤；
求出对该一种以上的底物肽的各分解活性相对于对该基准肽的分解活性的相对值的步骤；及
选择该基准肽的分解的比活性为10U/mg以上且针对任意一种以上的该底物肽的该相对值为0.5以上、或者具有相当于其的对该基准肽及底物肽的分解活性的受试酶或包含其的组合物的步骤，
该基准肽为GGGGG或GGGG，该一种以上的底物肽选自GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG，且X为甘氨酸以外的任意的氨基酸残基。
附图说明
图1是酶对金黄色葡萄球菌的杀菌力。误差棒＝标准偏差(n＝3)。
图2是酶对衣领袖口污垢的清洁力。误差棒＝标准偏差(n＝3)。
图3是并用BLP与碱性蛋白酶对衣领袖口污垢的清洁力的增强。误差棒＝标准偏差(n＝4)。
图4是利用各种酶进行过处理的角蛋白溶液的SDS-PAGE图像。
图5是自脚后跟角质提取的角蛋白溶液的SDS-PAGE图像与利用免疫印迹所得到的检测图像。
图6是进行过酶处理的角质不溶性组分的SDS-PAGE图像。
图7是角蛋白10的氨基酸序列。粗体字表示利用实施例6的质谱所鉴定出的肽序列。
图8是包含酶与源自羊毛的天青角蛋白(Keratin azure)的反应液的上清液中的ΔA595的值。
图9是进行过BLP处理的标签序列融合重组兜甲蛋白的SDS-PAGE图像。
图10是兜甲蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
期望开发出对角质污垢的清洁力更高的清洁剂。本发明涉及一种对角质污垢的清洁力较高的清洁剂、及使用其的角质污垢的清洁方法。本发明者发现M23A亚族蛋白酶分解角质污垢的能力较高。由本发明所提供的酶M23A亚族蛋白酶分解角质污垢(例如衣领袖口污垢)的能力优异。通过将该酶配合于清洁剂中，能够获得对角质污垢的清洁力较高的清洁剂。
另外，本发明涉及一种评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力的方法。由于作为角质层的主成分的角蛋白及兜甲蛋白具有甘氨酸富集区(非专利文献4)，因此，推测如果是能够分解Gly-Gly键的蛋白酶，则有可能可以清洁角质污垢。因此，本发明者们确认了作为能够分解Gly-Gly键的蛋白酶的属于M23家族的蛋白酶有角质污垢分解能力(下述实施例2)。其结果，出乎意料地判明：即便是能够分解Gly-Gly键的蛋白酶，也存在不呈现角质污垢分解能力的蛋白酶与显示角质污垢分解能力的蛋白酶。因此，本发明者们对这些酶的底物特异性进行了调查，其结果发现：显示角质污垢分解能力的蛋白酶与不显示角质污垢分解能力的蛋白酶对特定的肽的活性不同。根据这些结果，本发明者们发现：能够以酶对于该特定的肽的分解活性为基准来评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力。根据本发明，能够利用简便的方法来评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力。因此，本发明对开发角质污垢分解能力较高的酶及酶组合物、或角质污垢清洁力较高的清洁剂是有用的。
在本说明书中，氨基酸残基也以下述缩写来记载：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异白氨酸(Ile或I)、白氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、缬氨酸(Val或V)；及任意的氨基酸残基(Xaa或X)。另外，在本说明书中，肽的氨基酸序列按照通常的方法，以氨基末端(以下称为N末端)位于左侧、羧基末端(以下称为C末端)位于右侧的方式进行记载。
在本说明书中，关于核苷酸序列或氨基酸序列的“至少80％的同一性”是指80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、进一步更优选为97％以上、尤其优选为98％以上、尤其更优选为99％以上的同一性。
在本说明书中，核苷酸序列或氨基酸序列间的同一性可以通过李普曼-皮尔森法(Lipman-Pearson法；Science,1985,227:1435-41)进行计算。具体而言，可以通过使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Ver.5.1.1；软件开发)的同源性分析(Search homology)程序，将待比较的单位大小(Unit size to compare)(ktup)设为2进行分析而算出。
在本说明书中，氨基酸序列及核苷酸序列上的“对应的位置”可以通过将目标序列与参照序列(例如序列编号2所示的氨基酸序列)以对各氨基酸序列或核苷酸序列中所存在的保守氨基酸残基或核苷酸赋予最大同源性的方式进行排列(比对)而确定。比对可以使用公知的算法执行，其程序为本领域技术人员所公知。例如，比对可以通过在默认设定中使用Clustal W多序列比对程序(Thompson,J.D.et al,1994,Nucleic Acids Res.,22:4673-4680)进行。或者，也可以使用Clustal W的修订版Clustal W2或Clustal omega。ClustalW、Clustal W2及Clustal omega例如可以在欧州生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute:EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、或国立遗传学研究所运营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上使用。
通过上述的比对而对准与参照序列的任意位置相对应的位置的目标序列的氨基酸残基或核苷酸的位置视为与该任意的位置“对应的位置”。在目标序列上的该“对应的位置”的氨基酸残基与参照序列相同时，将其视为与参照序列的氨基酸残基“对应的氨基酸残基”。例如，在目标序列上，如果与序列编号2的氨基酸序列的H22对应的位置的氨基酸残基为H，则其是与序列编号2的氨基酸序列的H22对应的氨基酸残基。
在本说明书中，将目标基因与控制区“可工作地连结”是指以通过控制区控制基因表达的功能作用于目标基因的方式，在DNA上配置控制区与目标基因。作为将目标基因与控制区可工作地连结的方法，可以列举将该目标基因连结于该控制区的下游的方法。
在本说明书中，“角质污垢”是指因皮肤表层的角质细胞或其成分附着于衣物或布制品而产生的该衣物或布制品的污垢。另外，在本说明书中，“衣领袖口污垢”是“角质污垢”的一种，是由于衣物的衣领或袖口与皮肤的接触及摩擦而在该衣领或袖口产生的呈现黑色～茶色的着色的污垢，也称为“发黑污垢”或“衣领袖口污垢”。本说明书中的“角质污垢”常见于衣物的衣领或袖口，因此，多数情况下是“衣领袖口污垢”。但是，本说明书中的“角质污垢”不应限定于衣物的衣领或袖口的污垢地解释。
角质污垢的主要的原因物质是皮肤的角质(即蛋白质)，因此，一直以来，将包含蛋白酶的清洁剂用于角质污垢的清洁。已知角质层的主成分是角蛋白及兜甲蛋白。进一步，启示了在衣领袖口污垢的成分中包含蛋白质兜甲蛋白及角蛋白10(非专利文献1、2)。因此，本说明书中的“角质污垢”可以换称为“包含源自皮肤或角质层的兜甲蛋白及角蛋白10的污垢”。另外，本说明书中的“衣领袖口污垢”可以换称为“衣物的衣领或袖口上的包含源自皮肤或角质层的兜甲蛋白及角蛋白10的污垢”。
在本说明书中，甘氨酸富集区是指在分子量25,000以上的蛋白质中的由任意连续的20个氨基酸构成的区域中，甘氨酸具有连续至少2个以上的序列(-Gly-Gly-)，且具有10个以上的甘氨酸的区域。
在本说明书中，“动物性纤维”是指由动物获得的纤维、线、布、布料、衣物等。作为动物性纤维的例子，可以列举羊毛、蚕丝、羊绒、羽毛等，优选为羊毛。
M23A亚族蛋白酶及M23B亚族蛋白酶分别是指在MEROPS数据库[http://merops.sanger.ac.uk]所记载的蛋白水解酶家族中，属于M23家族蛋白酶的M23A亚族及M23B亚族的蛋白酶。在MEROPS数据库中，将酶基于以下的论文所记载的方法分类至家族或亚族(Nucleic Acids Res,1999,27:325-331、J Struct Biol,2001,134:95-102、NucleicAcids Res,2016,44:D343-D350)。M23家族蛋白酶包含分解细菌的细胞壁肽聚糖，并且显示溶菌活性的金属内肽酶。另外，M23家族蛋白酶包含能够分解Gly-Gly键的蛋白酶(TheJournal of Biochemistry,124(2),332-339,1998、日本细菌学杂志，52(2),461-473,1997、The Journal of Biological Chemistry,268(10),7503-7508,1993、The Journalof Biological Chemistry,268(12),9071-9078,1993、The Journal of BiologicalChemistry,281(1),549-558,2006)。
在MEROPS数据库的发布版11.0中，M23A亚族中，以正模标本(Holotype)的形式存在β-裂解金属蛋白酶(beta-lytic metallopeptidase；BLP)(MEROPS ID：M23.001)、也被称为葡萄球菌溶血素(Staphylolysin)的LasA蛋白(Las A protein；LasA或LAS)(MEROPS ID：M23.002)、及也被称为Mername-AA291肽酶的嗜水气单胞菌蛋白酶(Aeromonas hydrophilaproteinase；AhP)(MEROPS ID：M23.003)3种蛋白酶。BLP、LasA及AhP是分别由序列编号2、序列编号4及序列编号6所示的氨基酸序列构成的多肽。另一方面，M23B亚族中存在ALE-1甘氨酰甘氨酸肽链内切酶(ALE-1glycylglycine endopeptidase)(ALE-1)(MEROPS ID：M23.012)及溶葡球菌酶(Lysostaphin)(MEROPS ID：M23.004)等多种蛋白酶。ALE-1是由序列编号8所表示的氨基酸序列构成的多肽。
优选本说明书中的M23A亚族蛋白酶是指选自β-裂解金属蛋白酶(BLP)、LasA蛋白(LasA或LAS)、及嗜水气单胞菌蛋白酶(AhP)中的至少一种。在本发明中，可以使用BLP、LasA及AhP的任意一种，也可以以任意的两种或三种的组合使用。优选本发明中使用的M23A亚族蛋白酶包含BLP，更优选为BLP。
β-裂解金属蛋白酶(BLP)、LasA蛋白(LasA或LAS)、嗜水气单胞菌蛋白酶(AhP)是具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键的分解活性的酶。作为BLP的优选例子，可以列举由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的多肽。作为BLP的另一例，可以列举：由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列、优选为具有与序列编号2所表示的氨基酸序列的H22、D36、H121及H123对应的氨基酸残基的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽。作为LasA的优选例子，可以列举由序列编号4所表示的氨基酸序列构成的多肽。作为LasA的另一例，可以列举：由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列、优选为具有与序列编号4所表示的氨基酸序列的H23、D36、H120及H122对应的氨基酸残基的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽。作为AhP的优选例子，可以列举由序列编号6所表示的氨基酸序列构成的多肽。作为AhP的另一例，可以列举：由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列、优选为具有与序列编号6所表示的氨基酸序列的H21、D34、H118及H120对应的氨基酸残基的氨基酸序列构成，且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽。
上述中列举的M23A亚族蛋白酶可以自生产其的微生物或其培养物提取或制备。例如，BLP可以自溶杆菌属(Lysobacter sp.)(NBRC 12725或NBRC 12726)、水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)M497-1、溶杆菌属IB-9374、胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)DSMZ 6980等或其培养物提取或制备，LasA可以自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01、铜绿假单胞菌ATCC 10145、铜绿假单胞菌FRD1等或其培养物提取或制备，AhP可以自嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonas hydrophila subsp.hydrophila)ATCC7966、嗜水气单胞菌(Chester)Stanier(ATCC 51307)等或其培养物提取或制备。上述微生物可以自公共微生物保藏机构购买。生产该M23A亚族蛋白酶的微生物只要使用包含能够同化的碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基在适当的条件下进行培养即可。可以从如此获得的微生物或培养液中通过通常的方法进行酶的采集、制备，进一步通过冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等而获得所需的酶形态。例如，可以使用通过离心分离或过滤的微生物的分离、将上清液或滤液中的酶通过添加硫酸铵等盐而进行的沉淀或通过添加乙醇等有机溶剂而进行的沉淀、使用超滤膜等的浓缩或脱盐、使用离子交换或凝胶过滤等各种色谱法的精制等通常的方法自培养物回收及制备酶。
或者，该M23A亚族蛋白酶可以利用上述氨基酸序列，通过化学合成或生物学方法进行制造。例如，通过培养基于氨基酸序列而化学合成的以表达M23A亚族蛋白酶基因的方式转化的微生物，并自微生物或培养物制备目标酶，由此可以获得M23A亚族蛋白酶。作为这样的转化微生物，例如可以列举将可工作地连结于控制区的M23A亚族蛋白酶基因导入至宿主细胞的基因组中或质粒中而获得的微生物、在合适的位置导入了接入有目标基因的表达载体的微生物等。作为M23A亚族蛋白酶基因的例子，可以列举由序列编号1的序列或与其具有至少80％的同一性的序列构成且编码上述BLP的基因、由序列编号3的序列或与其具有至少80％的同一性的序列构成且编码上述LasA的基因、由序列编号5的序列或与其具有至少80％的同一性的序列构成且编码上述AhP的基因等。
在本说明书中，基因的“控制区”是具有控制该区域的下游的基因在细胞内的表达的功能，优选具有使下游基因组成性表达或高表达的功能的区域。具体而言，可以定义为存在于该基因中的编码区的上游，且具有RNA聚合酶相互作用而控制该基因的转录的功能的区域。优选本说明书中的基因的控制区是指该基因中的编码区的上游200～600个核苷酸左右的区域。控制区包含基因的转录起始控制区及/或翻译起始控制区、或者自转录起始控制区至翻译起始控制区的区域。转录起始控制区是包含启动子及转录起始点的区域，翻译起始控制区是与起始密码子一起形成核糖体结合位点的相当于夏因-达尔加诺(SD，Shine-Dalgarno)序列的部位(Shine,J.,Dalgarno,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1974,71:1342-1346)。
包含M23A亚族蛋白酶基因的表达载体可以通过在可以稳定地保持该基因，能够在宿主微生物内复制维持，且可以使该M23A亚族蛋白酶稳定地表达的载体中接入M23A亚族蛋白酶基因而制作。作为该载体，在将大肠杆菌作为宿主的情况下，可以列举pUC18、pBR322、pHY300PLK等，在将枯草杆菌作为宿主的情况下，可以列举pUB110、pHSP64(Sumitomo等人，Biosci.Biotechnol.Biocem.,1995,59:2172-2175)或者pHY300PLK(TAKARA BIO)等。
