一种组织工程皮肤的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程皮肤的制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的组织器官，是人体非特异性，免疫屏障，大面积皮肤缺损会引起严重的健康问题，甚至会威胁生命，然而大面积皮肤缺失修复一直是医学难题，常规治疗手段对患者造成极大生理和心理痛苦，而且容易造成感染、恢复速度慢、恢复疤痕不能得到控制、不能在创伤面进行有效的药物治疗。人们一直在寻找理想的皮肤替代物。
皮肤组织工程是利用生物学和工程学原理，构建出用于修复，维持和改善损伤组织功能的组织替代物，其核心是创造出一种三维生长支架，将由机体分离出的细胞进行体外复合培养，形成人工再生的真皮等同物或皮肤等同物，移植于需要修复，重建的皮肤病损出。种子细胞，支架材料以及细胞与支架材料的相互作用的方式是构建组织工程皮肤的3个基本要素。为了使组织工程皮肤更趋于真实，减少免疫排斥反应，目前针对这三方面存在的问题还有待进一步完善和解决。
发明内容
为了解决目前在制作组织工程皮肤支架材料以及细胞与支架材料的相互作用方式还存在缺陷的问题，本发明提供了一种组织工程皮肤的制备方法。本发明所述的组织工程皮肤的制备方法是利用皮肤细胞作为种子细胞进行培养扩增，以纳米静电纺丝材料作为支架，通过3D打印技术，将培养扩增的细胞打印到支架上，获得组织工程皮肤，具体步骤如下：
(1)纳米静电纺丝材料的制备
配制以N,N-二甲基甲酰胺DMF为溶剂，质量分数为10-16％的PVP纺丝液，在纺丝瓶中29-31℃，溶胀22-26小时，然后利用静电纺丝机将纺丝液加工成0.45mm-0.55mm厚的纳米静电纺丝材料；
(2)人体皮肤细胞的培养
取皮肤组织使用含抗生素的PBS缓冲液反复冲洗，剪裁至2-4cm2，置于蛋白酶液中37℃浸泡12-16h，分离表皮和真皮，将表皮置于含质量分数为1％胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化30分钟，制得表皮细胞悬液；
将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37℃下消化30分钟，制得真皮细胞悬液；
分别使用含质量浓度为1.5％牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液，将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别过滤，所得滤液离心后，获得表皮原代细胞和真皮原代细胞，将表皮原代细胞和真皮原代细胞分别接种在含胎牛血清的DMEM培养基中进行培养后传代，分别收集表皮和真皮细胞；
(3)细胞培养至纳米纤维材料上，获得组织工程皮肤
将步骤(2)获得的表皮细胞培养液和真皮细胞培养液通过3D打印机打印于步骤(1)获得的纳米静电纺丝材料上，获得组织工程皮肤。
优选的，所述静电纺丝机加工纺丝液的条件为：15-18kV电压，毛细管和收集屏之间的距离为25-30cm，加工时间为2分钟。
优选的，所述3D打印参数是利用AutoCAD软件对3D生物打印机进行编程，根据纳米纤维材料尺寸设计打印参数，打印喷嘴采用0.8-1.0mm，打印线速度为8-10厘米/min，打印厚度为1-2毫米，打印层数为两层，打印温度为37℃，打印湿度为60-70％。
优选的，还可以向步骤(1)的纺丝液中加入药物。
优选的，所述药物是青霉素、阿莫西林、阿奇霉素、罗红霉素、土霉素和四环素中的一种或多种的混合物。
优选的，所述药物是以DMF为基准计，质量分数小于3％。
优选的，步骤(1)所述的PVP纺丝液是以DMF为基准计，PVP质量分数为16％。
优选的，步骤(1)所述的溶胀温度是30℃，溶胀时间是24小时。
优选的，步骤(1)所述的电压是15kV，毛细管和收集屏之间的距离为30cm。
优选的，步骤(2)所述的过滤是采用100μm的过滤筛网进行过滤的。
有益效果
本发明所制备的纳米静电纺丝材料可以利用不同纺丝材料的组合最大限度的减少人体排斥反应，这种纺丝材料具有优良的透气性和吸水性，易于皮肤吸收，贴合皮肤好，而且可以直接在皮肤表面进行制作。由于此材料直径非常小，具有很好的小尺寸效应。在皮肤可以吸收材料的同时可以为细胞的恢复生长提供支架，减少疤痕的产生；
药物包埋的静电纺丝材料：将抗生素和抑制免疫反应的药物包埋在静电纺丝材料之中，可以解决皮肤不能大面积使用药物的问题。可以很好的控制药物浓度，方便的进行多次给药。而且可以根据实际情况进行不同药物的包埋，不同浓度的包埋，做到大面积均匀给药。
