用于酶包封的耐热蜡基质颗粒
技术领域
本发明的组合物和方法涉及用于酶包封的耐热蜡基质颗粒。所述颗粒非常适合用于动物饲料应用、特别是涉及蒸汽造粒的那些。
背景技术
现有的用于生产细粒的商业方法包括颗粒化、高剪切制粒和流化床喷涂。酶细粒的颗粒化描述于美国专利号4,016,040中。在颗粒化(也称为喷雾冷冻或喷雾冻结)中，将熔融液体雾化并且然后凝固成颗粒。可以使用各种雾化方法，包括喷雾喷嘴雾化、离心喷嘴雾化和旋转式圆盘雾化。(参见例如美国专利号7,261,529和7,758,778)。当将颗粒化应用于酶包封时，将干酶粉与熔融亲水粘合剂如非离子表面活性剂共混并且使用喷雾喷嘴或圆盘将混合物雾化成液滴进入冷空气中，使得其凝固成含有分散酶粉末的基本上球形的、水分散性固体颗粒或“小颗粒”。这些小颗粒中的粘合剂是亲水的且水溶性或水分散性的，一旦粘合剂溶解允许将酶释放到洗涤剂洗涤水中。
适用于粒化的动物饲料中的酶的高剪切制粒描述于例如WO92/12645。首先将酶与各种粘合剂和填料一起制粒，例如以产生所谓的“T-细粒”(描述于美国专利号4,106,991中)。然后用包含高熔点脂肪或蜡、典型地还进一步包含无机填料如高岭土、硅酸镁或碳酸钙的试剂外涂覆T-细粒。所述高熔点脂肪或蜡被指定为具有在30℃与100℃之间的熔点的甘油酯或其他蜡状物质。
具有多个保护性涂层的酶细粒可以使用涂覆方法如流化床喷涂来生产。例如，U.S.2006/040394描述了用于生产对蒸汽造粒稳定的细粒的方法，所述细粒包括水分水合涂层和水分阻挡层(施加在酶核上)。所述水分水合涂层可以是包含硫酸钠的层，并且所述水分阻挡层可以是包含聚乙烯醇和滑石的层。
WO 01/25412中描述了用于用厚涂层保护酶细粒的方法。所述涂层被称为“壳单元”，其被施加在“核单元”上，使得所得细粒的直径与核单元的直径之间的比率是至少1.1。酶活性仅限于核单元；壳单元被指定为“基本不含酶”，也就是说，含有少于5mg酶/克壳。壳单元对其化学组成没有规定的限制，并且可以包含亲水或疏水材料，如聚合物或蜡。当用于在蒸汽造粒饲料的情况下保护酶时，规定壳单元应该具有将在造粒条件下熔融的总体组成，并且应该具有70℃-120℃的熔融温度。
尽管以上引用的专利中描述的方法和配制品为酶提供了某种程度的保护使其抵抗由高温和水分(如在动物饲料或洗涤剂的蒸汽造粒或储存时遇到的)造成的灭活，但这些技术具有某些缺点。在先前的颗粒化应用中，基质中使用的粘合剂在高温和潮湿条件(如在蒸汽造粒或喷雾干燥衣物洗涤剂中使用的那些)下将溶解或将熔融，使酶极易受到由热蒸气或水引起的变性。在引用的其他技术的情况下，酶的保护需要添加基本上不含酶的厚涂层。此类涂层可以容易地施加到较大的酶核(即具有大于约300微米的中值直径的那些)上，但是它们不能有效地施加到较小的颗粒上。
因此，希望确定一种制粒技术，其可以保护酶抵抗高温和水分，在水基应用(如动物饲料或清洁剂)中提供充足的释放或生物利用度，并且又避免了施加保护性涂层或阻挡层的需要。还需要一种制粒技术，其能够生产直径小于500微米的具有高活性酶浓度的颗粒，当混合到最终产品如动物饲料或洗涤剂中时提供低成本和改善的分布两者。
发明内容
本发明的组合物和方法涉及用于酶包封的耐热蜡基质颗粒。所述蜡基质颗粒非常适合用于食品和动物饲料应用、特别是涉及蒸汽造粒的那些。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一方面，提供了一种包含分散在高熔点蜡基质内的含有一种或多种酶的微粒的颗粒。
2.在段落1所述的颗粒的一些实施例中，所述蜡基质包括水不溶性蜡。
3.在段落1或2所述的颗粒的一些实施例中，所述蜡具有大于100℃、任选地大于110℃、并且甚至任选地大于120℃的峰值最大熔点。
4.在段落1-3中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述蜡具有至少100℃的起始熔点和至少110℃的峰值最大熔点。
5.在段落1-3中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述蜡具有至少110℃的起始熔点和至少120℃的峰值最大熔点。
6.在段落1-5中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述蜡在高于蜡熔融温度25℃内的温度下具有小于500厘泊的熔体粘度。
7.在段落1-5中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述蜡具有小于3,000的重均分子量和小于3的多分散性指数。
8.在段落1-5中任一项所述的颗粒的一些实施例中，ECR(40,140)小于20％、并且优选小于15％。
9.在根据段落1-8中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述酶是淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、蛋白酶或木聚糖酶中的至少一种。
10.在一些实施例中，根据段落1-9中任一项所述的颗粒包含大于5％wt/wt的活性酶有效载荷和小于0.3的水活性。
11.在根据段落1-10中任一项所述的颗粒的一些实施例中，酶微粒范围为约1至约250微米。
12.在一些实施例中，根据段落1-10中任一项所述的颗粒包含小于5％wt/wt的水含量以及小于0.4的水活性。
13.在根据段落1-12中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述颗粒范围为约100至约500微米。
14.在段落13所述的颗粒的一些实施例中，颗粒尺寸范围为约212至约425微米。
15.在段落13所述的颗粒的一些实施例中，颗粒尺寸范围为约212至约300微米。
16.在根据段落1-15中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述酶微粒用喷雾干燥、喷雾冷冻、干法制粒、湿法制粒或流化床制粒中的任一种生产。
17.在一些实施例中，根据段落1-16中任一项所述的颗粒包含选自由石灰石、云母、粘土和氧化钛组成的矿物质的组的填料成分。
18.在根据段落1-17中任一项所述的颗粒的一些实施例中，蜡选自由聚乙烯蜡、氧化的聚乙烯蜡、聚丙烯蜡、费-托(Fischer-Tropsch)蜡、羧酸盐蜡或其混合物组成的聚合物蜡的组。
19.在根据段落1-17中任一项所述的颗粒的一些实施例中，蜡是聚乙烯蜡。
20.在根据段落1-17中任一项所述的颗粒的一些实施例中，蜡选自由硬脂酸铝、硬脂酸钙、硬脂酸镁、山萮酸锌、月桂酸锌、硬脂酸锌或其混合物组成的蜡的组。
21.在根据段落1-17中任一项所述的颗粒的一些实施例中，蜡是硬脂酸锌。