宿主微生物的转化可以使用原生质体法、感受态细胞法、电穿孔法等进行。作为宿主微生物，并无特别限制，可以列举芽孢杆菌(Bacillus)属(例如枯草杆菌)等革兰氏阳性菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌、链霉菌(Streptomyces)属、酵母菌(Saccharomyces)属(酵母)、曲菌(Aspergillus)属(霉)等真菌等。优选的宿主是与供导入至该宿主的M23A亚族蛋白酶基因的来源菌同种或同属的微生物、大肠杆菌、或者芽孢杆菌属细菌，更优选为芽孢杆菌属细菌。
所获得的转化体只要使用包含能够同化的碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基在适当的条件下进行培养即可。可以从如此获得的微生物或培养物中通过通常的方法进行酶的采集、制备，进一步通过冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等而获得所需的酶形态。例如，可以使用通过离心分离或过滤而进行的重组微生物的分离、上清液或滤液中的酶通过添加硫酸铵等盐而进行的沉淀或通过添加乙醇等有机溶剂而进行的沉淀、使用了超滤膜等的浓缩或脱盐、使用了离子交换或凝胶过滤等各种色谱法的精制等通常的方法自培养物回收及制备酶。
或者，该M23A亚族蛋白酶可以由包含其的酶组合物等制备。例如，BLP可以自无色肽酶制备。无色肽酶是源自产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)的溶菌酶，并且含有BLP。无色肽酶由和光纯药工业(株)等市售。
以下，一边示出具体的实施方式，一边更详细地说明本发明。
(A.评价角质污垢分解能力的方法)
作为角质层的主成分的角蛋白及兜甲蛋白具有甘氨酸富集区(非专利文献4、以及图7和图10)。本发明者们推测，如果是能够分解该甘氨酸富集区的Gly-Gly键的蛋白酶，则有可能可以清洁角质污垢。于是，本发明者们调查了作为能够分解Gly-Gly键的蛋白酶而为人所知的M23家族蛋白酶BLP、LasA、AhP、ALE-1及溶葡球菌酶的角质污垢清洁力(实施例2)。其结果，出乎预料地，即便是能够分解Gly-Gly键的M23家族蛋白酶，属于M23B亚族蛋白酶的ALE-1及溶葡球菌酶也未确认有角质污垢清洁力，另一方面，属于M23A亚族蛋白酶的BLP、LasA及AhP确认有角质污垢清洁力。进一步，本发明者们确认了BLP、LasA及AhP的角蛋白分解活性(实施例4、5)、以及BLP的兜甲蛋白分解活性(实施例8)。根据这些结果推测出，BLP、LasA及AhP通过分解角质的蛋白质而发挥角质污垢清洁力。
接着，本发明者们为了弄清造成M23A亚族蛋白酶与M23B亚族蛋白酶的角质污垢分解能力(清洁力)的差异的机制，调查了这些蛋白酶对具有甘氨酸-甘氨酸键的各种肽的分解活性。其结果发现，角质污垢分解能力较高的M23A亚族蛋白酶对于所调查的所有具有甘氨酸-甘氨酸键的肽有分解活性(实施例9)。另一方面，未发现角质污垢分解能力的属于M23B亚族的蛋白酶虽然对具有五甘氨酸(GGGGG)序列的肽显示较弱的活性，但是对具有甘氨酸-甘氨酸键但也具有甘氨酸以外的氨基酸的肽未显示显著的活性。根据这些结果，推测出酶为了分解角质污垢，除了分解Gly-Gly键的能力以外，也需要能够分解甘氨酸的比率高但也包含甘氨酸以外的氨基酸的肽的能力。因此，对具有甘氨酸-甘氨酸键的各种肽的分解活性的水平判断成为酶的角质污垢分解能力(清洁力)的指标。
因此，在一个实施方式中，本发明提供一种评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力的方法。本发明的方法包括：测定受试酶或包含其的组合物对具有GGGGG或GGGG的肽(以下，在本说明书中也简称为“基准肽”)、及具有甘氨酸-甘氨酸键且在甘氨酸间具有甘氨酸以外的氨基酸的肽(以下，在本说明书中也简称为“底物肽”)的分解活性的步骤。
本发明的方法中使用的基准肽优选为选自GGGGG(序列编号30)及GGGG(序列编号31)中的一种以上，更优选为GGGGG或GGGG，进一步优选为GGGGG。本发明的方法中使用的底物肽优选为选自GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG中的一种以上，更优选为GGGXG(X表示甘氨酸以外的任意的氨基酸残基)。优选该底物肽中的X选自S、Y、L及F。进一步优选该底物肽为选自GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG(序列编号32～35)中的一种以上。进一步优选该底物肽至少包含GGGSG及GGGYG。在一个实施方式中，该底物肽为GGGSG及GGGYG。在另一实施方式中，该底物肽为GGGSG、GGGYG及GGGFG。进一步优选该底物肽为GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG。在本发明的方法中，测定受试酶或包含其的组合物分别对这些基准肽和底物肽的分解活性。
利用本发明的方法评价的受试酶的种类及来源生物的物种并无特别限定。该受试酶可以为天然存在的酶，也可以为其人工变异体。优选该受试酶为蛋白酶。
另外，作为利用本发明的方法评价的包含受试酶的组合物的例子，可以列举包含受试酶在内的两种以上的酶的组合，或者含有包含受试酶在内的一种或两种以上的酶与该酶以外的其它成分的组合物等。优选该受试酶为蛋白酶。
该组合物也可以含有该受试酶以外的其它酶。作为该其它酶的例子，可以列举选自与受试酶不同的蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶(α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等)、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶(Rhamnogalacturonase)、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、及转谷氨酰胺酶等水解酶中的一种或两种以上。其中，优选为与受试酶不同的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、或这些的一种或两种以上的组合。作为与受试酶不同的蛋白酶的例子，可以列举与受试酶不同的碱性蛋白酶，但不限于此。
作为可以包含于该组合物中的酶以外的其它成分的例子，可以列举通常用于洗涤剂组合物的成分。例如，作为该其它成分，可以包含水、表面活性剂、螯合剂、水溶性聚合物、水混溶性有机溶剂、碱剂、有机酸或其盐、酶稳定剂、荧光剂、再污染防止剂、分散剂、防色移剂、整理剂、过氧化氢等漂白剂、抗氧化剂、增溶剂、pH值调节剂、缓冲剂、防腐剂、香料、盐、醇、糖类等。作为表面活性剂，可以使用阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、及阳离子表面活性剂等的任意的表面活性剂的一种或组合两种以上使用。
因此，作为本发明的方法中使用的包含受试酶的组合物的又一例，可以列举包含受试酶的洗涤剂组合物。该洗涤剂组合物可以为粉末等固体组合物，也可以为液体组合物，优选为液体洗涤剂组合物。该洗涤剂组合物优选为洗涤用洗涤剂组合物，更优选为洗涤用液体洗涤剂组合物。再者，在本说明书中，也有时将本发明的方法中使用的受试酶或包含其的组合物统称为“受试物”。
该受试酶或包含其的组合物对该基准肽或底物肽的分解活性可以通过使该受试酶或包含其的组合物与该基准肽或该底物肽接触，接着测量该基准肽或该底物肽的分解量而测定。作为测量肽的分解量的方法，可以列举FRET(fluorescence energy transfer，荧光能量转移)法、气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法等。其中，优选为FRET法。
在通过FRET法来定量该基准肽或底物肽的分解的情况下，优选准备在荧光基团与淬灭基团之间配置有该基准肽或底物肽的FRET底物。如果FRET底物所含的该基准肽或底物肽通过与酶接触而分解，则荧光基团与淬灭基团的距离变化，自荧光基团发出的荧光的强度变化。通过测定该来自荧光基团的荧光强度的变化，可以定量该基准肽或底物肽的分解。作为FRET底物中的荧光基团与淬灭基团的组合的例子，可以列举[荧光基团]：Nma；2-(N-甲基氨基)苯甲酰基、[淬灭基团]：Lys(Dnp)；侧链具有2,4-二硝基苯基(Dnp)的赖氨酸(Lys)残基。具有这些荧光基及淬灭基团与特定的肽的FRET底物、或用于使用了该底物的FRET反应的试剂及溶剂有市售，例如可以自PH Japan Co.,Ltd.等购入。
在该基准肽或底物肽的分解量的测量所使用的反应溶液中，该受试酶的浓度以蛋白质质量计，优选为0.01～50μg/mL，该基准肽或该底物肽的浓度优选为1～3000μM，但不限定于这些。反应温度及pH值可以是该受试酶的最适条件，或者也可以是设想将该受试酶应用于角质污垢分解的情况下的条件。为了在测量时间中酶反应不结束而能够经时地检测该基准肽或底物肽的由酶分解所引起的荧光强度的变化，优选使该受试酶与基准肽或底物肽接触后迅速地开始测量，及充分提高反应溶液中的该基准肽或底物肽的浓度。反应时间并无特别限制，在FRET法的情况下优选为0.1～10分钟左右，在色谱法的情况下优选为数分钟～数小时左右。
基于FRET法中测得的荧光强度而测定受试物对基准肽或底物肽的分解活性。优选该分解活性基于校准曲线而求出。该校准曲线例如可以通过在与受试物的检测相同的反应条件下测定标准溶液的荧光强度而制作。作为该标准溶液的例子，可以列举与受试物的检测所使用的反应溶液相比，不含该受试酶且包含利用二甲基亚砜溶解的FRETS-25-STD1(PEPTIDE INSTITUTE、3720-v)代替FRET-GGGXG的溶液。该受试物的分解活性也可以表示为比活性(该受试物的蛋白质质量每1mg的活性U；U/mg)。受试物的蛋白质质量可以利用DC蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad)等市售的试剂盒或公知的方法(例如Lowry法、Bradfrod法)求出。
优选该受试物对基准肽及底物肽的分解活性通过以下的方法测定：作为底物，使用Nma与Lys(Dnp)之间为GGGXG(X为G、S、Y、L、F的任一者)的FRET底物[以下称为FRET-GGGXG]。在该FRET底物中，Nma结合于GGGXG的N末端侧，Lys(Dnp)结合于GGGXG的C末端侧。向96孔的分析板添加含有受试酶或包含其的组合物的酶溶液(受试酶、20mM Tris-HCl(pH值7.5))190μL，进一步添加FRET-GGGXG溶液(1mM FRET-GGGXG、100mM Tris-HCl(pH值7.5))10μL而制备反应液。使用荧光分析仪在温度30℃、激发波长340nm、测定波长440nm下经时地测定反应液的荧光强度。另一方面，在与上述相同的反应条件下，使用20mM Tris-HCl pH值7.5液体代替酶溶液、使用利用二甲基亚砜溶解的FRETS-25-STD1(PEPTIDE INSTITUTE、3720-v)代替FRET-GGGXG，测定该反应液的荧光强度，制作校准曲线。1单位(U)的活性设为显示相当于每1分钟由1nmol的FRETS-25-STD1所产生的荧光强度的荧光强度的变化所需的酶量。算出该受试物的基准肽或底物肽的分解的比活性(该受试物的蛋白质质量每1mg的活性；U/mg)。受试物的蛋白质质量可以利用DC蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad)求出。再者，上述步骤为一例，在本发明的受试物的分解活性的测定中，可以根据使用的受试物的种类等适当决定测定条件。
优选在本发明的方法中，基于该受试酶或包含其的组合物分别对该基准肽及底物肽的分解活性的水平来评价该受试酶或包含其的组合物对角质污垢的分解能力。关于对该基准肽的分解活性的水平，优选基于其比活性进行评价。另一方面，关于对各底物肽的分解活性的水平，优选基于对各底物肽的分解活性相对于对该基准肽的分解活性的相对值(即相对分解活性)来进行评价。优选在本发明的方法中，求出该受试酶或包含其的组合物分别对上述的基准肽及底物肽的分解活性的比活性。接着，针对求出的对各底物肽的该比活性的各个，求出相对于对基准肽的该比活性的相对值。对该基准肽及底物肽的该比活性可以通过上述的步骤求出。
因此，优选在本发明的方法中，在受试酶或包含其的组合物的该基准肽的分解的比活性为规定值以上，并且针对任一种底物肽的上述相对分解活性为规定值以上的情况下，将该受试酶或包含其的组合物选作对角质污垢具有分解能力的物质。例如，在本发明的方法中，在受试酶或包含其的组合物的该基准肽的分解的比活性为10(U/mg)以上，且针对任一种以上的底物肽的上述中求出的相对分解活性为0.5以上的情况下(例如，将该受试酶或包含其的组合物对基准肽的比活性设为1时，该受试酶或包含其的组合物对任一种以上的底物肽的比活性为0.5以上的情况下)，选择该受试酶或包含其的组合物。更优选在受试酶或包含其的组合物的该基准肽的分解的比活性为10(U/mg)以上，且针对任意两种以上的底物肽的该相对分解活性为0.5以上的情况下，选择该受试酶或包含其的组合物。进一步优选在受试酶或包含其的组合物的该基准肽的分解的比活性为10(U/mg)以上，且针对使用的所有种类的底物肽的该相对分解活性为0.5以上的情况下，选择该受试酶或包含其的组合物。选择的受试酶或包含其的组合物评价为具有对角质污垢的分解能力。另一方面，受试酶对基准肽的比活性小于10(U/mg)的受试酶或包含其的组合物、或针对任一底物肽的该相对分解活性均小于0.5的受试酶或包含其的组合物不评价为具有对角质污垢的分解能力。
或者，在本发明中，也可以利用上述受试酶蛋白质质量每1mg的比活性以外的基准来评价该受试酶或包含其的组合物对该基准肽及底物肽的分解活性。例如，使用发光、荧光、比色反应、吸亮度、或其它用于定量酶分解物的通常的方法来测定由该受试酶或包含其的组合物所致的该基准肽及底物肽的分解量。可以根据该基准肽及底物肽的分解量的测定值，求出对各底物肽的分解活性相对于基准肽的相对值，进一步基于预先制作的校准曲线或预先设定的基准值，根据获得的测定值是否相当于上述比活性10U/mg以上而进行判断。
利用以上的步骤而选择的评价为具有对角质污垢的分解能力的受试酶或包含其的组合物可以进一步选作角质污垢分解酶或者角质污垢分解用组合物、或这些的候选物质。因此，本发明的方法的一个实施方式是一种角质污垢分解酶或角质污垢分解用组合物、或这些的候选物质的选择方法。
利用上述步骤通过本发明的方法而选择的受试酶或包含其的组合物可以根据需要进一步加以评价，而选作目标角质污垢分解酶或角质污垢分解用组合物。作为该进一步的评价，并无特别限定，例如可以列举实际的衣领袖口污垢的分解能力的评价、或角质样品或由其提取的角蛋白或兜甲蛋白的分解能力的评价等。
通过本发明的方法而评价为具有对角质污垢的分解能力的酶或包含其的组合物由于对包含大量甘氨酸的底物的比活性较高，因此，推测是对甘氨酸富集区的选择性较高的酶。实际上，由具有对上述底物肽的分解活性的M23A亚族蛋白酶所产生的具有甘氨酸富集区的角蛋白的分解反应产物中未鉴定到甘氨酸富集区，而残留甘氨酸富集区以外的区域(实施例6、9)。另一方面，羊毛角蛋白由于不具有甘氨酸富集区，因此，推测不易被通过本发明的方法而选择出的酶或包含其的组合物分解[UniProt Knowledgebase_P02534、UniProtKnowledgebase_P25691]。因此，通过本发明的方法而选择出的酶或包含其的组合物很有可能是具有角质污垢分解能力，另一方面，对羊毛角蛋白等动物性纤维的分解能力较低的酶或其组合物。即，期待通过本发明的方法而评价为具有对角质污垢的分解能力的酶是对羊毛等动物性纤维的分解能力(或对动物性纤维的损伤性)较低的酶。
因此，本发明的方法的另一实施方式可以是除了评价酶或包含其的组合物对角质污垢的分解能力以外，还评价其对动物性纤维的分解能力(或对动物性纤维的损伤性)的方法。在该方法中，受试酶或包含其的组合物可以根据需要进一步进行对动物性纤维的分解能力的评价、或对角质污垢与动物性纤维的分解能力的评价，而选择作为具有角质污垢分解能力且对动物性纤维的分解能力(或对动物性纤维的损伤性)较低的酶或组合物的候选。优选在该方法中，对利用上述步骤而选作具有角质污垢分解能力的酶或组合物的受试酶或包含其的组合物进一步进行对动物性纤维的分解能力的评价、或对角质污垢与动物性纤维的分解能力的评价。