细胞培养技术，由于在体皮肤细胞生成速度非常慢，容易造成创伤面的感染等一系列问题。利用细胞培养技术可以成几何倍数增加表皮细胞数量，而且培养的细胞可以多次利用此技术作用于患者创伤面处，促进创伤面愈合；
3D打印技术：利用已培养好的细胞培养液作为生物墨汁，在药物包埋的静电纺丝材料表面进行打印，可以很好的控制细胞浓度和细胞排列，美化疤痕，加快创伤面的愈合。
附图说明
图1.不同PVP浓度下制备的纳米静电纺丝材料，A为PVP浓度为6％，B为PVP浓度为8％，C为PVP浓度为16％，D为PVP浓度为18％；
图2.不同电压下制备的纳米静电纺丝材料，A电压为12kv，B电压为16kv，C电压为20kv，D电压为22kv；
图3.毛细管和收集屏之间的距离不同时制备的纳米静电纺丝材料，A为15cm，B为20cm，C为25cm，D为28cm；
图4.有无添加药物时制备的纳米静电纺丝材料，A，B，C分别为实施例1,2，3条件下制备的纳米静电纺丝材料，D，E，F分别为实施例4,5,6条件下制备的纳米静电纺丝材料。
具体实施方式
以下实施例中所用高聚物PVP采用的是连云港荣禾新材料科技有限公司生产的产品。
实施例1.组织工程皮肤的制备方法。
本实施例所述的组织工程皮肤的制备方法是，利用皮肤细胞作为种子细胞进行培养扩增，以纳米静电纺丝材料作为支架，通过3D打印技术，将培养扩增的细胞打印到支架上，获得组织工程皮肤，具体步骤如下：
(1)纳米静电纺丝材料的制备
以DMF(N,N-二甲基甲酰胺)为溶剂，配制质量分数为16％的PVP纺丝液，在纺丝瓶中30℃，溶胀24小时，获得纺丝液；将纺丝液在静电纺丝机上，在15kV电压下，毛细管和收集屏之间的距离为30cm，加工2分钟获得0.5mm厚的纳米静电纺丝材料；
(2)人体皮肤细胞的培养
取皮肤组织使用含抗生素的PBS缓冲液反复冲洗，剪裁至3cm2，置于蛋白酶液中，37℃浸泡14h，分离表皮和真皮，将表皮置于含质量分数为1％胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化30分钟，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37℃下消化30分钟，制得真皮细胞悬液；分别使用含质量浓度为1.5％牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液，将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别采用100μm的过滤筛网过滤，对滤液在10000r/min条件下，离心10分钟，获得表皮原代细胞和真皮原代细胞，将表皮原代细胞和真皮原代细胞分别接种在含胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，培养至培养皿面积的80％-100％进行传代，收集表皮和真皮细胞；
(3)细胞培养至纳米纤维材料上，获得组织工程皮肤
将步骤(2)获得的表皮细胞培养液和真皮细胞培养液通过3D打印机打印于将步骤(1)获得的纳米静电纺丝材料上，获得组织工程皮肤，所述3D打印参数是利用AutoCAD软件对3D生物打印机进行编程，根据纳米纤维材料尺寸设计打印参数，打印喷嘴采用0.9mm，打印线速度为9厘米/min，打印厚度为1.5毫米，打印层数为两层，打印温度为37℃，打印湿度为65％。
实施例2.组织工程皮肤的制备方法。
本实施例所述的组织工程皮肤的制备方法是，利用皮肤细胞作为种子细胞进行培养扩增，以纳米静电纺丝材料作为支架，通过3D打印技术，将培养扩增的细胞打印到支架上，获得组织工程皮肤，具体步骤如下：
(1)纳米静电纺丝材料的制备
以DMF为溶剂，配制质量分数为10％的PVP纺丝液，在纺丝瓶中29℃，溶胀26小时，获得纺丝液；将纺丝液在静电纺丝机上，在16kV电压下，毛细管和收集屏之间的距离为25cm，加工2分钟获得0.45mm厚的纳米静电纺丝材料；
(2)人体皮肤细胞的培养