22.在根据段落18-21中任一项所述的颗粒的一些实施例中，所述颗粒包含聚萜烯树脂、松香树脂、达玛树脂或所述树脂的混合物。
23.在根据段落21所述的颗粒的一些实施例中，所述颗粒包含聚萜烯树脂、松香树脂、达玛树脂或所述树脂的混合物。
24.在另一方面，提供了一种用于制备包含分散在高熔点蜡基质内的酶微粒的颗粒的方法，所述方法包括：
(a)将干酶粉分散在熔融蜡中以提供酶-蜡悬浮液；
(b)使所述酶-蜡悬浮液雾化以形成离散液滴；以及
(c)冷却、凝固并收集酶-蜡颗粒。
25.在段落24所述的方法的一些实施例中，所得酶-蜡颗粒是根据段落1-23中任一项所述的颗粒。
26.在另一方面，提供了一种用于改善家禽或猪生长的方法，所述方法包括将根据段落1-23中任一项所述的颗粒引入所述动物的饲粮(diet)中，以及测量相对于未用此种颗粒处理的对照动物的生长改善。
从说明书和附图中，所述组合物和方法的这些及其他方面和实施例将是清楚的。
附图说明
图1示出了商业硬脂酸的DSC热分析图，表明ECR(40,140)＝99.69％。
图2示出了商业费-托蜡(Sasolwax C 105)的DSC热分析图，表明ECR(40,140)为45.94％。
图3示出了商业聚乙烯均聚物蜡(Honeywell A-
图4示出了商业硬脂酸锌(
图5示出了商业聚乙烯均聚物蜡(POLYWAXTM2000)的DSC热分析图，表明ECR(40,140)为6.07％。
图6是用于生产酶细粒的旋转式圆盘雾化设置的示意图。所示出的酶有效载荷和温度值是示例性的。
图7是示出在饲料植酸酶生物功效研究中测量的胫骨骺灰分(epiphyseal tibiaash)的变化的图。测试植酸酶细粒是聚乙烯蜡微包封的植酸酶细粒P75.1M和P75.4M。商业Danisco
图8是示出使用与图7相同的细粒在饲料植酸酶生物功效研究中测量的整个胫骨灰分的变化的图。
图9是示出使用与图7相同的细粒在饲料植酸酶生物功效研究中测量的趾骨灰分(toe ash)的变化的图。
图10是示出使用与图7相同的细粒在饲料植酸酶生物功效研究中测量的胫骨骺灰分的变化的图。
图11是示出使用与图7相同的细粒在饲料植酸酶生物功效研究中测量的整个胫骨灰分的变化的图。
图12是示出使用与图7相同的细粒在饲料植酸酶生物功效研究中测量的趾骨灰分的变化的图。
图13是示出在饲料植酸酶生物功效研究中测量的胫骨骺灰分的变化的图。测试植酸酶细粒是聚乙烯蜡微包封的植酸酶细粒P75.1M和P96.5。商业Danisco
图14是示出使用与图13相同的细粒在饲料植酸酶生物功效研究中测量的整个胫骨灰分的变化的图。
图15是示出使用与图13相同的细粒在生物功效研究中随测量的进料植酸酶活性的趾骨灰分的变化的图。
图16是示出使用与图7相同的细粒在饲料植酸酶生物功效研究中测量的P的表观全消化道消化率％(ATTD P％)的变化的图。
具体实施方式
I.引言-耐热蜡基质颗粒
本发明的组合物和方法涉及通过将酶包封在包含高熔点蜡基质的颗粒内来保护酶抵抗在高温和高湿条件下的失活。所得耐热蜡基质颗粒(本文称为“TRWMP”)是不含涂层的、基本球形的微粒，所述微粒的平均直径小于约500微米，并且以大于5％w/w的有效载荷含有活性酶。在一些实施例中，被包封的酶在典型的动物饲料造粒过程中在暴露于95℃的温度持续30秒时保留原始酶活性的70％，并且当掺入动物饲料中时可以提供可接受的酶生物利用度。在一些实施例中，所述颗粒在食品、动物饲料和其他农业应用中提供可接受的酶生物利用度。
II.定义和缩写
如本文使用的，“蜡”被定义为任何烃、脂肪酸、脂肪醇、或其盐或酯，其不溶于水但可溶于非极性有机溶剂。在欧洲由Deutsche Gesellschaft für Fettwissenschaft(DGF，德国脂肪科学协会(German Association for Fat Science))已经制定了蜡的综合性定义。根据此定义，蜡(i)具有高于40℃的滴落点或熔点。(ii)熔融而不分解；(iii)在高于熔点的10℃下具有不超过10,000mPa·s的熔体粘度；(iv)在粘度方面展现出强的负温度依赖性并且在高于熔点下不趋向于拉丝性(stringiness)；(v)在微小压力下可擦光(polishable)并且具有强的温度依赖的稠度和溶解度；(vi)在20℃下是可捏合或难碎、粗糙至精细结晶、透明至不透明(但不是玻璃状的)、或高度粘性的或液体的，(vii)在50℃与90℃之间熔融(如本发明的组合物和方法中使用的特定蜡，在高达200℃的温度下熔融)，并且形成糊状物或凝胶，并且是热和电的不良导体(即，它们是热和电绝缘体)。
如果蜡在去离子水中的平衡溶解度小于0.1％w/w，则其被认为是“水不溶性”。不是水不溶性的蜡在本文中被认为是“水溶性的”。
如果蜡具有低于100℃的峰值最大熔点，则其被认为是“低熔点的”。
如果蜡具有等于或高于100℃、优选高于110℃、并且更优选高于120℃的峰值最大熔点，则其被认为是“高熔点的”。
如本文使用的，“基质”是围绕不连续分散的固体的连续固相。基质可以是无孔的或多孔的。如果基质具有包含开放空隙空间或在接触或浸入水或水溶液时可以至少部分溶解或分散的材料的通道或孔以便允许水渗透、溶解并萃取基质内的分散固体，则所述基质是“多孔的”，。
如本文使用的，“赋形剂”是产品的非活性组分，其在不影响产品的活性或效力的情况下增强了产品特性，例如，处理、生产或储存稳定性。尽管在功效方面非活性，但是赋形剂提供了允许酶被有效地递送到目标应用的有益的特征。
赋形剂的实例是用于稀释活性组分以调节效力或降低配制品成本的“填料”，促进配制品组分的内聚和或增加细粒的整体物理强度的“粘合剂”，在与水接触时膨胀、有助于从配制品中释放出活性物质的“崩解剂”，促进颗粒间摩擦和粉末流过加工设备的“助流剂”，减少配制品组分与加工设备之间的摩擦和粘附性的“润滑剂”，通过充当稳定助剂防止或限制酶活性损失的“防腐剂”(例如，水分消除剂(moisture sink)、自由基清除剂)，和优先吸收水分以保护细粒的酶组分的“吸收剂”。
如本文使用的，术语“生物利用度”是指当动物摄入含有包封的酶的动物饲料产品时，对于动物肠道的包封的酶的可用性。在一些实施例中，术语“生物利用度”是指在清洁应用，如衣物、餐具或硬表面清洁中，对于污垢清洁介质的包封的酶的可用性。
使用以下缩写：
％w/w 重量百分比
AUC 热流量曲线下的面积
ATTD表观全消化道消化率
avail 可获得的
avg 平均值
AvP 可获得的磷
BW体重
Ca钙
cm厘米
CP粗蛋白
Cys 半胱氨酸
d10累积体积-尺寸分布曲线上的10％的颗粒的直径
d50累积体积-尺寸分布曲线上的50％的颗粒的直径
d90累积体积-尺寸分布曲线上的90％的颗粒的直径
dia 直径
DSC 差示扫描量热法
dT/dt 扫描速率
ECR 焓变比
F-T 费-托
FTU 植酸酶活性单位