作为受试酶或包含其的组合物对动物性纤维的分解能力的评价方法，例如可以列举测定该受试酶或包含其的组合物对动物性纤维或角蛋白的分解活性、分析由该受试酶或包含其的组合物所产生的动物性纤维或角蛋白的分解产物等。作为该动物性纤维或角蛋白，优选为源自动物性纤维的角蛋白，更优选为羊毛角蛋白，进一步优选为源自羊毛的天青角蛋白。另外，结合有色素、荧光物质等的动物性纤维或角蛋白也可以通过测定反应液的离心上清液的吸光度或荧光强度而容易地评价分解能力，因此，作为用于该分解能力评价的底物而言优选。
作为受试酶或包含其的组合物对角质污垢与动物性纤维的分解能力的评价方法，例如可以列举测定该受试酶或包含其的组合物对角蛋白的分解活性、分析由该受试酶或包含其的组合物所产生的角蛋白的分解产物等。作为该角蛋白，优选为分子量为35,000以上的具有甘氨酸富集区的角蛋白，更优选为角蛋白1或10，进一步优选为角蛋白10。角蛋白10例如可以通过自人的脚后跟削出角质，添加增溶液(100mM Tris-HCl(pH值8.5)、2％SDS、25mM DTT、5mM EDTA)，以100℃加热10分钟后，进行离心分离，将上清液用透析缓冲液(20mMTris-HCl(pH值7.5)、0.1％SDS)透析一晩而获得。
受试酶或包含其的组合物的角蛋白分解活性可以通过如下方式测定：使该受试酶或包含其的组合物与该角蛋白接触，接着测量作为通过酶反应而生成的分解产物的角蛋白片段的分子量。酶与角蛋白接触时，酶的浓度以蛋白质质量计，优选为0.001～100000μg/mL，更优选为0.01～10000μg/mL，进一步优选为0.1～1000μg/mL，另一方面，角蛋白的浓度以蛋白质质量计，优选为0.001～10000g/L，更优选为0.1～100g/L，进一步优选为0.1～10g/L，但不限于这些。反应温度及pH值可以为该受试酶的最适条件，或者也可以为设想将该受试酶应用于角质污垢分解的情况下的条件。反应时间并无特别限制，优选为1～3000分钟，更优选为60～1500分钟，进一步优选为60～600分钟。
作为测量角蛋白片段的分子量的方法，可以列举电泳法(例如SDS-PAGE)、凝胶过滤色谱法、动态光散射法等。其中，优选为SDS-PAGE。因此，本说明书中的角蛋白或其片段的分子量优选为通过SDS-PAGE测得的分子量。将利用SDS-PAGE的分子量测定的步骤的例子记载于以下：将包含角蛋白片段的试样溶液与包含50mM二硫苏糖醇的2×Laemmli样品缓冲液进行等量混合，并以100℃加热5分钟，由此制备电泳样品。将该电泳样品使用Any kDTMMini-PROTEAN(注册商标)TGXTM预制胶及电泳用缓冲液(25mM Trsi、192mM甘氨酸、0.1％(w/v)SDS、pH值8.3)进行电泳。此时，分子量标记使用Precision Plus ProteinTM双色标准品。泳动后的凝胶进行CBB染色或Ruby染色。在可以根据分子量标记的分子量与迁移率而制成的校准曲线的式中代入目标蛋白质或多肽的迁移率，将由此获得的值设为该目标蛋白质或多肽的分子量。此处，样品的迁移率(Rf值)设为使该样品流通的泳道中的自凝胶的上端(或施加样品的位置)至示踪色素(溴酚蓝)的距离设为1时，该凝胶的上端(或施加样品的位置)至该样品的条带的距离的相对值。再者，上述利用SDS-PAGE的分子量测定的步骤是本发明的角蛋白片段分子量的测量步骤的一例，可以根据使用的角蛋白片段或分解物的分子量而适当决定测定条件，并选择标记等。
在本发明的方法中，在上述中求出的角蛋白片段的分子量为与该受试酶或包含其的组合物接触前的角蛋白(例如全长角蛋白)的分子量的50％以上且97％以下的情况下，该受试酶或包含其的组合物被评价为具有对角质污垢的分解能力，进一步对动物性纤维的分解能力较低。这样的受试酶或组合物被选择作为动物性纤维的损伤性较低的角质污垢分解酶或角质污垢分解用组合物。
另一方面，在上述中求出的角蛋白片段的分子量大于全长角蛋白的分子量的97％(未发现有角蛋白的分解)的情况下，该受试酶或包含其的组合物被评价为对角质污垢的分解能力较低。或者，在上述中求出的角蛋白片段的分子量小于全长角蛋白的分子量的50％的情况下，该受试酶或包含其的组合物被评价为对动物性纤维的分解能力较高。这样的受试酶或组合物对动物性纤维的损伤性较高。
(B.角质污垢清洁剂)
在上述本发明的评价角质污垢分解能力的方法中，发现M23家族蛋白酶中，BLP、LasA及AhP等M23A亚族蛋白酶具有角质污垢清洁力。因此，在又一实施方式中，本发明提供一种角质污垢清洁剂。本发明的角质污垢清洁剂含有M23A亚族蛋白酶作为有效成分。在另一实施方式中，本发明提供M23A亚族蛋白酶在用于制造角质污垢清洁剂中的用途。在又一实施方式中，本发明提供M23A亚族蛋白酶的用于清洁角质污垢的用途。在本发明中，该角质污垢优选为衣领袖口污垢。在一个实施方式中，该清洁是浸渍放置清洁，本发明的清洁剂是浸渍放置清洁用的清洁剂。然而，本发明的清洁的种类及本发明的清洁剂的形态不限于这些。
在本发明中，M23A亚族蛋白酶用作用于清洁角质污垢的有效成分。本发明中使用的M23A亚族蛋白酶可以是在上述本发明的评价角质污垢分解能力的方法中被评价为具有对角质污垢的分解能力的酶。更详细而言，本发明中使用的M23A亚族蛋白酶可以具有基准肽的分解的比活性为10(U/mg)以上，且对一种以上的底物肽的分解活性相对于对该基准肽的分解活性的相对值为0.5以上的性质。该基准肽为GGGGG(序列编号30)或GGGG(序列编号31)，优选为GGGGG。该底物肽为选自GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG中的一种以上，优选为GGGXG(X表示甘氨酸以外的任意的氨基酸残基)，更优选为选自GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG(序列编号32～35)中的一种以上。优选该M23A亚族蛋白酶的GGGGG的分解的比活性为10(U/mg)以上，且在将GGGGG的分解的比活性设为1时，GGGSG、GGGYG、GGGLG或GGGFG的分解的相对比活性为0.5以上。该M23A亚族蛋白酶对该基准肽及底物肽的分解的比活性可以根据按照下述参考例2及3所记载的方法测得的酶的活性与蛋白质质量而算出。
在优选的实施方式中，本发明中所使用的M23A亚族蛋白酶可以为选自BLP、LasA及AhP中的至少一种。在更优选的实施方式中，本发明中使用的M23A亚族蛋白酶为BLP。
在本发明中，可以使用含有该M23A亚族蛋白酶的酶组合物作为用于清洁角质污垢的有效成分。优选该酶组合物含有选自BLP、LasA及AhP中的至少一种。更优选该酶组合物含有BLP。作为该酶组合物的优选的例子，可以列举无色肽酶。
在一个实施方式中，该本发明的角质污垢清洁剂本质上可以由上述M23A亚族蛋白酶或含有其的酶组合物构成。在优选的实施方式中，该本发明的角质污垢清洁剂是包含上述M23A亚族蛋白酶或含有其的酶组合物的组合物。换而言之，本发明中用作有效成分的M23A亚族蛋白酶或含有其的酶组合物可以以包含其的组合物的形态使用。
如下述实施例1所示，M23A亚族蛋白酶具有对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等革兰氏阳性菌的杀菌性。因此，在本发明中，M23A亚族蛋白酶或含有其的组合物可以用作不仅用于角质污垢清洁，也用于革兰氏阳性菌的杀菌的成分。因此，在一个实施方式中，本发明的角质污垢清洁剂具有对革兰氏阳性菌的杀菌性。
如上所述，“角质污垢”中包含兜甲蛋白及角蛋白，另一方面，在本发明的评价方法中被评价为具有对角质污垢的分解能力的M23A亚族蛋白酶具有角蛋白分解活性(实施例4、5)及兜甲蛋白分解活性(实施例8)。因此，在一个实施方式中，本发明的角质污垢清洁剂是包含角蛋白或兜甲蛋白的污垢的清洁剂。优选该角蛋白为角蛋白1或角蛋白10，更优选为角蛋白10。
如上所述，在本发明的评价方法中被评价为具有对角质污垢的分解能力的M23A亚族蛋白酶与蛋白酶K相比，对羊毛角蛋白等动物性纤维的分解能力(或对动物性纤维的损伤性)较低(实施例7)。优选该M23A亚族蛋白酶将具有甘氨酸富集区且分子量为35,000以上的角蛋白、优选为角蛋白10以其分子量维持在50％以上且97％以下的方式分解。因此，本发明的角质污垢清洁剂是对动物性纤维的损伤性较低的角质污垢清洁剂。更详细而言，本发明的角质污垢清洁剂与除了代替作为其有效成分的M23A亚族蛋白酶而包含蛋白酶K以外具有相同组成的清洁剂相比，动物性纤维、优选为羊毛角蛋白的分解能力较低。
作为包含该M23A亚族蛋白酶或含有其的酶组合物的组合物的例子，可以列举洗涤剂组合物，优选可以列举洗涤用洗涤剂组合物。该洗涤剂组合物可以为粉末等固体组合物，也可以为液体组合物，优选为液体洗涤剂组合物。更优选该洗涤剂组合物为洗涤用液体洗涤剂组合物。
本发明的洗涤剂组合物中的M23A亚族蛋白酶的含量只要是该蛋白酶显示活性的量，则并无特别限制，每1kg洗涤剂组合物，优选为0.001～80000mg，更优选为0.01～10000mg，进一步优选为0.1～3000mg。
本发明的洗涤剂组合物除了M23A亚族蛋白酶以外，含有表面活性剂及水。作为表面活性剂，可以使用阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、及阳离子表面活性剂等任意的表面活性剂的一种或将两种以上组合使用。本发明的洗涤剂组合物中的该表面活性剂的含量优选为10～80质量％，更优选为30～70质量％。
作为非离子表面活性剂，只要是通常配合于液体洗涤剂的具有C8～C22的烃基且加成有数摩尔以上的C2氧化烯基的非离子表面活性剂即可，例如可以列举以下：
R1O-(AO)m-H(R1＝C8-C22烃、AO＝C2-C5氧化烯基、m＝16～35)[日本特开2010-275468号公报]；
R1O-(EO)l-(AO)m-(EO)n-H(R1＝C8-C18烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、l＝3～30、m＝1～5、l+n＝14～50)[日本特开2010-265445号公报、日本特开2011-63784号公报]；
R1O-(EO)m/(AO)n-H(R1＝C8-C22烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、m＝10～30、n＝0～5、EO及AO为无规或嵌段键合)[日本特开2010-189551号公报]；
R1(CO)lO-(EO)m/(AO)n-R2(R1＝C8-C22烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、l＝0～1、m＝14～50、n＝1～5、R2＝氢(l＝0)或C1-C3烷基、EO及AO为无规或嵌段键合)[日本特开2010-229385号公报]；
R1O-(EO)m-(AO)n-H(R1＝C8-C22烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、m＝15～30、n＝1～5)[日本特开2010-229387号公报]；
R1O-(AO)m/(Gly)n-H及/或R2-COO-(AO)p/(Gly)q-H(R1＝C8-C22烃基、R2＝C7-C21烃基、AO＝C2-C3氧化烯基、Gly＝甘油基、m＝0～5、n＝2～10、p＝0～5、q＝2～10、AO及Gly为无规或嵌段键合)[日本特开2010-254881号公报]；
R1-COO-(PO)m/(EO)n-R2(R1＝C7-C21烃基、COO＝羰氧基、R2＝C1-C3烷基、PO＝氧丙烯基、EO＝氧乙烯基、m＝0.3～5、n＝8～25、PO及EO为无规或嵌段键合)[日本特开2010-265333号公报]；
R1O-(EO)l-(PO)m-(EO)n-H(R1＝C8-C20烃、EO＝C2氧化烯基、PO＝氧丙烯基、l＞＝1、n＞＝1、0＜m＜l+n、EO及PO为嵌段键合)[WO98/24865]；
R1O-(EO)m-(PO)n-H(R1＝C10-C16的烷基或烯基、EO＝环氧乙烷基、PO＝环氧丙烷基、m＝5～15、n＝1～3)[日本特开平8-157867号公报]；
R1(CO)-(EO)m-OR2(R1＝C11-C13直链或支链的烷基或烯基、R2＝C1-C3烷基、EO＝环氧乙烷基、m＝10～20)[日本特开2008-7706号公报、日本特开2009-7451号公报、日本特开2009-155594号公报、日本特开2009-155606号公报]；
R1(CO)-(AO)m-OR2(R1＝C9-C13直链或支链的烷基或烯基、AO＝C2-C4氧化烯基、R2＝C1-C3烷基、m＝5～30)[日本特开2009-144002号公报、日本特开2009-173858号公报、日本特开2010-189612号公报]；
R1c-O-(A'O)m-H(R1c为碳原子数8以上且18以下的脂肪族烃基，A'O为选自碳原子数2的烯化氧基及碳原子数3的烯化氧基中的烯化氧基，m为A'O的平均加成摩尔数，且为3以上且50以下的数)[日本特开2017-071664号公报]；以及
脂肪酸烷醇酰胺、脂肪酸烷醇葡糖酰胺、烷基聚葡萄糖苷等。
作为阴离子表面活性剂，例如可以列举羧酸盐型阴离子表面活性剂、磺酸型或硫酸酯型阴离子表面活性剂、非皂类阴离子表面活性剂、直链烷基苯磺酸、苯磺酸或其盐、聚氧苯磺酸或其盐、聚氧乙烯烷基硫酸酯盐、聚氧化烯烷基醚硫酸酯盐、α-烯烃磺酸盐、内烯烃磺酸盐、烷基苯磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐、脂肪酸皂、磷酸酯盐类表面活性剂、酰基丙氨酸盐、酰基牛磺酸盐、烷基醚羧酸、醇硫酸酯等。
作为阳离子表面活性剂，例如可以列举具有长链烷基的季铵盐、具有1个长链烷基的叔胺、烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、烷基吡啶鎓盐等。优选可以列举具有1个碳原子数8～22的长链烷基的季铵型表面活性剂、具有1个碳原子数8～22的长链烷基的叔胺。
作为两性离子活性剂，例如可以列举烷基乙酸甜菜碱、烷醇酰胺丙基乙酸甜菜碱、烷基咪唑啉、烷基丙氨酸等烷基甜菜碱型、烷基酰胺甜菜碱型、咪唑啉型、烷基氨基砜型、烷基氨基羧酸型、烷基酰胺羧酸型、酰胺氨基酸型或磷酸型的两性表面活性剂等。优选可以列举具有碳原子数10～18的烷基的磺基甜菜碱或羰基甜菜碱。
本发明的洗涤剂组合物可以进一步含有通常用于洗涤剂组合物的成分，例如螯合剂、水溶性聚合物、水混溶性有机溶剂、碱剂、有机酸或其盐、M23A亚族蛋白酶以外的其它酶、酶稳定剂、荧光剂、再污染防止剂、分散剂、防色移剂、整理剂、过氧化氢等漂白剂、抗氧化剂、增溶剂、pH值调节剂、缓冲剂、防腐剂、香料、盐、醇、糖类等。
作为螯合剂，例如可以列举氨三乙酸、亚氨基二乙酸、乙二胺乙酸、二乙三胺五乙酸、乙二醇醚二胺四乙酸、羟乙基亚氨基二乙酸、三乙四胺六乙酸、黎豆氨酸(DjenkolicAcid)等氨基多乙酸或这些的盐；二甘醇酸、羟基二琥珀酸、羧甲基羟基琥珀酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、草酸、苹果酸、羟基二琥珀酸、葡萄糖酸、羧甲基琥珀酸、羧甲基酒石酸等有机酸及这些的盐；以及氨基三(亚甲基膦酸)、1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、二乙三胺五(亚甲基膦酸)、及这些的碱金属或低级胺盐等。作为本发明的洗涤剂组合物中的螯合剂的例子，如上述所列举。本发明的洗涤剂组合物中的该螯合剂的含量优选为0.1～5质量％，更优选为0.1～4质量％。
作为水溶性聚合物，例如可以列举：具有(i)包含源自碳原子数2～5的环氧化物的聚合单元而构成的聚醚链部分与(ii)包含源自选自丙烯酸、甲基丙烯酸及马来酸中的一种以上的不饱和羧酸单体的聚合单元而构成的聚合物链部分，且具有(i)或(ii)的任一者成为主链，另一者成为支链的接枝结构的高分子化合物(日本特开2010-275468号公报、日本特开平10-060496号公报)；具有对苯二甲酸亚烷基酯单元及/或间苯二甲酸亚烷基酯单元与氧化烯烃单元及/或聚氧化烯单元的水溶性聚合物(日本特开2009-155606号公报)等。本发明的洗涤剂组合物中的该水溶性聚合物的含量优选为0.2～10质量％，更优选为0.4～5质量％。
作为水混溶性有机溶剂，例如可以列举烷醇类的亚烷基二醇类或甘油、聚亚烷基二醇类、(聚)亚烷基二醇(单或二)烷基醚类、烷基甘油醚类、(聚)亚烷基二醇的芳香族醚类。优选为乙二醇、丙二醇、丁二醇、或己二醇等碳原子数2～6的亚烷基二醇类或甘油、或者聚乙二醇单苯醚、乙二醇单苄醚、二乙二醇单苄醚等。本发明的洗涤剂组合物中的该水混溶性有机溶剂的含量优选为1～40质量％，更优选为1～35质量％。
关于碱剂，例如作为具有1～3个C2-C4的烷醇的烷醇胺，可以列举单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、聚氧化烯胺、二甲基氨基丙基胺等。优选为单乙醇胺、三乙醇胺。本发明的洗涤剂组合物中的该碱剂的含量优选为0～20质量％，更优选为0～10质量％。