g 克
h 小时
ISO 国际标准化组织
kcal千卡
kg千克
L 升
Lys 赖氨酸
m 米
m.p.熔点
m3立方米
Met 甲硫氨酸
Mi聚合物i的分子量
min 分钟
min 分钟
ml毫升
mol 摩尔
mm毫米
Mn数均分子量
mPa 毫帕斯卡
Mw质均分子量
n 数目
NC阴性对照
Ni具有分子量Mi的聚合物的摩尔数
nm纳米
nPP 非植酸磷酸盐(non-phytate phosphate)
℃摄氏度
PE聚乙烯
Pin 磷的总摄入量
Pfo)磷的总粪便排出量
Px、Px.x 申请人的内部配制品标识符
rpm 每分钟转数
s 秒
std dev 标准偏差
T 温度
t 时间
Trp 色氨酸
vits/TEs维生素和微量元素
wt/wt 重量/重量
@ 在……下
μm微米
μmol微摩尔
III.适用于制备TRWMP的蜡
适用于本发明的组合物和方法的蜡可以是天然存在的，并且可以衍生自非化石生物来源，并且包括但不限于：动物蜡，如蜂蜡、甘达蜂蜡、虫胶蜡、虫白蜡(Chinese insectwax)、羊毛蜡；植物蜡，如巴西棕榈蜡、小烛树蜡、小冠巴西棕蜡、甘蔗蜡、阿根廷波尼西亚灌木蜡(Retamo wax)和霍霍巴蜡；动物和植物脂肪衍生的长链线性伯羧酸，如肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸；脂肪酸衍生物的混合物；脂肪酸盐，如硬脂酸铝、硬脂酸钙、硬脂酸镁和硬脂酸锌，山萮酸锌和月桂酸锌；以及植物化石蜡，如褐煤蜡；或者它们可以衍生自石油，如粗晶蜡(石蜡)和微晶蜡(微蜡)，或者作为小分子(如亚乙基双-硬脂酰胺)或作为大分子合成的，即由单体子单元化学聚合的，如费-托蜡或聚烯烃蜡(包括聚乙烯蜡、聚丙烯蜡及其衍生物)。
长链羧酸的商业实例是脂肪酸衍生物，如
可商购的金属硬脂酸盐的实例包括三/二硬脂酸铝，如
山萮酸锌和月桂酸锌的商业实例分别包括
亚乙基双-硬脂酰胺的商业实例包括
费-托蜡以不同的商品名可商购，包括Ceraflour(美国的毕克公司(BYK USA))，
聚乙烯蜡以几种不同的商品名销售，包括
氧化的聚乙烯蜡以多种商品名可商购，包括
聚丙烯蜡以几种不同的商品名销售，包括HI-WAXTM(三井化学公司)和
在某些实施例中，TRWMP可以包含天然的、生物基或合成树脂，包括但不限于松香树脂、聚萜烯树脂和达玛树脂。
松香树脂基于自然资源，例如可再生的松树残干材(stumpwood)。精制和改性的木松香可通过皮诺瓦公司(Pinova，Inc.)以多种商品名可商购的，包括
聚萜烯树脂基于天然和可再生原料，包括聚(α-蒎烯)、聚(β-蒎烯)、聚(d-柠檬烯)及其混合物。聚萜烯树脂的商业实例包括由皮诺瓦公司以几种商品名提供的那些，包括
达玛树脂是来自贝壳杉属物种(Agathis spp.)、坡垒属物种(Hopea spp.)、和/或娑罗双属物种(Shorea spp)的栽培树的干渗出物。它由酸性和中性三萜类化合物树脂与多糖材料一起的复杂混合物组成。许多三萜烯是低分子量化合物，如达玛烷、达玛脂酸(dammarenolic acid)、齐墩果烷、齐墩果酸等，但达玛树脂还含有由聚杜松烯构成的聚合物级分。
合适的蜡包括具有峰值最大熔点，即高于100℃、优选高于110℃、并更优选高于120℃的那些。与小分子不同，聚合物蜡的分子量不是一个唯一的值。相反，给定的聚合物通常展现出多分散性，即分子量分布，其取决于制造聚合物的方式。分子量的分布通常由平均分子量呈现。聚合物特性如熔点是分子量分布的函数，并且因此取决于平均分子量。数均分子量(Mn)和质均分子量(Mw)由以下方程定义：
其中Ni是具有分子量Mi的聚合物的摩尔数。
适用于本发明的组合物和方法的聚合物蜡应该具有在1000与5000Da(g/mol)之间、优选在1,800与4,800Da之间、并且更优选在2000与3000Da之间的质均分子量(Mw)。本发明的聚合物蜡应该具有窄的分子量分布，其中多分散性指数(Mw/Mn)小于3、优选小于2、更优选小于1.5、并且最优选小于1.2。
适用于本发明的组合物和方法的蜡还具有合适的如下定义的焓变比(ECR)：
ECR(t0,tf)＝100％×AUC(t0,100)/AUC(t0,t)
其中t0和tf是差示扫描量热法(即DSC热分析图)期间的初始和最终扫描温度，并且AUC是DSC热分析图曲线下方的面积。
例如，ECR(40,140)是100％乘以40℃与100℃之间的DSC热分析图下方的面积与40℃与140℃之间的DSC热分析图下方的面积的比率：ECR(40,140)＝100％×AUC(40,100)/AUC(40,140)。
ECR可以用作用于对不同蜡材料针对其在高温过程中(如动物饲料造粒中)的潜在保护有效性进行比较的度量。更具体地，ECR(40,140)可以用作蜡产品中低熔点烃(m.p.<100℃)的浓度的指标；蜡产品中低熔点烃的较低量对应于较小的ECR(40,140)值。适用于本发明的组合物和方法的蜡的特征可以为具有小于20％、优选小于15％、并且更优选小于10％的ECR(40,140)的那些。
本发明的实例说明了用于使用由使用差示扫描量热法(DSC)表征的费-托(F-T)蜡、聚乙烯(PE)蜡、硬脂酸锌和硬脂酸确定ECR的方法。
为了方便起见，本发明的颗粒的特性总结在表1中。
表1.本发明的颗粒的特性
IV.适用于包封在TRWMP中的酶
本发明的组合物和方法可应用于许多不同的酶。示例性酶包括酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、过加氧酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其组合。
植酸酶的实例包括但不限于来自大肠杆菌(Escherichia coli)、布丘氏菌属物种(Buttiauxella sp.)、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)、隔孢伏革菌(Peniophoralycii)和黑曲霉(Aspergillus niger)的那些。在一些实施例中，蛋白酶是
蛋白酶的实例包括但不限于枯草杆菌蛋白酶，如衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)的那些(例如枯草杆菌蛋白酶、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)，包括如描述于例如美国专利号RE34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936、以及6,482,628中的变体，所述专利全部通过引用并入本文。额外的蛋白酶包括胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270中的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施例中，蛋白酶是
蛋白酶包括中性金属蛋白酶，包括描述于WO 07/044993和WO09/058661中的那些。其他示例性金属蛋白酶包括在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达的重组形式的中性金属蛋白酶nprE(参见例如WO 07/044993)和来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacients)的纯化的中性金属蛋白酶PMN。
脂肪酶包括但不限于绵毛状腐质菌(Humicola lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP258 068和EP 305 216)；米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238 023)；假丝酵母属(Candida)脂肪酶，如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如，EP 214 761)；假单胞菌属脂肪酶，如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP218 272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331 376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB1,372,034)；萤光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等人(1993)Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260)；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂肪酶(参见例如，JP 64/744992)；和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂肪酶(参见例如，WO 91/16422))。
额外的脂肪酶包括卡门柏青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(Yamaguchi等人(1991)Gene[基因]103:61-67)、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见，Schimada等人(1989)J.Biochem.[生化杂志]106:383-388)以及各种根霉属脂肪酶(如戴尔根霉(R.delemar)脂肪酶(Hass等人(1991)Gene[基因]109:117-113)、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人.(1992)Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学,生物技术与生物化学]56:716-719)和米根霉(R.oryzae)脂肪酶)。额外的脂肪酶是衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和衍生自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(WO 90/09446)。各种脂肪酶描述于WO 11/111143、WO10/065455、WO 11/084412、WO 10/107560、WO 11/084417、WO 11/084599、WO11/150157、以及WO 13/033318中。在一些实施例中，脂肪酶是M1LIPASETM、LUMA FASTTM、和LIPOMAXTM(杜邦工业生物科学公司)；
淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的、或甚至哺乳动物来源的那些。许多合适的描述于W0 9510603、WO 9526397、WO 9623874、WO9623873、WO 9741213、WO 9919467、WO0060060、WO 0029560、WO 9923211、WO 9946399、WO 0060058、WO 0060059、WO 9942567、WO0114532、WO 02092797、WO 0166712、WO 0188107、WO 0196537、WO 0210355、WO 9402597、WO0231124、WO 9943793、WO 9943794、WO 2004113551、WO 2005001064、WO 2005003311、WO0164852、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO 2006012899、WO2008092919、WO 2008000825、WO 2005018336、WO 2005066338、WO 2009140504、WO2005019443、WO 2010091221、WO 2010088447、WO 0134784、WO 2006012902、WO2006031554、WO 2006136161、WO 2008101894、WO 2010059413、WO 2011098531、WO2011080352、WO 2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO 2011082429、WO2011076123、WO 2011087836、WO 2011076897、WO 94183314、WO 9535382、WO 9909183、WO9826078、WO 9902702、WO 9743424、WO 9929876、WO 9100353、WO 9605295、WO 9630481、WO9710342、WO 2008088493、WO 2009149419、WO 2009061381、WO 2009100102、WO2010104675、WO 2010117511、WO 2010115021、WO 2013184577、WO 9418314、WO2008112459、WO 2013063460、WO 10115028、WO2009061380、WO 2009100102、WO2014099523、WO 2015077126A1、WO 2013184577、WO 2014164777、PCT/US 12/70334、PCT/US13/74282、PCT/CN 2013/077294、PCT/CN 2013/077134、PCT/CN 2013/077137、PCT/CN2013/077142、PCT/CN 2012/087135、PCT/US 12/62209、PCT/CN2013/084808、PCT/CN 2013/084809、和PCT/US 14/23458中。可商购的淀粉酶包括但不限于