作为有机酸或其盐，例如可以列举：饱和脂肪酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、或这些的盐等多元羧酸类；柠檬酸、苹果、乙醇酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸或这些的盐等羟基羧酸类等，其中，优选为柠檬酸或其盐。本发明的洗涤剂组合物中的该有机酸或其盐的含量优选为0～5质量％，更优选为0～3质量％。
作为再污染防止剂及分散剂，例如可以列举聚丙烯酸、聚马来酸、羧甲基纤维素、重均分子量5000以上的聚乙二醇、马来酸酐-二异丁烯共聚物、马来酸酐-甲基乙烯醚共聚物、马来酸酐-乙酸乙烯酯共聚物、萘磺酸盐甲醛缩合物、及日本特开昭59-62614号公报的权利要求1～21(第1页第3栏第5行～第3页第4栏第14行)记载的聚合物等再污染防止剂及分散剂，但不适于配合的情况下也可以不包含。
作为防色移剂，例如可以列举聚乙烯吡咯烷酮，含量优选为0.01～10质量％。
作为漂白剂，例如优选在该洗涤剂组合物中含有过氧化氢、过碳酸盐、过硼酸盐等漂白剂1～10质量％。在使用漂白剂时，可以在该洗涤剂组合物中含有四乙酰基乙二胺(TAED)或日本特开平6-316700号公报记载等的漂白活化剂(activator)0.01～10质量％。
作为荧光剂，例如可以列举联苯型荧光剂(Tinopal CBS-X等)或二苯乙烯型荧光剂(DM型荧光染料等)。本发明的洗涤剂组合物中的该荧光剂的含量优选为0.001～2质量。
作为M23A亚族蛋白酶以外的其它酶，例如可以列举其它蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、及转谷氨酰胺酶等水解酶、以及这些的两种以上的混合物。其中，优选为其它蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、及脂肪酶、或这些的两种以上的组合。
作为淀粉酶，可以列举α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等。作为其它蛋白酶，可以列举一直以来用作洗涤剂用的蛋白酶(例如日本特开2012-45000号公报所记载的蛋白酶)。作为该其它蛋白酶，优选为在清洁时的pH值附近具有最适pH值的蛋白酶。例如在本发明的组合物为碱性的洗涤剂的情况下，作为该其它蛋白酶，优选为最适pH值存在于较中性靠碱性侧的蛋白酶(即碱性蛋白酶)。作为碱性蛋白酶的例子，优选为源自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin protease)，其中，可以列举源自嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)等的枯草杆菌蛋白酶、市售的碱性蛋白酶等。作为市售的碱性蛋白酶，可以列举可以自Novozymes Japan K.K.获取的Alcalase(注册商标)、Savinase(注册商标)、Everlase(注册商标)、Esperase、Kannase(注册商标)、Ovozyme(注册商标)、及可以自Genencor International Inc.获取的Purafect(注册商标)、Properase等。另外，也可以适当地使用日本特开2013-233141号公报所记载的蛋白酶(KSM-KP43；序列编号26)或日本第4348047号公报所记载的蛋白酶(K-16；序列编号27)。
作为该碱性蛋白酶的优选例子，可以列举KSM-KP43(序列编号26)及K-16(序列编号27)。进一步，作为KSM-KP43的变异体的碱性蛋白酶、由与序列编号26所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶、作为K-16的变异体的碱性蛋白酶、及由与序列编号27所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶也可以列举作为本发明中可以使用的优选的碱性蛋白酶的例子。在本发明的组合物中，可以使用这些碱性蛋白酶的任一种或两种以上的组合。
在本发明的组合物中，M23A亚族蛋白酶相对于该碱性蛋白酶的质量比优选为1/20以上，更优选为1/3～20，进一步优选为1～5，进一步更优选为2～3。
作为酶稳定剂，例如可以列举硼化合物、钙离子源(钙离子供给化合物)、羟基化合物、甲酸等，作为抗氧化剂，可以列举丁基羟基甲苯、二苯乙烯化甲酚、亚硫酸钠及亚硫酸氢钠等，作为增溶剂，可以列举对甲苯磺酸、异丙苯磺酸、间二甲苯磺酸、苯甲酸盐(也有作为防腐剂的效果)等。进一步，本发明的洗涤剂组合物也可以含有辛烷、癸烷、十二烷、十三烷等石蜡类、癸烯、十二碳烯等烯烃类、二氯甲烷、1,1,1-三氯乙烷等卤代烷基类、D-柠檬烯等萜烯类等的水不混溶性有机溶剂、色素、香料、抗菌防腐剂、硅酮等消泡剂等。
或者，可以通过在现有的洗涤剂组合物中配合M23A亚族蛋白酶而制造本发明的洗涤剂组合物。作为可以配合M23A亚族蛋白酶的洗涤剂组合物的优选例子，可以列举日本特开2010-265333号公报、日本特开2014-141662号公报、日本特开2009-191128号公报、日本特开2012-224652号公报、日本特表2013-503950号公报、日本特表平11-512768号公报的实施例中记载的液体洗涤剂组合物。例如，可以通过在日本特开2014-141662号公报的实施例4所记载的液体洗涤剂组合物[配合有表面活性剂30％(阴离子表面活性剂20％、非离子表面活性剂10％)、柠檬酸3％、具有羟基的有机溶剂(二乙二醇单丁醚)18％、使组合物的pH值为8.0所需的碱剂(单乙醇胺)、离子交换水及香料等而成的组合物]中配合M23A亚族蛋白酶，从而制备本发明的洗涤剂组合物。
本发明的洗涤剂组合物优选为衣物、或布制品(床单、毛毯、枕套、沙发套、毛巾等)的清洁用的洗涤剂组合物，但并无特别限定。更优选本发明的洗涤剂组合物是衣料用的洗涤剂组合物。优选本发明的洗涤剂组合物用于清洁具有衣领或袖口、或接触于脖子的衣物(例如衬衣、白衬衫、毛衣、夹克、外套、披肩、围巾等)。优选本发明的洗涤剂组合物是角质污垢清洁用的洗涤剂组合物、优选为衣领袖口污垢清洁用的洗涤剂组合物。
在又一实施方式中，本发明提供一种使用了M23A亚族蛋白酶的角质污垢的清洁方法。在该方法中，作为M23A亚族蛋白酶，也可以使用含有其的酶组合物。在一个实施方式中，该本发明的方法可以为使用上述本发明的角质污垢清洁剂的角质污垢的清洁方法。优选该本发明的角质污垢的清洁方法包括使需要去除角质污垢的被清洁物与M23A亚族蛋白酶(或本发明的角质污垢清洁剂)接触的步骤。优选在该本发明的方法中，该角质污垢为衣领袖口污垢。
在本发明的方法中，在使需要去除角质污垢的被清洁物(例如具有角质污垢的衣物或布制品)与M23A亚族蛋白酶或本发明的角质污垢清洁剂接触时，可以在溶解有该M23A亚族蛋白酶、本发明的角质污垢清洁剂、或含有这些的洗涤剂组合物的水中浸渍放置该被清洁物，另外，也可以将该M23A亚族蛋白酶、本发明的角质污垢清洁剂、或含有这些的洗涤剂组合物直接涂布于该被清洁物的角质污垢的部位。在本发明的方法中，也可以进一步对该浸渍放置或涂布洗涤剂组合物后的被清洁物进行手洗、利用洗衣机等清洗，但不一定需要此。
本发明还包含以下的物质、制造方法、用途、方法等作为例示的实施方式。但本发明并不限定于这些实施方式。
[1]一种角质污垢清洁剂，其中，以M23A亚族蛋白酶作为有效成分。
[2]如[1]所述的清洁剂，其中，优选上述角质污垢为衣领袖口污垢。
[3]如[1]或[2]所述的清洁剂，其中，优选以含有上述M23A亚族蛋白酶的酶组合物作为有效成分。
[4]如[1]至[3]中任一项所述的清洁剂，其中，上述M23A亚族蛋白酶优选基准肽的分解的比活性为10U/mg以上，且对一种以上的底物肽的分解活性相对于对该基准肽的分解活性的相对值为0.5以上(此处，该基准肽为GGGGG或GGGG，该底物肽为选自GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG中的一种以上，X为甘氨酸以外的任意的氨基酸残基)；
更优选GGGGG的分解的比活性为10U/mg以上，且在将GGGGG的分解的比活性设为1时，GGGSG、GGGYG、GGGLG或GGGFG的分解的相对比活性为0.5以上；
进一步优选为选自β-裂解金属蛋白酶、LasA蛋白、及嗜水气单胞菌蛋白酶中的至少一种。
[5]如[4]所述的清洁剂，其中，优选上述β-裂解金属蛋白酶为选自由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的多肽、及由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽中的至少一种。
[6]如[4]或[5]所述的清洁剂，其中，优选上述LasA蛋白为选自由序列编号4所表示的氨基酸序列构成的多肽、及由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽中的至少一种。
[7]如[4]至[6]中任一项所述的清洁剂，其中，优选上述嗜水气单胞菌蛋白酶为选自由序列编号6所表示的氨基酸序列构成的多肽、及由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽中的至少一种。
[8]如[3]所述的清洁剂，其中，优选上述酶组合物为无色肽酶。
[9]如[3]至[8]中任一项所述的清洁剂，其中，优选上述酶组合物进一步含有选自上述M23A亚族蛋白酶以外的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、及脂肪酶中的至少一种。
[10]如[9]所述的清洁剂，其中，优选上述M23A亚族蛋白酶以外的蛋白酶为碱性蛋白酶。
[11]如[10]所述的清洁剂，其中，上述碱性蛋白酶优选为源自芽孢杆菌属细菌的碱性蛋白酶，
更优选为选自由序列编号26所表示的氨基酸序列或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶、及由序列编号27所表示的氨基酸序列或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶中的至少一种。
[12]如[10]或[11]所述的清洁剂，其中，上述M23A亚族蛋白酶相对于上述碱性蛋白酶的质量比优选为1/20以上、更优选为1/3～20、进一步优选为1～5、进一步更优选为2～3。
[13]如[1]至[12]中任一项所述的清洁剂，其中，优选为浸渍放置清洁用的清洁剂。
[14]如[1]至[13]中任一项所述的清洁剂，其中，优选具有对革兰氏阳性菌的杀菌性。
[15]一种角质污垢清洁方法，其中，使用了[1]至[14]中任一项所述的清洁剂。
[16]如[15]所述的清洁方法，其中，优选为衣领袖口污垢清洁方法。
[17]如[15]或[16]所述的清洁方法，其中，优选包括将被清洁物在上述清洁剂中进行浸渍放置的步骤。
[18]如[15]至[17]中任一项所述的方法，其中，优选为用于角质污垢清洁及革兰氏阳性菌杀菌的方法。
[19]一种M23A亚族蛋白酶或含有其的组合物在用于制造角质污垢清洁剂中的用途。
[20]一种M23A亚族蛋白酶或含有其的组合物用于角质污垢清洁的用途。
[21]如[19]或[20]所述的用途，其中，优选上述角质污垢为衣领袖口污垢。
[22]如[19]至[21]中任一项所述的用途，其中，上述M23A亚族蛋白酶优选基准肽的分解的比活性为10U/mg以上，且对一种以上的底物肽的分解活性相对于对该基准肽的分解活性的相对值为0.5以上(此处，该基准肽为GGGGG或GGGG，该底物肽为选自GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG中的一种以上，X为甘氨酸以外的任意的氨基酸残基)；
更优选GGGGG的分解的比活性为10U/mg以上，且在将GGGGG的分解的比活性设为1时，GGGSG、GGGYG、GGGLG或GGGFG的分解的相对比活性为0.5以上；
进一步优选为选自β-裂解金属蛋白酶、LasA蛋白、及嗜水气单胞菌蛋白酶中的至少一种。
[23]如[22]所述的用途，其中，优选上述β-裂解金属蛋白酶为选自由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的多肽、及由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽中的至少一种。
[24]如[23]所述的用途，其中，优选上述由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽具有与序列编号2所表示的氨基酸序列的H22、D36、H121及H123对应的氨基酸残基。
[25]如[22]至[24]中任一项所述的用途，其中，优选上述LasA蛋白为选自由序列编号4所表示的氨基酸序列构成的多肽、及由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽中的至少一种。
[26]如[25]所述的用途，其中，优选上述由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽具有与序列编号4所表示的氨基酸序列的H23、D36、H120及H122对应的氨基酸残基。
[27]如[22]至[26]中任一项所述的用途，其中，优选上述嗜水气单胞菌蛋白酶为选自由序列编号6所表示的氨基酸序列构成的多肽、及由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽中的至少一种。
[28]如[27]所述的用途，其中，优选上述由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成且具有肽序列中的甘氨酸-甘氨酸键分解活性的多肽具有与序列编号6所表示的氨基酸序列的H21、D34、H118及H120对应的氨基酸残基。
[29]如[19]至[21]中任一项所述的用途，其中，优选上述组合物为无色肽酶。
[30]如[19]至[29]中任一项所述的用途，其中，优选上述组合物进一步含有选自上述M23A亚族蛋白酶以外的蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、及脂肪酶中的至少一种。
[31]如[30]所述的用途，其中，优选上述M23A亚族蛋白酶以外的蛋白酶为碱性蛋白酶。
[32]如[31]所述的用途，其中，上述碱性蛋白酶优选为源自芽孢杆菌属细菌的碱性蛋白酶，
更优选为选自由序列编号26所表示的氨基酸序列或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶、及由序列编号27所表示的氨基酸序列或与其具有至少80％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶中的至少一种。
[33]如[31]或[32]所述的用途，其中，上述组合物中的上述M23A亚族蛋白酶相对于上述碱性蛋白酶的质量比优选为1/20以上，更优选为1/3～20，进一步优选为1～5，进一步更优选为2～3。
[34]如[19]、[21]至[33]中任一项所述的用途，其中，优选上述角质污垢清洁剂为浸渍放置清洁用的清洁剂。
[35]如[19]、[21]至[34]中任一项所述的用途，其中，优选上述角质污垢清洁剂具有对革兰氏阳性菌的杀菌性。
[36]如[20]至[33]中任一项所述的用途，其中，优选用于利用浸渍放置清洁而进行的角质污垢清洁。
[37]如[20]至[33]、[36]中任一项所述的用途，其中，优选用于角质污垢清洁及革兰氏阳性菌杀菌。
[38]一种评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力的方法，其中，包括：
测定受试酶或包含其的组合物对基准肽及一种以上的底物肽的分解活性的步骤；
求出对该一种以上的底物肽的各分解活性相对于对该基准肽的分解活性的相对值的步骤；及
选择该基准肽的分解的比活性为10U/mg以上且针对任意一种以上的该底物肽的该相对值为0.5以上、或具有相当于其的对该基准肽及底物肽的分解活性的受试酶或包含其的组合物的步骤，
该基准肽为GGGGG或GGGG，该一种以上的底物肽选自GGGXG、GXGGG、GGXG及GXGG，X为甘氨酸以外的任意的氨基酸残基。
[39]如[38]所述的方法，其中，优选上述基准肽为GGGGG。
[40]如[38]或[39]所述的方法，其中，优选上述底物肽中的X选自S、Y、L及F。
[41]如[38]至[40]中任一项所述的方法，其中，上述底物肽优选为GGGXG，更优选为选自GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG中的一种以上，进一步优选为GGGSG、GGGYG、GGGLG及GGGFG。
[42]如[38]至[41]中任一项所述的方法，其中，优选上述受试酶为蛋白酶。
[43]如[38]至[42]中任一项所述的方法，其中，优选上述分解活性的测定包括使上述受试酶或包含其的组合物与上述基准肽或上述底物肽接触，接着测量该基准肽或该底物肽的分解量。
[44]如[43]所述的方法，其中，优选上述基准肽或上述底物肽的分解量的测量通过FRET法、气相色谱法、液相色谱法、或薄层色谱法进行。
[45]如[38]至[44]中任一项所述的方法，其中，优选上述分解活性的测定进一步包括求出比活性。
[46]如[38]至[45]中任一项所述的方法，其中，优选将上述选择的受试酶或包含其的组合物选择为角质污垢分解酶或角质污垢分解用组合物的候选物质。
[47]如[38]至[46]中任一项所述的方法，其中，优选为评价酶或包含其的组合物的角质污垢分解能力、及对动物性纤维的损伤性的方法。
[48]如[47]所述的方法，其中，优选将上述选择的受试酶或包含其的组合物选择为具有角质污垢分解能力且动物性纤维的损伤性较低的酶或组合物。
[49]如[48]所述的方法，其中，优选进一步包括评价上述受试酶或包含其的组合物对动物性纤维的分解能力的步骤。
[50]如[49]所述的方法，其中，优选进一步包括使上述选择的受试酶或包含其的组合物与角蛋白接触，并测量生成的角蛋白片段的分子量的步骤。
[51]如[50]所述的方法，其中，优选进一步包括在测得的角蛋白片段的分子量为与上述受试酶或包含其的组合物接触前的角蛋白的分子量的50％以上且97％以下的情况下，将该受试酶或包含其的组合物选择为具有角质污垢分解能力且动物性纤维的损伤性较低的酶或包含其的组合物的步骤。
[52]如[50]或[51]所述的方法，其中，优选上述角蛋白为分子量35,000以上的角蛋白。
[53]如[50]或[51]所述的方法，其中，优选上述角蛋白为角蛋白10。
[54]如[50]或[51]所述的方法，其中，优选上述角蛋白为天青角蛋白。
[55]如[47]至[54]中任一项所述的方法，其中，优选上述动物性纤维为羊毛。
[56]如[38]至[55]中任一项所述的方法，其中，优选上述角质污垢为衣领袖口污垢。
[57]如[38]至[56]中任一项所述的方法，其中，优选上述包含受试酶的组合物为洗涤剂组合物。
实施例
以下，使用实施例对本发明进一步具体地进行说明。但本发明的技术范围并不受这些实施例限定。
将本实施例中使用的引物的一览示于表1。
[表1]
参考例1蛋白酶的制备
(1)包含BLP的培养上清液的制备
(1-1)表达载体的制作
利用GenScript公司的人工基因合成服务制作将BLP基因(序列编号1)插入至质粒pUC57而成的物质(BLP/pUC57)。以BLP/pUC57为模板，使用引物对BLP_S237signal_F/BLP_S237signal_R(序列编号9及10)及PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)进行PCR反应。以WO2006/068148A1的实施例7中记载的质粒pHY-S237作为模板，使用引物对vector-F/vector-sig-R(序列编号11及12)同样地进行PCR反应。对各PCR产物利用DpnI(New EnglandBiolabs)进行DpnI处理。接着，按照In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)的说明书进行In-Fusion反应。
使用In-Fusion反应液将ECOSTMCompetent E.coli DH5α(NIPPON GENE、310-06236)转化。将经转化处理的细胞涂抹于含有氨必西林的LB平板，在37℃下培养一晩。将形成于平板上的菌落植菌于包含氨必西林的LB培养基，培养一晩后，回收菌体，使用高纯度质粒分离试剂盒(High Pure Plasmid Isolation Kit)(Roche)提取质粒(BLP/pHY)。将提取的BLP/pHY作为模板，使用引物对ΔS237N_fw/ΔS237N_rv(序列编号13及14)进行PCR反应。将该PCR产物转化成E.coli HST08 Premium Competent Cells(TAKARA BIO)。将经转化处理的细胞涂抹于含有氨必西林的LB平板，在37℃下培养一晩。将平板上形成的菌落植菌于包含氨必西林的LB培养基，培养一晩后，回收菌体，使用高纯度质粒分离试剂盒(Roche)提取质粒(BLP2/pHY)。
(1-2)酶产生转化株的制作
在1mL的LB培养基中植菌枯草杆菌168株(Bacillus subtilis Marburg No.168株：Nature,390,1997,p.249)，在30℃下以200rpm振荡培养一晩。在1mL的新LB培养基中将该培养液植菌10μL，在37℃下以200rpm培养3小时。将该培养液进行离心分离，并回收颗粒。向颗粒添加包含4mg/mL的溶菌酶(SIGMA)的SMMP[0.5M蔗糖、20mM马来酸二钠、20mM氯化镁六水合物、35％(w/v)抗生素培养基(Antibiotic Medium 3)(Difco)]500μL，在37℃下培养1小时。其次，通过离心分离而回收颗粒，悬浮于400μL的SMMP中。将悬浮液13μL、(1-1)中获得的质粒BLP2/pHY溶液(10mM Tris-HCl pH值8.5、34.2ng/μL)2μL、SMMP 20μL混合，进一步添加100μL的40％PEG并加以搅拌，进一步添加350μL的SMMP后，在30℃下振荡1小时。将该液体200μL涂抹于包含四环素(15μg/mL、SIGMA)的DM3再生琼脂培养基[0.8％琼脂(和光纯药)、0.5％琥珀酸二钠六水合物、0.5％酪蛋白氨基酸技术型(Difco)、0.5％酵母提取物、0.35％磷酸一钾、0.15％磷酸二钾、0.5％葡萄糖、0.4％氯化镁六水合物、0.01％牛血清白蛋白(SIGMA)、0.5％羧甲基纤维素、0.005％锥虫蓝(Merck)及氨基酸混液(色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸各10μg/mL)；％为(w/v)％]，并在30℃下培养3天，获取形成的菌落。
(1-3)利用转化株培养的酶制造
在LB培养基中以最终浓度成为15ppm的方式添加四环素。在该培养基5mL中植菌(1-2)中所获得的枯草杆菌转化体菌落后，在30℃下以250rpm培养一晩。第二天，将该培养液400μL植菌于2×L-麦芽糖培养基(2％胰蛋白胨、1％酵母提取物、1％NaCl、7.5％麦芽糖、7.5ppm硫酸锰五水合物、15ppm四环素、6ppm硫酸锌七水合物；％为(w/v)％)20mL，在32℃下以230rpm培养2天后，通过离心分离回收包含由菌体产生的酶的培养上清液。
(2)包含LasA的培养上清液的制备
利用GenScript公司的人工基因合成服务制作将LasA基因(序列编号3)插入至质粒pUC57而成的物质(LasA/pUC57)。将LasA/pUC57作为模板，使用引物对LasA_F/LasA_CR(序列编号15及16)，按照PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)的说明书进行PCR反应。将WO2006/068148A1的实施例7所记载的质粒pHY-S237作为模板，使用引物对pHY_just_F/pHY_just_R_NEW(序列编号17及18)，同样地进行PCR反应。对各PCR产物利用DpnI(NewEngland Biolabs)进行DpnI处理。接着，按照In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)的说明书进行In-Fusion反应，由此获得质粒(LasA/pHY)溶液。
使用获得的质粒(LasA/pHY)溶液，利用与上述(1-2)相同的步骤进行枯草杆菌prsA基因表达强化株(日本特开2007-49986号公报的实施例1中制作的prsA-Kc株)的转化，获取枯草杆菌转化体菌落。在2×L液体培养基中以最终浓度成为15ppm的方式添加四环素。在该培养基5mL中植菌枯草杆菌转化体菌落后，在30℃下以250rpm培养一晩。自培养液回收颗粒，自颗粒提取质粒LasA/pHY。将提取的质粒LasA/pHY作为模板，使用引物对LasA_Chis_n_F/LasA_Chis_n_R(序列编号19及20)、以及KOD-Plus-突变试剂盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit)(TOYOBO)，进行PCR反应、由Dpn I引起的质粒的消化、及连接(ligation)，获得质粒(LasA2/pHY)。
使用获得的质粒(LasA2/pHY)，利用与上述(1-2)相同的方法进行转化。此时，作为宿主，使用枯草杆菌prsA基因表达强化株(日本特开2007-49986号公报的实施例1中制作的prsA-Kc株)。接着，将获得的转化株利用与(1-3)相同的步骤进行培养，并回收包含由菌体产生的酶的培养上清液。
(3)包含AhP的培养上清液的制备
利用GenScript公司的人工基因合成服务制作将AhP基因(序列编号5)插入至质粒pUC57而成的物质(AhP/pUC57)。将AhP/pUC57作为模板，使用引物对2F/2R_bacillus-Chis(序列编号21及22)，按照PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)的说明书进行PCR反应。将WO2006/068148A1的实施例7所记载的质粒pHY-S237作为模板，使用引物对vector-F/vector-R(序列编号11及23)，同样地进行PCR反应。对各PCR产物利用DpnI(New EnglandBiolabs)进行DpnI处理。接着，按照In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)的说明书进行In-Fusion反应，由此获得质粒(AhP/pHY)溶液。
使用获得的质粒(AhP/pHY)，利用与上述(1-2)相同的方法进行转化。此时，作为宿主，使用枯草杆菌168株。接着，将获得的转化株利用与(1-3)相同的步骤进行培养，并回收包含由菌体产生的酶的培养上清液。
(4)包含ALE-1的培养上清液的制备
制备作为M23B亚族蛋白酶的ALE-1甘氨酰甘氨酸肽链内切酶(ALE-1)(MEROPS ID：M23.012；序列编号8)。利用GenScript公司的人工基因合成服务制作将ALE1基因(序列编号7)插入至质粒pUC57而成的物质(ALE1/pUC57)。将ALE1/pUC57作为模板，使用引物对pHY-like6-just-F/pHY-like6-just-CHisR(序列编号24及25)及PrimeSTAR Max Premix(TAKARA BIO)进行PCR反应。将WO2006/068148A1的实施例7所记载的质粒pHY-S237作为模板，使用引物对pHY_just_F/pHY_just_R_NEW(序列编号17及18)同样地进行PCR反应。对各PCR产物利用DpnI(New England Biolabs)进行DpnI处理。接着，按照In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)的说明书进行In-Fusion反应，由此获得质粒(ALE1/pHY)溶液。
使用获得的质粒(ALE1/pHY)，利用与上述(1-2)相同的方法进行枯草杆菌168株的转化，获得枯草杆菌转化体菌落。在2×L液体培养基中以最终浓度成为15ppm的方式添加四环素。在该培养基5mL中植菌枯草杆菌转化体菌落后，在30℃下以250rpm培养一晩。自培养液回收颗粒，自颗粒提取质粒ALE1/pHY。使用提取的质粒(ALE1/pHY)，利用与上述(1-2)相同的方法进行转化。此时，作为宿主，使用枯草杆菌Dpr9株(日本特开2006-174707号公报的实施例1～5中制作的Kao9株)。将获得的转化株利用与(1-3)相同的步骤进行培养，回收包含由菌体产生的酶的培养上清液。
(5)自培养上清液的蛋白酶制备
由(1)～(4)中获得的培养上清液制备目标蛋白酶。对培养上清液使用AmiconUltra截留分子量10K(Merck Millipore)以缓冲液A进行缓冲液更换。由缓冲液更换后的液体使用AKTA explorer 10S(GE Healthcare)制备酶。首先，使该经缓冲液更换所获得的液体通入柱1，接着使用缓冲液B使柱1的吸附成分洗脱。回收洗脱组分中确认有FRET-GGGGG(参考例2)的分解活性的组分液。接着，对回收的组分液使用利用20mM Tris-HCl(pH值7.5)、200mM NaCl的溶液而已平衡化的柱2进行尺寸排阻色谱(Size ExclusionChromatography)，回收确认有FRET-GGGGG的分解活性的组分液。对回收的组分液使用Amicon Ultra截留分子量10K以20mM Tris-HCl(pH值7.5)溶液进行缓冲液更换，获得包含目标蛋白酶的酶溶液。用于各培养上清液的缓冲液A、缓冲液B、柱1及柱2设为如表2所示。
[表2]
参考例2酶活性的测定
作为底物，使用荧光基团Nma与淬灭基团Lys(Dnp)之间为五甘氨酸的FRET底物[以下称为FRET-GGGGG](在PH Japan订单生产)。此处，Nma是指2-(N-甲基氨基)苯甲酰基(Nma)。另外，Lys(Dnp)是指在赖氨酸(Lys)的侧链具有2,4-二硝基苯基(Dnp)的基团。在96孔的分析板(AGC Techno Glass、3881-096)中添加参考例1(5)中获得的酶溶液(酶、20mMTris-HCl(pH值7.5))190μL，进一步添加FRET-GGGGG溶液(1mM FRET-GGGGG、100mM Tris-HCl(pH值7.5))10μL而制备反应液。使用infinite M200(TECAN)在温度30℃、激发波长340nm、测定波长440nm下经时地测定反应液的荧光强度。在相同的反应条件下，使用20mMTris-HCl pH值7.5液代替酶溶液、并使用用二甲基亚砜溶解的FRETS-25-STD1(PEPTIDEINSTITUTE、3720-v)代替FRET-GGGGG，测定该反应液的荧光强度，制作校准曲线。1单位(U)的活性设为显示相当于每1分钟由1nmol的FRETS-25-STD1所产生的荧光强度的荧光强度的变化所需的酶量。
参考例3酶溶液的浓度测定
酶溶液的浓度测定使用DC蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad)。用于算出蛋白质质量的标准液使用BSA标准溶液(Standard Solution)(WAKO)。
参考例4SDS-PAGE
将包含50mM二硫苏糖醇(Thermo Fisher Scientific)的2×Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad、#161-0737)与试样溶液等量混合，并以100℃加热5分钟，由此制备电泳样品。将该电泳样品使用Any kDTMMini-PROTEAN(注册商标)TGXTM预制胶(Bio-Rad)及经10倍稀释的10×Trsi/甘氨酸/SDS(Bio-Rad、#161-0732)进行电泳。分子量标记使用Precision PlusProteinTM双色标准品(Bio-Rad、#161-0374)。电泳后的凝胶进行CBB染色或Ruby染色。CBB染色使用Bio-Safe CBB G-250染色剂(Bio-Rad、#161-0786)。Ruby染色使用One-step Ruby(APRO life Science、SP-4040)。在可以根据分子量标记的分子量与迁移率制作的校准曲线的式中代入目标蛋白质或多肽的迁移率，将由此获得的值设为该目标蛋白质或多肽的分子量。关于样品的迁移率(Rf值)，测量将该样品流过的泳道中的自凝胶的上端(施加样品的位置)至示踪色素(溴酚蓝)的距离设为1时，自该凝胶的上端至该样品的条带的距离的相对值。
参考例5免疫印迹