纤维素酶包括但不限于具有颜色护理益处的那些(参见例如EP 0495 257)。实例包括特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(参见例如美国专利号4,435,307)、以及可商购的纤维素酶，如
甘露聚糖酶描述于美国专利号6,566,114、6,602,842、5,476和775、6,440,991、以及美国专利申请号61/739267，所有专利全部通过引用并入本文)。可商购的包括但不限于
在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本传授内容的组合物中。在一些替代性实施例中，氧化酶与氧组合使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)，优选与增效剂一起使用(参见例如WO 94/12621和WO95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。在一些实施例中包括化学或遗传修饰的突变体。
过水解酶包括来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酶。此种酶、其酶促特性、其结构、以及其许多变体和同源物详细地描述于国际专利申请公开WO 05/056782A和WO 08/063400 A、以及美国专利公开US 2008145353和US 2007167344中，所述专利通过引用并入。
在一些实施例中，耻垢分枝杆菌过水解酶、或同源物包括S54V取代。
其他过水解酶包括碳水化合物家族酯酶家族7(CE-7家族)的成员，描述于例如WO2007/070609和美国专利申请公开号2008/0176299、2008/176783、和2009/0005590中。CE-7家族的成员包括头孢菌素C脱乙酰酶(CAH；E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共享保守的签名基序(Vincent等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],330:593-606(2003))。
其他过水解酶包括来自苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、牛莫拉氏菌(Moraxella bovis)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、或突柄杆菌dejongeii(Prosthecobacter dejongeii)(WO2005056782)、门多萨假单胞菌(美国专利号5,389,536)、或恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(美国专利号5,030,240和5,108,457)的那些。
V.TRWMP的制备
包封过程需要首先提供呈基本上干燥形式的作为粉末的酶。例如，可以将酶从水溶液或悬浮液中喷雾干燥，或通过将盐、有机溶剂或聚合物添加到酶溶液中作为沉淀物分离。如果所得粉末沉淀物含有水，则其应该被进一步干燥以便减少水含量或水活性。酶粉末的残留水含量，包括游离水和结合水，应该小于6％、优选小于5％，并且更优选小于4％。所述酶粉末的水活性(Aw)应该小于0.3、优选小于0.2、并且更优选小于0.1。
喷雾干燥的酶粉末或沉淀物可以进一步通过干法或湿法制粒，如附聚、压实或与其他干材料(包括非酶非活性赋形剂)共混而加工。在一些实施例中，酶溶液可以包含酶浓缩物和任选添加的赋形剂的混合物。所述混合物可以进一步通过方法，如喷雾附聚、喷雾制粒、低或高剪切制粒、转鼓制粒等而加工或制粒。
然后将如上所述的单独或进一步混合的、加工或制粒的干燥酶连同任选的水溶性或水不溶性填料、成孔剂、缓冲剂、稳定剂、溶胀剂、崩解剂或其他赋形剂包封在多孔蜡基质(在本文中详细地描述)中。如所述的，基质中的蜡应该是水不溶性的，优选地具有至少110℃的起始熔点和至少120℃的峰值最大熔点，并且优选地具有低熔体粘度，即，在高于其熔点的25℃内的温度下小于约500厘泊。
蜡基质中的填料可以包括无机盐(如硫酸钠或碳酸钙)、有机酸或其盐、粘土、矿物质(如铝硅酸盐、硅藻土、滑石)、颜料(如二氧化钛)、单糖或二糖(如果糖、半乳糖和葡萄糖或乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖)、糖醇(如山梨糖醇或甘油)、环糊精和多糖(如淀粉和麦芽糖糊精或纤维素粉末或胶(如黄原胶或海藻酸钠))。
在一些实施例中，蜡基质包括任选的水溶性或水不溶性填料、成孔剂、缓冲剂、稳定剂、溶胀剂、崩解剂、降解增强添加剂或其他赋形剂。所述降解增强添加剂可以通过不同途径，包括光降解、热降解、氧化生物降解、经由生物膜形成的生物降解或其组合而促进蜡降解。氧化生物降解添加剂技术的实例是
为了将酶包封在蜡基质中，必须首先将蜡加热直至熔融。酶粉末连同任何其他赋形剂分散在熔融蜡内。酶可以在任何赋形剂之前、之后或与其同时添加。固液分散可以在搅拌槽容器中分批或补料分批进行，或在在线混合器中连续进行。一旦酶充分分散以在熔融蜡中形成悬浮液，则将蜡悬浮液雾化成颗粒。例如，可以将熔融悬浮液流挤出或泵送到旋转式圆盘雾化器上。通过旋转式圆盘雾化形成微囊体颗粒描述于例如美国专利号3,015,128、4,256,677和6,001,387中。可替代地，蜡微囊体可以通过其他雾化方法形成，如离心挤出(参见例如美国专利号4,386,895)、振动喷嘴雾化(参见例如WO 2012/098239)或喷射切割(参见例如DE 4,424,998和美国专利号6,467,699)，然后冷却以凝固颗粒并收集凝固的颗粒。
在旋转式圆盘雾化中，考虑到圆盘直径、悬浮液的流速以及熔融悬浮液的粘度和表面张力，可以通过调节雾化圆盘的旋转速度来控制最终颗粒的平均粒度和粒度分布。对于给定的圆盘装置，通过增加圆盘的旋转速度、降低熔融悬浮液的进料速率和/或降低熔融悬浮液的粘度和表面张力来减小粒度。
为了生产较小的良好成形的微粒，优选的是使用具有低熔体粘度的熔融悬浮液。例如，为了生产小于500微米的微粒，希望的是使用在高于蜡熔融温度的25℃内的温度下具有小于500厘泊的熔体粘度的蜡。
VI.TRWMP的特性