对角蛋白溶液以参考例4所记载的步骤进行SDS-PAGE(未染色)后，将凝胶使用Trans-Blot TurboTM系统(Bio-Rad)与Trans-Blot TurboTM微型PVDF转印包(Bio-Rad、#170-4156)，转印至PVDF膜。抗体反应使用Ibind蛋白印迹处理仪(Ibind Western Device)(Thermo Fisher Scientific)。作为一抗，使用KRT10单克隆抗体(M01)、clone1H6(Abnova)，作为二抗，使用稳定的过氧化物酶标记山羊抗小鼠(H+L)(StabilizedPeroxidase Conjugated Goat Anti-Mouse(H+L))(Thermo Fisher Scientific、#32430)，作为检测试剂，使用ECL Select免疫印迹检测试剂(ECL Select Western BlottingDetection Reagent)(GE Healthcare)。
实施例1对金黄色葡萄球菌的酶杀菌力的评价
(酶)
关于酶，作为碱性蛋白酶，使用KP43蛋白酶变异体(以下也称为KP43蛋白酶变异体、或KP43)、及Savinase(注册商标)(SIGMA、P3111)，作为M23A亚族蛋白酶，使用参考例1中制备的BLP、LasA、及AhP，并且作为M23B亚族蛋白酶，使用参考例1中制备的ALE-1、及溶葡球菌酶(Wako、#120-04313)。关于KP43蛋白酶变异体，将日本特开2013-233141号公报中以序列编号250记载的碱性蛋白酶参考该公报所记载的制造方法进行制备并使用。
(杀菌力评价)
将金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)植菌于1mL的SCD液体培养基(日本制药、393-00185)中，在37℃下振荡培养一晩。回收菌体，利用20mM Tris-HCl(pH值7.5)清洗后，利用20mM Tris-HCl(pH值7.5)制备成OD600＝0.5(108cfu/mL)。相对于试验液(20mM Tris-HCl(pH值7.5)+1μg/mL各酶)495μL，添加菌液5μL，在30℃下静置30分钟。将静置后的液体利用LP稀释液(日本制药、397-00281)进行梯度稀释，并向SCD琼脂培养基(日本制药、396-00175)涂布100μL。计数在37℃下培养一晩后的菌落数。
活菌数根据以下的式子算出。
活菌数(cfu/mL)＝稀释倍数*菌落数*10
将杀菌力的评价结果示于图1。KP43蛋白酶变异体、Savinase(注册商标)未发现有对金黄色葡萄球菌的杀菌性。另一方面，BLP、LasA、AhP、ALE-1及溶葡球菌酶发现有对金黄色葡萄球菌的杀菌性。
实施例2对角质污垢的酶清洁力的评价
(衣领袖口污垢的制作)
准备在白衬衫的衣领的区域缝合布(组成：聚酯65％、棉35％)的衬衫。令成年男性在3天内白天穿着该衬衫。其后，回收缝合至衣领的布，以成为1边6mm的正方形的方式裁剪，用作具有衣领袖口污垢的样品布。
(清洁力评价)
清洁液的组成：酶、20mM Tris-HCl(pH值7.5)、硬度10°DH(钙/镁＝4/1(摩尔比))、0.1(w/v)％聚氧乙烯月桂醚硫酸钠(Emal(注册商标)20C、花王(株)制造、有效成分换算)。作为酶，使用实施例1中确认有对金黄色葡萄球菌的杀菌性的酶BLP、LasA、AhP、ALE-1、及溶葡球菌酶(Wako、120-04313)。各酶以最终浓度成为150U/L的方式进行添加。作为对照，使用相同组成且未添加酶的清洁液。
使用扫描仪GT-X970(EPSON)获取样品布的图像。其后，将该样品布浸渍于500μL的清洁液中，在30℃下静置5小时。将静置后的样品布利用硬度10°DH水冲洗后使其干燥，再次使用扫描仪GT-X970获取图像。根据获取的图像，使用图像分析软件ImageJ，测定清洁前后的样品布的平均灰度值(Mean Gray Value)。同样地获取污垢附着前的原布的图像，测定平均灰度值。将获得的平均灰度值代入以下的式子，由此算出清洁率。
清洁率(％)＝(G2－G1)/(G0－G1)*100
G0：样品布的原布的平均灰度值
G1：清洁前的样品布的平均灰度值
G2：清洁后的样品布的平均灰度值
将清洁率的测定结果示于图2。作为M23A亚族蛋白酶的BLP、LasA、及AhP具有对衣领袖口污垢的清洁力。另一方面，作为M23B亚族蛋白酶的ALE-1及溶葡球菌酶未检测到对衣领袖口污垢的清洁力。
实施例3通过BLP与碱性蛋白酶的并用的清洁力的增强
调查BLP与碱性蛋白酶的并用时的衣领袖口污垢清洁力。
(BLP的制备)
利用下述方法制备源自无色肽酶的β-裂解蛋白酶(A-BLP)。将无色肽酶(和光纯药工业、014-09661)溶解于10mM柠檬酸缓冲液(pH值6.0)，将其流入利用相同的缓冲液平衡化后的阳离子交换柱TOYOPEARL GigaCap CM-650M(Tosoh)，以浓度0至500mM的NaCl梯度洗脱。回收洗脱液中可见FRET-GGGGG的分解活性的组分液。对获得的组分液使用利用20mMTris-HCl(pH值7.5)、及200mM NaCl平衡化后的柱TSKgel G4000SWXL(Tosoh)进行尺寸排阻色谱，回收可见FRET-GGGGG的分解活性的组分液。将回收的组分液使用Amicon Ultra截留分子量10K以20mM Tris-HCl(pH值7.5)溶液进行缓冲液更换，制备A-BLP溶液。
以最终浓度成为25mM的方式将二硫苏糖醇(Thermo Fisher Scientific)与2×Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad、#161-0737)混合，并与等量的上述A-BLP溶液混合。将获得的混合液以100℃加热5分钟，接着使用Any kDTMMini-PROTEAN(注册商标)TGXTM预制胶(Bio-Rad)进行SDS-PAGE。标记使用Precision Plus ProteinTM双色标准品(Bio-Rad、#161-0374)。将SDS-PAGE后的凝胶使用Trans-Blot TurboTM系统(Bio-Rad)与Trans-BlotTurboTM微型PVDF转印包(Bio-Rad、#170-4156)转印至PVDF膜。利用Bio-Safe CBB G-250染色剂(Bio-Rad、#161-0786)将膜染色，利用50％甲醇液进行脱色，切出获得的条带的区域。将切出的薄膜的N末端氨基酸序列的分析委托给Leave a Nest Co.,Ltd.的N末端氨基酸序列分析服务。分析的结果，判明N末端氨基酸序列为SPNGLLQFPF。该序列与β-裂解金属肽酶[UniProt Knowledgebase_P00801]所公开的BLP的成熟(mature)区(序列编号2)的N末端序列一致。
(碱性蛋白酶)
作为碱性蛋白酶，将日本特开2013-233141号公报中以序列编号250所记载的碱性蛋白酶(KP43蛋白酶变异体、或KP43)参考该公报所记载的制造方法进行制备并使用。
(清洁力评价)
清洁液的组成：酶1μg/mL、20mM Tris-HCl(pH值7.5)、硬度10°DH(钙/镁＝4/1(摩尔比))、0.1(w/v)％聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠(Emal(注册商标)20C、花王(株)制造、有效成分换算)。作为酶，使用上述A-BLP、KP43蛋白酶变异体、或这些的混合物(KP43:A-BLP(质量比)＝10:0、7.5:2.5、2.5:7.5、0:10)。在将酶并用的情况下，以酶浓度的合计成为1μg/mL的方式调整。
以与实施例2相同的步骤测定由清洁液所产生的衣领袖口污垢的清洁率。将结果示于图3。相比单独的碱性蛋白酶或BLP，将碱性蛋白酶与BLP并用的情况下，可以获得更高的衣领袖口污垢清洁力。进一步，随着BLP相对于碱性蛋白酶的混合比自1/3(KP43:A-BLP＝7.5:2.5)上升至3(KP43:A-BLP＝2.5:7.5)，清洁力进一步提高。
实施例4由酶所产生的角蛋白分解活性的评价
(1)角蛋白溶液的制备
自人的脚后跟使用Velvet Smooth Electric Horny Remover Diamond(ReckittBenckiser)削出角质。相对于脚后跟角质5mg，添加1mL的增溶液(100mM Tris-HCl(pH值8.5)、2％SDS、25mM DTT、5mM EDTA)，以100℃加热10分钟后，进行离心分离并回收上清液。将回收的上清液使用微型透析套件8kDa截留(Mini Dialysis kit 8kDa cut-off)2mL(GEHealthcare、#80-6484-32)，在透析缓冲液(20mM Tris-HCl(pH值7.5)、0.1％SDS)中透析一晩，获得角蛋白溶液。
(2)利用酶的角蛋白分解
将(1)中获得的角蛋白溶液利用20mM Tris-HCl(pH值7.5)稀释20倍。相对于该稀释溶液30μL，添加酶溶液1μL。作为酶，使用参考例1中制备的BLP、LasA、AhP及ALE-1、以及溶葡球菌酶(Wako、#120-04313)、Savinase(注册商标)(SIGMA、P3111)、Alcalase(注册商标)(SIGMA、P4860)、蛋白酶K(关东化学、34076-92)。关于酶的最终浓度，以BLP、Savinase(注册商标)、Alcalase(注册商标)、蛋白酶K成为1μg/mL，LasA、AhP、ALE-1及溶葡球菌酶成为10μg/mL的方式进行调整。将反应液在30℃下静置15小时后，按照参考例4的步骤利用SDS-PAGE(CBB染色)进行评价。
将结果示于图4。添加有作为M23A亚族的酶的BLP、LasA、AhP的溶液在分子量37,000标记与分子量50,000标记之间检测到条带，表示这些酶分解了角蛋白。另一方面，添加有作为M23B亚族的酶的ALE-1或溶葡球菌酶的溶液未见到角蛋白的分解。即，表示M23家族中仅M23A亚族的酶会分解角蛋白。另外，添加有Savinase(注册商标)、Alcalase(注册商标)、蛋白酶K的溶液中，主要的条带消失。认为这些酶中未检测到角蛋白片段的条带的原因在于：由于角蛋白分解成各种分子量的片段，因此成为检测极限以下，或由于片段低分子化，因此流出至凝胶外。
(3)角蛋白组分的评价
将(1)中获得的角蛋白溶液利用20mM Tris-HCl(pH值7.5)稀释20倍，按照与参考例4～5相同的步骤，通过SDS-PAGE(CBB染色)与免疫印迹进行评价。利用SDS-PAGE与免疫印迹进行评价的结果，确认了由脚后跟角质制备的角蛋白溶液包含角蛋白10(图5)。图5中检测到多个条带，认为这些除了单体的角蛋白10以外，为复合体化的角蛋白10、经修饰的角蛋白10、角蛋白1及其它种类的角蛋白等。
实施例5利用M23A亚族蛋白酶的源自角质细胞的不溶性角蛋白的分解
使用2cm胶带(Nichiban、CT-24)，通过胶带剥离而自人的脖子获取角质。对该角质添加增溶液(100mM Tris-HCl(pH值8.5)、2％SDS、25mM DTT、5mM EDTA)，以100℃加热10分钟后，进行离心分离，去除上清液而获得沉淀物。对于沉淀物进一步进行2次该增溶液的添加、加热、离心分离的操作，由此获得源自角质细胞的不溶性成分。在获得的不溶性成分中添加20mM Tris-HCl(pH值7.5)40μL，进一步添加酶溶液1μL。作为酶，使用参考例1中制备的BLP、LasA、及AhP。关于酶的最终浓度，将BLP调整为1μg/mL，将LasA及AhP调整为10μg/mL。将反应液在30℃下静置15小时后，按照参考例4的步骤，进行上清液的SDS-PAGE(Ruby染色)。将结果示于图6。添加有BLP、LasA及AhP的溶液均在分子量37,000标记与分子量50,000标记之间检测到条带，表示这些酶分解了角质的不溶性组分中的角蛋白。
实施例6M23A亚族蛋白酶的底物的分析
如图4、6所示，在经M23A亚族蛋白酶处理的角蛋白溶液的SDS-PAGE中，在分子量37,000标记与分子量50,000标记之间检测到2条条带。其中，对图6所示的BLP处理溶液的SDS-PAGE样品进行低分子侧的条带的质谱。质谱中，使用Leave a Nest Co.,Ltd.的MALDI-TOF Mass Spec Analysis。质谱的结果，判明该条带区域所含的蛋白质为角蛋白10(ACCESSION_AAH34697)的片段。
在图7中表示角蛋白10的氨基酸序列(序列编号28)。粗体字表示质谱中鉴定出的来自酶处理液的条带中的肽序列。如图7所示，在角蛋白10的两末端存在甘氨酸富集区，另一方面，本实施例中的质谱中检测出的肽序列(粗体字)包含于中央区域。该质谱中检测出的肽序列均存在于角蛋白10的氨基酸序列的编号157至450之间。根据以上，判明BLP及其它M23A亚族的酶通过切断角蛋白10的氨基酸序列的两末端、即第1～156号氨基酸区域或第451～584号氨基酸区域中的甘氨酸富集区，从而分解角质所含的全长角蛋白10。
实施例7羊毛角蛋白的分解性评价
使用原料中使用羊毛的天青角蛋白(SIGNA、K8500，批号：SLBM2921V)，评价酶的羊毛角蛋白分解性(损伤性)。作为酶，使用Savinase(注册商标)(SIGMA、P3111)、Alcalase(注册商标)(SIGMA、P4860)、及蛋白酶K(关东化学、34076-92)、以及参考例1中制备的BLP、LasA、AhP。将6mg的天青角蛋白浸渍于1mL的20mM Tris-HCl、pH值7.5液体中，添加调整成100μg/mL的酶溶液100μL。在室温下静置72小时后，进行离心分离并回收上清液，使用infinite M200(TECAN)测定波长595nm的吸光度。将自添加有酶的溶液的上清液的吸光度减去未添加酶的溶液的上清液的吸光度所得到的值设为ΔA595。
将结果示于图8。添加有Savinase(注册商标)、Alcalase(注册商标)、蛋白酶K的样品相比添加有BLP、LasA、AhP的样品，确认有吸光度的增大。根据以上，判明Savinase(注册商标)、Alcalase(注册商标)、蛋白酶K相比BLP、LasA、AhP，效率良好地分解源自羊毛的天青角蛋白、即羊毛损伤性较高。
在实施例2、4～6中，启示了可以分解角蛋白10的甘氨酸富集的区域的酶具有对角质污垢的清洁力。进一步，在实施例6～7中，判明了分解角蛋白10的甘氨酸富集区但无法分解角蛋白10的中央区域的酶对羊毛角蛋白的分解性较低。认为这是由于构成动物性纤维的蛋白质中不存在角蛋白10的甘氨酸富集区程度的甘氨酸富集的区域。因此，启示了能够以甘氨酸富集的区域的分解性为基准来评价酶的角质污垢分解能力与动物性纤维的分解能力(损伤性)。
实施例8BLP的兜甲蛋白分解活性
将融合有标签序列的重组兜甲蛋白(Recombinant Human Loricrin protein；Abcam、ab114261)使用Amicon Ultra截留分子量10K(Merck Millipore)制备成反应液(20mM Tris-HCl(pH值7.5)、硬度10°DH(钙/镁＝4/1(摩尔比))、0.1(w/v)％聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠)的溶液。在该溶液30μL中添加参考例1中制备的BLP溶液(60μg酶/mL)1μL，在30℃下静置3小时。反应后的溶液通过参考例4的步骤进行SDS-PAGE(CBB染色)，其结果检测出3条主要的条带(图9、箭头)。
将同样地制备的SDS-PAGE(未染色)后的凝胶使用Trans-Blot TurboTM系统(Bio-Rad)与Trans-Blot TurboTM微型PVDF转印包(Bio-Rad、#170-4156)转印至PVDF膜。将转印后的膜利用Bio-Safe CBB G-250染色剂(Bio-Rad、#161-0786)进行染色，并利用50％乙醇液进行脱色后，切出在与图9相同的位置上出现的3条条带的区域。将切出的条带的N末端氨基酸序列的分析委托给Leave a Nest Co.,Ltd.的N末端氨基酸序列分析服务。其结果，判明任一条带的N末端氨基酸序列均不为兜甲蛋白序列，由此推测条带源自标签序列。即，表示BLP分解了兜甲蛋白。
图10中表示本实施例中使用的兜甲蛋白的氨基酸序列(序列编号29)。如图10所示，兜甲蛋白为甘氨酸富集的蛋白质。另一方面，本实施例中使用的标签序列(图10中未示出)中几乎不存在甘氨酸富集的区域。因此，如果结合本实施例的结果与实施例6的结果，则启示了BLP通过分解甘氨酸富集区而分解兜甲蛋白。
实施例9角质污垢分解酶的底物特异性
针对各种酶，调查由角质污垢分解能力所产生的底物特异性的差异。以与参考例2相同的步骤，但是使用分别包含GGGGG、GGGSG、GGGYG、GGGLG、及GGGFG(序列编号30、32～35)的5种肽作为肽序列的FRET底物，调查蛋白酶对各种底物肽的分解活性。蛋白酶使用参考例1中制备的BLP、LasA、AhP及ALE-1、以及溶葡球菌酶(Wako、120-04313)。另外，利用参考例5的方法测定各蛋白酶溶液的浓度。对于各蛋白酶，求出每1mg酶的活性(比活性：U/mg)。