所得TRWMP是不含涂层的、基本球形的微粒，所述微粒的平均直径小于约500微米，并且以大于5％w/w的有效载荷含有活性酶。蜡基质的特定特性在本文中详细地描述。
在一些实施例中，在典型的动物饲料造粒过程中在暴露于95℃的温度持续30秒后，包封的酶保留原始酶活性的至少70％、优选至少80％、并且更优选至少90％或更多。通过对进入细粒生产的酶的活性与最终TRWMP中的活性量进行比较容易地测量活性保留。鉴于本说明书，本发明的组合物和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员将是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述组合物和方法。
实例
实例1.聚合物蜡和非聚合物蜡的热分析
商业费-托蜡、聚乙烯蜡、硬脂酸锌和硬脂酸的热分析是在TA仪器公司(TAInstruments)DSC Q2000热分析仪上在氮气气氛中通过差示扫描量热法(DSC)进行的。
将F-T和PE蜡的样品以10℃ min-1的加热速率从20℃加热至180℃，并在第一次扫描中以相同的速率冷却至20℃。然后将它们以2℃ min-1的加热速率加热至180℃，并在第二次扫描中以相同的速率冷却至20℃。将硬脂酸锌和硬脂酸锌的样品以10℃ min-1的加热速率从20℃加热至160℃，并在第一次扫描中以相同的速率冷却至20℃。然后将它们以5℃min-1的加热速率加热至160℃，并在第二次扫描中以相同的速率冷却至20℃。由第二次扫描的加热循环确定热特性，如起始熔点、最大峰值和热流量曲线(W/g对比℃)下方的面积。热流量曲线下方的面积(AUC)与在DSC扫描的初始温度与最终温度之间的加热过程的样品的总焓变成比例。焓变随时间(t)、温度(T)或扫描速率(dT/dt)的变化取决于蜡的分子质量均匀度。
包括起始熔点、最大峰值和40℃与140℃之间的焓变比(ECR(40,140))的DSC热分析图示于图1-5中。适用于本发明的组合物和方法的蜡是具有小于20％、优选小于15％、并且更优选小于10％的ECR(40,140)的那些。优选的蜡具有分别高于100℃和120℃的起始熔点和最大峰值点。
实例2.用喷雾干燥制备酶粉末
此实例提供了用于用喷雾干燥法生产酶粉末的材料和方法的一般描述。喷雾干燥的酶粉末是通过在配备有以并流模式配置的旋转雾化器的Niro P-6.3喷雾干燥器(丹麦索堡的基伊埃工程技术公司(GEA Process Engineering A/S,
表2.用于生产酶粉末的典型喷雾干燥工艺条件
通过激光衍射方法分析酶粉末的粒度分布。分别对应于累积体积-尺寸分布曲线上的10％、50％和90％点的d10、d50(中值)和d90的特征粒度位于窄范围内。对于以下实例4-7中列出的植酸酶粉末样品，d10范围为11-14μm，d50范围为25-39μm，并且d90范围为53-105μm。
实例3.用热熔旋转式圆盘雾化生产酶细粒
如在图6中所示的实验室设置中，通过使用旋转式圆盘雾化器生产有待在以下实例中描述的酶细粒。首先在玻璃容器中将蜡物质(可熔融的载体)加热至熔融。进一步将熔融蜡加热并维持在高于熔点的15℃-30℃下。将非活性成分以及然后如实例2中所述生产的活性喷雾干燥的酶粉末分散在熔融蜡中，同时手动搅拌。非活性成分选自填料、粘合剂、稳定剂、崩解剂、表面活性剂、渗透压剂(osmolality agent)、pH改性剂及其混合物。表3提供了示例性非活性赋形剂，其制造商/供应商和其用于示例性组合物中的熔点的清单。
表3.示例性非活性赋形剂清单
通过使用高剪切均质器将熔融分散体均质化以确保获得一致的无块的分散体。然后将熔融分散体手动地或使用蠕动泵以稳定的速率分配到加热的旋转式不锈钢圆盘(10cm直径)上进行雾化。圆盘安装在高于地面约4.6米处，并使用液压泵以约1500至6500rpm操作。通过雾化形成的精细熔体液滴在室温下凝固成颗粒。将颗粒手动收集并在室温下保存在密封的塑料容器中。
整个熔体加工时间小于2.5-5min，包括混合材料和进料旋转式圆盘。熔体配制品的雾化在正常的环境室条件下在约80立方米的封闭室中进行。
实例4.用热熔旋转式圆盘雾化生产由喷雾干燥的酶粉末和低熔点蜡为基质材料构成的植酸酶细粒
以下是使用不满足如实例10中所述的造粒稳定性要求的低熔点载体制造的酶配制品的对比实例。
用实例3中所述的旋转式圆盘雾化方法生产植酸酶细粒配制品。热熔组合物通过将如实例1所述制备的喷雾干燥的植酸酶粉末和碳酸钙添加到熔融蜡中来制备。加工时间近似为5min，包括混合材料并将熔体制剂分配到旋转式圆盘上。通过雾化形成的精细熔体液滴在室温下迅速凝固成颗粒。将颗粒收集并储存在密封的塑料容器中。表4提供了植酸酶细粒配制品的组成。由于硬脂酸盐溶于熔融的硬脂酸中，所以在90℃-110℃下制备含有硬脂酸钙和硬脂酸钠的熔体组合物。
表4.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶和低熔点蜡细粒的组成(％w/w)
实例5.用热熔旋转式圆盘雾化生产由喷雾干燥的酶粉末和高熔点蜡为基质材料构成的植酸酶细粒
以下是具有高熔点载体的酶配制品的实例，所述配制品根据其ECR值满足如实例11中所述的造粒稳定性要求。
用实例3中所述的旋转式圆盘雾化方法生产植酸酶细粒配制品。热熔组合物通过将如实例1所述制备的喷雾干燥的植酸酶粉末和碳酸钙添加到在约152℃下的熔融蜡中来制备。加工时间小于2.5min，包括混合材料并将熔体制剂分配到旋转式圆盘上。通过雾化形成的精细熔体液滴在室温下迅速凝固成颗粒。将颗粒收集并储存在密封的塑料容器中。表5提供了植酸酶细粒配制品的组成。
表5.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶和高熔点蜡细粒的组成(％w/w)
实例6.用热熔旋转式圆盘雾化生产由喷雾干燥的酶粉末以及(低熔点)硬脂酸和(高熔点)硬脂酸锌为基质材料构成的植酸酶细粒以下是如国际专利申请WO 03056934 A2(指定给嘉吉公司(Cargill)，标题为“encapsulation by coating with a mixture oflipids and hydrophobic,high melting point compounds[通过用脂质和疏水的高熔点化合物的混合物涂覆来包封]”)的实例5中所述的酶配制品的对比实例，表明这些较早的配制品不满足本发明的造粒稳定性。
用实例3中所述的旋转式圆盘雾化方法生产植酸酶细粒配制品。硬脂酸(m.p.73℃)和
表6.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶细粒的组成(％w/w)
实例7.用热熔旋转式圆盘雾化生产由喷雾干燥的酶粉末以及硬脂酸锌和聚萜烯树脂作为高熔点基质材料构成的植酸酶细粒