将结果示于表3。实施例2中分解了角质污垢的M23A亚族蛋白酶(BLP、LasA及AhP)在GGGGG的FRET底物中比活性为10U/mg以上。进一步，在GGGSG、GGGYG、GGGLG、GGGFG的任一者的FRET底物的一种以上中，相对于GGGGG的FRET底物的相对活性超过0.5。另一方面，实施例4中未分解角质污垢的M23B亚族蛋白酶(ALE-1及溶葡球菌酶)在GGGGG的FRET底物中比活性小于10U/mg。进一步，在GGGSG、GGGYG、GGGLG、GGGFG的任一者的FRET底物中均未发现有活性，相对于GGGGG的FRET底物的相对活性小于0.5。
[表3]
比活性(U/mg)
根据以上的实施例的结果，确认了在将GGGGG作为基准肽，将GGGSG、GGGYG、GGGLG、GGGFG作为底物肽的情况下，具有角质污垢分解能力的酶对基准肽具有10U/mg以上的比活性，且对任意一种以上的底物肽具有5U/mg以上(相对活性为0.5以上)的分解活性。因此，启示了能够以酶对各种甘氨酸富集的基准肽及底物肽的活性为基准，评价该酶的角质污垢分解能力。进一步，启示了通过确认角蛋白分解行为，从而除了角质污垢分解能力以外，还可以评价对动物性纤维的损伤性。因此，通过使用本发明的评价方法，能够有效地筛选具有角质污垢分解能力的酶，进一步也能够有效地筛选具有角质污垢分解能力且对动物纤维的损伤性较低的酶。
以上，虽然对本发明的实施方式进行了说明，但应理解这些并不意图将本发明限定于所说明的特定的实施方式。在本发明的范围内的各种其它变更及修正对本领域技术人员来说是显而易见的。本说明书中引用的文献及专利申请犹如其完全记载于本说明书中那样作为参考引用。
序列表
<110> 花王株式会社
<120> 角质污垢清洁剂及角质污垢分解能力的评价方法
<130> KS1615
<150> JP 2018-005193
<151> 2018-01-16
<150> JP 2018-005194
<151> 2018-01-16
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1134
<212> DNA
<213> 水解无色杆菌
<400> 1
atgaaaaaaa tctcaaaagc tggtctggga ctggctctgg tctgtgctct ggcgacgatt 60
ggaggcaacg catctgctca gggacatgga ttaagcggcg aagatctggt ttactcttac 120
gatgaaatgt ttgattttga tatcgatgcc tacctggcaa aacatgcgcc gcatctgcat 180
aaacatagcg aagaaatctc tcattgggcc ggatattctg gcatttcacc gaaagttctt 240
atcgcattaa tggaacaaca gtcaggagct gtgagcgcca aaagagcaac aaatcgcccg 300
tttggcaaac ttgccagagc agatggattt ggcgcccaaa cacgcgaagt ggcgttagct 360
ctgagagaat ctctttatga acgcgatccg gatggagcca aaggcccggt cacattagcc 420
agagcaaacc cgctgcaggc actttttgaa cgctcaggag ataatgaacc ggcagcggct 480
ttaagaggag atggcgaatt tcaacttgtc tacggcagat tatttaacga accgcgccag 540
gcaaaagccg caagcgatag atttgcgaaa gctggaccgg atgttcaacc gttatctccg 600
aatggactgc ttcagtttcc gtttccgaga ggcgcatctt ggcatgtggg cggagctcat 660
acaaacacag gatcaggcaa ttatccgatg tcaagcctgg atatgtcaag aggcggaggc 720
tggggaagca atcaaaacgg caattgggtt tcagcgagcg cggctggatc ttttaaacgc 780
cattcttcat gctttgctga aattgttcat acaggcggct ggtcaacaac atactaccat 840
ctgatgaaca tccagtacaa tacaggcgcg aacgttagca tgaatacagc catcgcaaac 900
ccggctaata cacaagcgca ggctctgtgc aacggaggcc aaagcacagg accgcatgaa 960
cattggtcac tgaaacagaa cggctcattt taccatctga acggaacata cctttcaggc 1020
tatagaatca cagcgacagg cagctcttat gatacaaatt gtagccgctt ttatttgaca 1080
aaaaatggac agaactactg ctatggttat tatgtgaatc ctggaccgaa ctaa 1134
<210> 2
<211> 179
<212> PRT
<213> 水解无色杆菌
<220>
<223> β-裂解金属蛋白酶(BLP)成熟蛋白质
<400> 2
Ser Pro Asn Gly Leu Leu Gln Phe Pro Phe Pro Arg Gly Ala Ser Trp
1 5 1015
His Val Gly Gly Ala His Thr Asn Thr Gly Ser Gly Asn Tyr Pro Met
202530
Ser Ser Leu Asp Met Ser Arg Gly Gly Gly Trp Gly Ser Asn Gln Asn
354045
Gly Asn Trp Val Ser Ala Ser Ala Ala Gly Ser Phe Lys Arg His Ser
505560
Ser Cys Phe Ala Glu Ile Val His Thr Gly Gly Trp Ser Thr Thr Tyr
65707580
Tyr His Leu Met Asn Ile Gln Tyr Asn Thr Gly Ala Asn Val Ser Met
859095
Asn Thr Ala Ile Ala Asn Pro Ala Asn Thr Gln Ala Gln Ala Leu Cys
100 105 110
Asn Gly Gly Gln Ser Thr Gly Pro His Glu His Trp Ser Leu Lys Gln
115 120 125
Asn Gly Ser Phe Tyr His Leu Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Gly Tyr Arg
130 135 140
Ile Thr Ala Thr Gly Ser Ser Tyr Asp Thr Asn Cys Ser Arg Phe Tyr
145 150 155 160
Leu Thr Lys Asn Gly Gln Asn Tyr Cys Tyr Gly Tyr Tyr Val Asn Pro
165 170 175
Gly Pro Asn
<210> 3
<211> 1257
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌
<400> 3
atgcaacata aaagaagccg tgcgatggcg agcccgagaa gcccgttcct gtttgtgctg 60
ctggccctgg cggtgggtgg tactgccaac gcgcatgatg atggcctgcc ggcatttcgt 120
tattcagccg aactgctggg tcaactgcag ctgccgtctg tggcactgcc gctgaatgat 180
gacctgtttc tgtatggccg tgatgcggaa gcatttgatc tggaagcgta tctggcactg 240
aatgcaccgg cactgcgtga taaaagcgaa tatctggaac attggtcagg ctattattct 300
attaatccga aagttctgct gacactgatg gtcatgcaaa gcggtccgct gggtgcaccg 360
gatgaacgtg cactggcagc accgctgggc cgtctgtcag ccaaacgcgg ttttgatgcg 420
caggtgcgcg atgttctgca gcagctgtct cgccgttatt atggctttga agaatatcaa 480
ctgcgccagg cagcagcacg taaagcagtt ggcgaagatg gtctgaatgc agcatctgca 540
gcgctgctgg gcctgctgcg tgaaggtgca aaagtcagcg cagtgcaggg cggtaatccg 600
ctgggtgcat atgcccagac ctttcagcgc ctgtttggta caccggcggc agaactgctg 660
cagccgtcaa atcgtgttgc acgtcaactg caggcaaaag cggcactggc accgccgagc 720
aacctgatgc agctgccgtg gcgtcagggc tattcatggc agccgaatgg tgcacatagc 780
aacacgggct caggttatcc gtatagctca tttgatgcca gctatgattg gccgcgttgg 840
ggctctgcaa cctatagcgt ggttgcagcc catgcgggta cagtccgcgt gctgtctcgt 900
tgccaagttc gtgtcacaca tccgtctggt tgggcaacca attattatca tatggatcag 960
attcaggtga gcaacggtca gcaggtttca gcagatacga aactgggcgt ttatgcaggt 1020
aatatcaaca cagccctgtg cgaaggcggt tctagcacgg gcccgcatct gcatttttct 1080
ctgctgtata atggtgcgtt tgtctcactg cagggcgcat cttttggtcc gtatcgcatc 1140
aacgtgggca ccagcaatta tgataacgat tgtcgccgtt attacttcta caatcagtct 1200
gctggaacaa cccactgtgc ctttagaccg ctgtataatc cgggactggc tctgtaa 1257
<210> 4
<211> 182
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌
<220>
<223> LasA蛋白(LAS)成熟蛋白质
<400> 4
Ala Pro Pro Ser Asn Leu Met Gln Leu Pro Trp Arg Gln Gly Tyr Ser
1 5 1015
Trp Gln Pro Asn Gly Ala His Ser Asn Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr
202530
Ser Ser Phe Asp Ala Ser Tyr Asp Trp Pro Arg Trp Gly Ser Ala Thr
354045
Tyr Ser Val Val Ala Ala His Ala Gly Thr Val Arg Val Leu Ser Arg
505560
Cys Gln Val Arg Val Thr His Pro Ser Gly Trp Ala Thr Asn Tyr Tyr
65707580
His Met Asp Gln Ile Gln Val Ser Asn Gly Gln Gln Val Ser Ala Asp
859095
Thr Lys Leu Gly Val Tyr Ala Gly Asn Ile Asn Thr Ala Leu Cys Glu
100 105 110
Gly Gly Ser Ser Thr Gly Pro His Leu His Phe Ser Leu Leu Tyr Asn
115 120 125
Gly Ala Phe Val Ser Leu Gln Gly Ala Ser Phe Gly Pro Tyr Arg Ile
130 135 140
Asn Val Gly Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Asp Cys Arg Arg Tyr Tyr Phe
145 150 155 160
Tyr Asn Gln Ser Ala Gly Thr Thr His Cys Ala Phe Arg Pro Leu Tyr
165 170 175
Asn Pro Gly Leu Ala Leu
180
<210> 5
<211> 1164
<212> DNA
<213> 嗜水气单胞菌
<400> 5
atgtctcgtc cgatcccgtc cctgctgatg ctggctctgc tgccggctgc tggttgggct 60
ggcgatattc acgctccgct ggctccgtat cattttacgg cgcagcaact ggcagcatct 120
caaaccccgg cactgccgct ggatgaagca cattttgttt ttggcgaagc cgcgatggca 180
tttgatctgc atgattttct gctgcagcag gccccgcatc tgctgccgaa agaagaagtc 240
attctgcatt ggagcggtat cacgtcactg aatccgcagc tgctgctggc cctgatggaa 300
gcgagctcac agctgatttc agcaccgtct gaacaggcca tggcagcccc gtttgcgaaa 360
ctggtgaatg cacgtggctt tgataaccag ctggaactga tggcccgcca gctgtctgaa 420
cgtttttatc aggcacgcgc ccagcagaaa ctgatgcaac gttctgcacc ggcactggcc 480
ccgcaggcgg cacatcaggc cgcgctggca tcaatgctgt ctaccagcat gcagcgtcag 540
ctgggcgaac agtggcagac cctgtttggt caagatgcaa tgacaagccc gcgcggcggt 600
gcagcagcac cggcagcccc gctggcaggc ggtcaatttc agctgccgtg gcgtcagggc 660
tattcttgga aagcgaatgg tgcacattct catacaggca gcggttatcc gtattctagc 720
atcgatgtca gctatgattg gccgggttgg ggcggtgcga cctatacagt gacggcggca 780
aactcaggta ccgtgacagt gtttagccgt tgccaggtcc gtgtgacagc aaccaatggc 840
tgggcgacaa actattatca tatgagcggc atttcagtgc gttctggtga ttatgttgcc 900
gcggatacac cgatcggcac gtatgcctca aatcgcaacg aagcgctgtg cgaaggcggt 960
tcatctacgg gtccgcatct gcattttagc ctgctgtata atggcgtttt tcagtcactg 1020
cagggtcagc gtctgagctc atatgcagtt aatgtcggcg ccagcaacta tgatgataat 1080
tgtaaccgct tttggctgta taaccaaaga aacggacaac gctactgtgc ttggcaaccg 1140
ctgtataata acggaatcga ctaa 1164
<210> 6
<211> 179
<212> PRT
<213> 嗜水气单胞菌
<220>
<223> 嗜水气单胞菌蛋白酶(AhP)成熟蛋白质
<400> 6
Ala Gly Gly Gln Phe Gln Leu Pro Trp Arg Gln Gly Tyr Ser Trp Lys
1 5 1015
Ala Asn Gly Ala His Ser His Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser
202530
Ile Asp Val Ser Tyr Asp Trp Pro Gly Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Thr
354045
Val Thr Ala Ala Asn Ser Gly Thr Val Thr Val Phe Ser Arg Cys Gln
505560
Val Arg Val Thr Ala Thr Asn Gly Trp Ala Thr Asn Tyr Tyr His Met
65707580
Ser Gly Ile Ser Val Arg Ser Gly Asp Tyr Val Ala Ala Asp Thr Pro
859095
Ile Gly Thr Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Glu Ala Leu Cys Glu Gly Gly
100 105 110
Ser Ser Thr Gly Pro His Leu His Phe Ser Leu Leu Tyr Asn Gly Val
115 120 125
Phe Gln Ser Leu Gln Gly Gln Arg Leu Ser Ser Tyr Ala Val Asn Val
130 135 140
Gly Ala Ser Asn Tyr Asp Asp Asn Cys Asn Arg Phe Trp Leu Tyr Asn
145 150 155 160
Gln Arg Asn Gly Gln Arg Tyr Cys Ala Trp Gln Pro Leu Tyr Asn Asn
165 170 175
Gly Ile Asp
<210> 7
<211> 1089
<212> DNA
<213> 头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)
<400> 7
atggatacta atcgtaaatt cactctggta aaatctctga gcatcggact gggcactttc 60
ctggttggta gcgtctttct gaccgtcaac gatgaagcca gcgcgtcaac gaaagtggat 120
gcgccgaaag ttgaacagga agcaccggcc aaagcggatg caccgaaagt ggaacaggaa 180
gccccggcga aagcagatgc cccgaaagtc gaacaggaag cgccggcaaa agtcgatgcc 240
ccgaaagtag aacaggaagc cccggcaaaa gttgatgcgc ctaaggtaga acaggaagca 300
ccggcaaaag cagacgcacc gaaagtcgaa cagaaacgca cctttgtgcg tgaagcggca 360
cagtctaacc attctgcaag ctggctgaac aactacaaaa aaggttacgg ctacggtccg 420
tatccgctgg gtattaacgg cggtaatcat tatggcgtcg atttctttat gaatgttggc 480
acaccggtcc gcgcaattag cgatggtaaa atcgttgaag ccggctggac gaactatggc 540
ggtggcaatg aaatcggtct ggtggaaaac gatggcgttc atcgccagtg gtacatgcat 600
ctgagcaaat tcaacgtgaa agttggtgat cgtgtgaaag caggccagat tatcggctgg 660
tcaggttcta caggctattc aacggccccg catctgcatt ttcagcgtat gacgaacagc 720
ttttcaaata acaccgcgca ggatccgatg ccgtttctga aatcagcagg ctatggttct 780
aacagcacca gctcatctaa caacaacggt tacaaaacca acaaatacgg cacactgtac 840
aaatcagaat ctgccagctt taccgcgaat acagatatta tcacgcgcct gaccggcccg 900
tttcgttcaa tgccgcagtc tggtgttctg cgcaaaggcc tgaccatcaa atacgatgaa 960
gtcatgaaac aggatggtca tgtctgggtg ggctataaca caaatagcgg caaacgtgtt 1020
tatctgccgg taagaacttg gaatgaatca acgggagaac tgggtccgct gtggggaaca 1080
atcaaataa 1089
<210> 8
<211> 327
<212> PRT
<213> 头状葡萄球菌
<220>
<223> ALE-1甘氨酰甘氨酸肽链内切酶(ALE-1)成熟蛋白质
<400> 8
Ser Thr Lys Val Asp Ala Pro Lys Val Glu Gln Glu Ala Pro Ala Lys
1 5 1015
Ala Asp Ala Pro Lys Val Glu Gln Glu Ala Pro Ala Lys Ala Asp Ala
202530
Pro Lys Val Glu Gln Glu Ala Pro Ala Lys Val Asp Ala Pro Lys Val
354045
Glu Gln Glu Ala Pro Ala Lys Val Asp Ala Pro Lys Val Glu Gln Glu
505560
Ala Pro Ala Lys Ala Asp Ala Pro Lys Val Glu Gln Lys Arg Thr Phe
65707580
Val Arg Glu Ala Ala Gln Ser Asn His Ser Ala Ser Trp Leu Asn Asn
859095
Tyr Lys Lys Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly
100 105 110
Gly Asn His Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Val Gly Thr Pro Val
115 120 125
Arg Ala Ile Ser Asp Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Thr Asn Tyr
130 135 140
Gly Gly Gly Asn Glu Ile Gly Leu Val Glu Asn Asp Gly Val His Arg
145 150 155 160
Gln Trp Tyr Met His Leu Ser Lys Phe Asn Val Lys Val Gly Asp Arg
165 170 175
Val Lys Ala Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser
180 185 190
Thr Ala Pro His Leu His Phe Gln Arg Met Thr Asn Ser Phe Ser Asn
195 200 205
Asn Thr Ala Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Gly
210 215 220
Ser Asn Ser Thr Ser Ser Ser Asn Asn Asn Gly Tyr Lys Thr Asn Lys
225 230 235 240
Tyr Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Ala Asn Thr
245 250 255
Asp Ile Ile Thr Arg Leu Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser
260 265 270
Gly Val Leu Arg Lys Gly Leu Thr Ile Lys Tyr Asp Glu Val Met Lys
275 280 285
Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Asn Thr Asn Ser Gly Lys Arg
290 295 300
Val Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Glu Ser Thr Gly Glu Leu Gly
305 310 315 320
Pro Leu Trp Gly Thr Ile Lys
325
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> BLP_S237signal_F
<400> 9
gaaggaaaca ctcgtatgaa aaaaatctca aaagc 35
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> BLP_S237signal_R
<400> 10
aactagttta atagattagt tcggtccagg attcac 36
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> vector-F
<400> 11
tctattaaac tagttatagg gttatctaaa gg 32
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> vector-sig-R
<400> 12
acgagtgttt ccttctgctg c 21
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> delta-S237N_fw
<400> 13
tgcagcaatg aaaaaaatct caaaagctgg tctgg 35
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> delta-S237N_rv
<400> 14
tttttcattg ctgcaagagc tgccggaa 28
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LasA_F
<400> 15
gcagctcttg cagcacatga tgatggcctg 30
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LasA_CR
<400> 16
tagtttaata gattagtggt ggtggtggtg cagagccagt cccgg 45
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pHY_just_F
<400> 17
taatctatta aactagttat agggttatct aaagg 35
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pHY_just_R_NEW
<400> 18
tgctgcaaga gctgccggaa a 21
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LasA_Chis_n_F
<400> 19
taatctatta aactagttat agggttatct aaagg 35
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> LasA_Chis_n_R
<400> 20
cagagccagt cccggattat ac 22
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 2F
<400> 21
ttaggaggta atatgatgtc tcgtccgatc c 31
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 2R_bacillus-Chis
<400> 22
aactagttta atagattagt ggtggtggtg gtggtcgatt ccgtt 45
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> vector-R
<400> 23
catattacct cctaaatatt tttaaagtaa ttg 33
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pHY-like6-just-F
<400> 24
gcagctcttg cagcagcggc acagtctaac 30
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> pHY-like6-just-CHisR
<400> 25
tagtttaata gattagtggt ggtggtggtg tttgattgtt cccca 45
<210> 26
<211> 435
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌改性KSM-KP43
<400> 26
Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser
1 5 1015
Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
202530
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
354045
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
505560
Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly
65707580
Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
859095
Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
100 105 110
Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
115 120 125
Ser Trp Gly Ala Ser Ser Thr Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg
130 135 140
Asn Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala
145 150 155 160
Ala Gly Asn Glu Gly Pro Gly Val Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr
165 170 175
Ala Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser
180 185 190
Phe Gly Ser Gln Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro
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<213> 芽孢杆菌K-16
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1 5