用实例3中所述的旋转式圆盘雾化方法生产植酸酶细粒配制品。
表7.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶细粒的组成(％w/w)
实例8.用于蒸汽调节含有酶细粒的动物饲料的程序
在具有300kg/h的标称造粒能力的微型饲料研磨设备中评估酶细粒的热稳定性。在不同的受控温度(例如90℃和95℃)下进行调节。对于所有配制品，饲料混合物的生产、混合技术、静置时间、容量和冷却时间都相同。仅变化在级联混合器中酶的添加和蒸汽的添加以达到所希望的调节温度。
饲料研磨机由以下项组成：卧式混合器，其具有700L的体积容量和80-300kg的混合容量，以48rpm的速度运行；可调速的Skjold TR类型的定量给料螺杆(用于排空混合器并用于定量给料饲料)；KAHL类型的级联混合器，130cm x 30cm-长x直径，具有37个可调节的托盘，以155rpm的速度运行(在所述级联混合器中的停留时间基于300kg/h的生产速率估计近似为30秒)；收集歧管，其安装在级联混合器的一侧，具有排水器和3个蒸汽阀，从所述蒸汽阀中将蒸汽添加到饲料中；以及具有400千克蒸汽/小时的最大容量的Dan Stroker类型的高压锅炉。
将蒸汽添加到饲料中，用膨胀阀控制蒸汽到级联混合器中的添加。收集歧管上的三个阀用于微调饲料中的所希望的温度。对于添加1％蒸汽，饲料的温度增加14℃。用具有Pt 100传感器的Testo 925类型的数字温度计记录粗粉(meal)的温度。传感器置于级联混合器的口处。用认可的Goldbrand/39Q9732-818类型的水银温度计校准所述温度计。
所使用的压粒机是具有7.5kW电机的Labor Monoroll类型的Simon Heesen。在3mm×35mm(孔径x通道长度)的模具的情况下，基质的内径是173mm。压机的高度和直径分别是50mm和140mm。样品在具有穿孔底部的分区冷却箱中冷却，经由具有1500m3空气/小时的容量的通风机通过所述分区冷却箱对粗粉饲料进行冷却。
饲料混合物的配制品对应于常规标准玉米饲粮，如表17所示的。在每次试验中制备足够量的饲料混合物。在研磨机和混合装置中一次性生产了这种基础混合物，并在每次试验之前将其储存在容器中。通过在70L强制式混合器中，以45rpm操作10min将给定量的酶细粒与10kg的饲料混合物共混，制备饲料“预混物”。然后在饲料研磨机的卧式混合器中将预混物添加到约110kg的饲料混合物中，并且混合10分钟以产生“试验饲料”或“粉料(mash)”。在植酸酶的情况下，将足够量的植酸酶细粒添加到预混物中，以产生5,000FTU/kg试验饲料的目标酶活性。在造粒之前从试验饲料中收集“蒸汽前”样品，并在正常环境温度下储存在有标签的容器中，直到分析酶活性。
在所有造粒试验中将具有已知植酸酶活性的参比植酸酶细粒产品(充当对照)以5,000FTU/kg试验饲料添加作为对照。
表8.造粒试验中标准玉米饲粮的组成
将试验饲料在具有模具的Simon Heesen压粒机中造粒。容量设置为300kg/h，并根据定量给料螺杆进行调整。在级联混合器中，通过蒸汽将饲料加热至90℃和95℃的目标出口(或排出)温度。蒸汽量通过减压阀和歧管调节。收集“蒸汽后”样品作为近似0.5kg的子样品，在粒料已经离开压粒机之后10-15秒立即将其移出并置于冷却箱中。对于每个温度水平，在造粒8-10min之后建立操作时，获取第一个子样品。在1-1.5min的时间段内收集子样品，其对应于5-7.5kg的粒化饲料。将所有样品充气并在环境温度下冷却15分钟，这确保从粒料中除去剩余的热量。将蒸汽后样品在正常环境温度下储存在标记的容器中，直到分析酶活性。
在研磨机和混合装置中生产粗粉混合物之前，清洁掉饲料研磨机中的饲料残留物，并将混合器进行真空清洁。在每次试验之前和之后清洁微型饲料研磨机。对混合器和定量给料设备进行真空清洁，并且级联混合器是自排空的。每次试验之后，将用于预混物的小型混合器和冷却箱彻底清洁。
实例9.饲料样品的植酸酶活性分析
开发了内部分析方法，以便准确分析动物饲料中和当混合到饲料中时含有植酸酶细粒的预混物中里氏木霉(T.reesei)植酸酶的活性。所述方法与协调标准方法IS0 30024:2009(即ISO 30024：动物饲料-植酸酶活性的确定(Animal feeding stuffs-Determination of Phytase Activity)，2009)非常类似，并且遵循相同的原理，即将植酸酶与植酸钠一起温育，这导致释放无机磷酸盐。当与钼酸盐-钒酸盐试剂反应时，无机磷酸盐产生黄色络合物。所述黄色络合物的光学密度在415nm的波长下测量。颜色形成的程度可以与酶活性直接相关。活性的定量通过绝对方法使用磷酸盐标准校准曲线进行。
此方法是根据ISO 9001(即ISO 9001：2008质量管理体系(Quality ManagementSystems))和良好实验室规范(Good Laboratory Practice)中陈述的原理开发的，并已根据ISO 78-2：1999(即ISO 78-2：化学-标准的格式-第2部分：化学分析方法(Chemistry-Layouts for standards-Part 2:Methods of Chemical Analysis)，1999年)中给出的规则进行编写。
植酸酶活性单位(FTU)定义为在pH 5.5和37℃下每分钟从植酸钠底物中释放1μmol的无机正磷酸盐的酶的量。具有已知植酸酶活性(5,000FTU/kg)的研磨的饲料样品用作对照。
实例10.颗粒状植酸酶对含有由低熔点蜡为基质材料制成的植酸酶细粒的动物饲料的蒸汽调节的热稳定性
以下是对比实例，说明实例4中所述的具有低熔点载体的酶配制品不满足本发明的造粒稳定性要求。
根据实例8和9中所述的程序，在动物饲料造粒试验中评估了实例4的植酸酶细粒。测试配制品的粒度范围在表9中示出。
表9.在造粒试验中评估的植酸酶细粒配制品的粒度分布(％w/w)
在用蒸汽加工之前的饲料粉料中测量的植酸酶细粒配制品的酶活性以及用蒸汽加工之后的相对残留活性在表10中示出。在蒸汽造粒过程中，所有用低熔点蜡为基质材料制成的植酸酶配制品损失了其初始酶活性的至少85％(n＝2，avg±std dev)。
表10.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶细粒的酶活性
实例11.颗粒状植酸酶对含有由高熔点蜡为基质材料制成的植酸酶细粒的动物饲料的蒸汽调节的热稳定性
以下是说明实例5中描述的具有高熔点载体的酶配制品的实例，所述配制品满足本发明的造粒稳定性要求。根据实例9和10中所述的程序，在动物饲料造粒试验中评估了实例5的植酸酶细粒。测试配制品的粒度范围在表11中示出。
表11.在造粒试验中评估的植酸酶细粒配制品的粒度范围(％wt/wt)
在用蒸汽加工之前的饲料粉料中测量的植酸酶细粒配制品的酶活性以及用蒸汽加工之后的相对残留活性在表12中示出。在蒸汽造粒过程中，所有用高熔点蜡为基质材料制成的植酸酶配制品保留了其初始酶活性的至少50％。在95℃下造粒之后，由具有6.1％的ECR(40,140)的高熔点蜡制成的优选组合物维持其初始活性的至少85％(n＝2，avg±stddev)。
表12.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶细粒的酶活性
实例12.颗粒状植酸酶对含有由硬脂酸和硬脂酸锌、硬脂酸锌、以及硬脂酸锌和聚萜烯树脂制成的植酸酶细粒的动物饲料的蒸汽调节的热稳定性
以下是说明如根据实例8和9所述的程序在动物饲料造粒试验中评估的实例6和7的植酸酶细粒的性能的实例。测试配制品的粒度范围在表13中示出。
表13.在造粒试验中评估的植酸酶细粒配制品的粒度分布(％wt/wt)
在用蒸汽加工之前的饲料粉料中测量的植酸酶细粒配制品的酶活性以及用蒸汽加工之后的相对残留活性在表14中示出。含有低熔点硬脂酸的植酸酶配制品P166.4(如WO03056934 A2中所述)在造粒过程期间损失了其所有初始酶活性。与仅用硬脂酸锌为基质材料制成的配制品P166.1相比，用高熔点硬脂酸锌和
表14.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶细粒的酶活性
实例13和14描述了在肉仔鸡和猪上进行的生物利用度研究，以评估与商业产品相比的本发明植酸酶细粒配制品的生物功效。
实例13：聚乙烯蜡微包封的植酸酶细粒在肉仔鸡中的生物功效
进行了三种单独的体内研究(“A”、“B”和“C”)以评估并比较植酸酶细粒配制品的生物功效，所述植酸酶细粒配制品是用如实例3所述的热熔旋转式圆盘雾化生产的。三种配制品P75.1M和P75.4M、P96.5由微包封在聚乙烯(PE)均聚物蜡POLYWAXTM2000中的喷雾干燥的植酸酶组成(表15)。将PE蜡微包封的植酸酶细粒的生物功效与商业Danisco
表15.用热熔旋转式圆盘雾化生产的植酸酶细粒的组成(％w/w)
表16.研究A和B的实验设计
表17.研究C的实验设计
在所有研究中均使用了一天龄的Ross 708雄性肉仔鸡。在研究开始时，根据通过分区进行的各自的处理，将8只禽随机分配到层架式笼子中。仅选择健康的禽用于实验，并且在整个研究过程中没有禽被更换。
在研究开始时(第0天)、第7天和研究终止时(第14天)记录禽重量。笼子是实验单位。饲粮以粉料形式饲喂，并且配制成符合或超过NRC(国家研究委员会)标准，除了Ca和AvP外(表18)。使用Davis S-20混合器(美国堪萨斯州邦纳斯普林斯的H.C.Davis Sons制造公司(H.C.Davis Sons Manufacturing Co.,Bonner Springs,KS,USA))混合所有饲料。在每次处理之间冲洗混合器以防止口粮之间的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每个处理饲粮中收集样品，并且一起切碎用于分析饲料中的酶活性。
所有的禽都饲喂玉米大豆基础口粮直到第7天；从第7天起饲喂处理口粮。在饲料更换时，将喂食器从笼子中移出、反向称重、清空、并用适当的处理饲粮重新填充。在研究的最后一天，称重饲料。
表18.饲粮配制品
在研究终止时，选择六只禽/笼(两只平均体重的禽，两只低于平均体重的禽和两只高于平均体重的禽)进行骨灰分测量。移除每只禽的右胫骨。将骨在100℃下干燥过夜，分成三个相等的部分，将两个末端部分(骨骺)一起称重，并将中间部分在单独的坩埚中称重，然后在马弗炉中于600℃下将骨灰化持续16小时。然后将灰分表示为基于铰孔灰分(reaming ash)的重量的百分比(作为干骨重量的比例)。将骨骺灰分和中骨灰分加在一起，以使能够计算整个胫骨灰分。对于趾骨灰分测量，使用所有禽/笼子，取中趾，在第三个趾骨远端至近端分开，将趾在围栏(pen)的基础上合并，并在与具有胫骨的那些分开的坩埚中灰化。使用ANOVA分析数据，并且进行平均值分离以测试不同酶配制品与酶剂量之间的差异。将笼子用作实验单位。
图7-9分别示出了研究A中胫骨骺灰分、整个胫骨灰分和趾骨灰分随测量的进料植酸酶活性的变化。胫骨骺灰分、整个胫骨灰分和趾骨灰分获得的结果表明在本发明的配制品与商业
图10-12分别示出了研究B中胫骨骺灰分、整个胫骨灰分和趾骨灰分随测量的进料植酸酶活性的变化。胫骨骺灰分和整个胫骨灰分获得的结果表明在不同配制品之间的酶的生物利用度上存在显著差异，由此，与商业
图13-15分别示出了研究C中胫骨骺灰分、整个胫骨灰分和趾骨灰分随测量的进料植酸酶活性的变化。胫骨骺灰分、整个胫骨灰分和趾骨灰分获得的结果表明，在配制品P75.1M、P96.5与
实例14.在猪中的聚乙烯蜡微包封的植酸酶细粒的生物功效研究
进行了体内研究以评估并比较植酸酶细粒配制品P75.1M和P75.4M的生物功效，所述植酸酶细粒配制品是用热熔旋转式圆盘雾化生产的(参见实例13)。将PE蜡微包封的植酸酶细粒的生物功效与商业
将总计70头猪(16.82±1.34kg初始BW)分配至随机完全区组设计，具有7种饲粮和10头重复猪/饲粮以及两个时间段。将对照饲粮用玉米和大豆粉(SBM)配制，并且没有将植酸酶添加到这种饲粮。除饲粮中包含植酸酶外，其他六种饲粮均与对照饲粮类似(表19)。饲粮以粉料形式饲喂，并且配制成符合或超过NRC(国家研究委员会)标准，除了Ca和AvP外(表20)。
表19.研究HB1304的实验设计
表20.饲粮配制品
在每个时间段中，适应5天之后，对粪便样品在第6-12天收集，并使用总收集方法分析磷(P)。以每天能量维持需求3倍的水平饲喂猪(即197kcal ME/kg BW0.60；NRC，2012)，分为两个相等粗粉。在整个实验过程中，水始终可用。在适应时间段开始时(第0天)和各收集时间段结束时(第13天)记录猪的重量。还记录了收集时间段期间每天供应的饲料量。
粪便收集的开始和结束通过添加不易消化的标记物进行标记。在实验结束时，将粪便样品在强制空气烘箱中干燥，并在分析之前进行精细研磨。分析饲粮、成分和粪便样品中的P，并从以下方程计算P的表观全消化道消化率(ATTD)％：ATTD P(％)＝[(Pin-Pfo)/Pi]x 100，其中Pi是第6天到第12天的P的总摄入量，并且Pf是源自d 6到12消耗的饲料的P的总粪便排出量。使用ANOVA分析数据，并且进行平均值分离以测试不同酶和酶剂量之间的差异。猪用作实验单位。
如图16所示，酶对P的表观全消化道消化率％(ATTD P％)有显著影响，由此P75.4M表现出比P75.1M和商业
基于实例13和14的结果，显然的是，就所研究的生物利用度标记物而言，高熔点PE蜡组合物的性能在所有情况下都等于或大于商业