取皮肤组织使用含抗生素的PBS缓冲液反复冲洗，剪裁至2cm2，置于蛋白酶液中37℃浸泡12h，分离表皮和真皮，将表皮置于质量分数为1％胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化30分钟，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37℃下消化30分钟，制得真皮细胞悬液；分别使用含质量浓度为1.5％牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液，将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别过滤，对滤液在10000r/min条件下，离心10分钟，获得表皮原代细胞和真皮原代细胞，将表皮原代细胞和真皮原代细胞分别接种在含胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，培养至培养皿面积的80％-100％进行传代，收集表皮和真皮细胞；
(3)细胞培养至纳米纤维材料上，获得组织工程皮肤
将步骤(2)获得的表皮细胞培养液和真皮细胞培养液通过3D打印机打印于将步骤(1)获得的纳米静电纺丝材料上，获得组织工程皮肤，所述3D打印参数是利用AutoCAD软件对3D生物打印机进行编程，根据纳米纤维材料尺寸设计打印参数，打印喷嘴采用0.8mm，打印线速度为8厘米/min，打印厚度为1毫米，打印层数为两层，打印温度为37℃，打印湿度为60％。
实施例3.组织工程皮肤的制备方法。
本实施例所述的组织工程皮肤的制备方法是，利用皮肤细胞作为种子细胞进行培养扩增，以纳米静电纺丝材料作为支架，通过3D打印技术，将培养扩增的细胞打印到支架上，获得组织工程皮肤，具体步骤如下：
(1)纳米静电纺丝材料的制备
以DMF为溶剂，配制质量分数为14％的PVP纺丝液，在纺丝瓶中31℃，溶胀22小时，获得纺丝液；将纺丝液在静电纺丝机上，在18kV电压下，毛细管和收集屏之间的距离为28cm，加工2分钟获得0.55mm厚的纳米静电纺丝材料；
(2)人体皮肤细胞的培养
取皮肤组织使用含抗生素的PBS缓冲液反复冲洗，剪裁至4cm2，置于蛋白酶液中37℃浸泡16h，分离表皮和真皮，将表皮置于质量分数为1％胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化30分钟，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37℃下消化30分钟，制得真皮细胞悬液；分别使用含质量浓度为1.5％牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液，将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别过滤，对滤液在10000r/min条件下，离心10分钟，获得表皮原代细胞和真皮原代细胞，将表皮原代细胞和真皮原代细胞分别接种在含胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，培养至培养皿面积的80％-100％进行传代，收集表皮和真皮细胞；
(3)细胞培养至纳米纤维材料上，获得组织工程皮肤
将步骤(2)获得的表皮细胞培养液和真皮细胞培养液通过3D打印机打印于将步骤(1)获得的纳米静电纺丝材料上，获得组织工程皮肤，所述3D打印参数是利用AutoCAD软件对3D生物打印机进行编程，根据纳米纤维材料尺寸设计打印参数，打印喷嘴采用1.0mm，打印线速度为10厘米/min，打印厚度为2毫米，打印层数为两层，打印温度为37℃，打印湿度为70％。
实施例4.添加药物的纳米静电纺丝材料的制备。
重复实施例1，，与实施例1不同之处在于，步骤(1)在制备PVP纺丝溶液时，以DMF为溶剂，加入青霉素，使其质量分数为2.5％。
实施例5.添加药物的纳米静电纺丝材料的制备。
重复实施例2，与实施例2不同之处在于，步骤(1)在制备PVP纺丝溶液时，以DMF为溶剂，加入四环素，使其质量分数为2％。
实施例6.添加药物的纳米静电纺丝材料的制备。
重复实施例3，与实施例3不同之处在于，步骤(1)在制备PVP纺丝溶液时，以DMF为溶剂，加入阿奇霉素，使其质量分数为1％。
实施例1,2,3所制备的纳米静电纺丝材料如图4中A，B和C所示，实施例4,5,6所制备的纳米静电纺丝材料如图4中D,E和F所示，药物质量浓度3％以下，所形成的纤维整体均匀通透，观察不到纤维中有颗粒，而且纤维表面也没有可识别颗粒，说明药物在其中为均匀分布，药物以分子状态存在于纤维基质中。
对比例1.不同PVP浓度下纳米静电纺丝材料的制备。
对比例1重复实施例1，与实施例1步骤(1)的不同之处在于所用的PVP以DMF为基准计，PVP质量浓度为6％，8％或18％。
图1中C为实施例1中(1)所制备的纳米静电纺丝材料，纳米材料直径均一，呈管状。当PVP质量浓度为6％或8％时，结果如图1中A和B所示，未形成纳米管状结构，纳米材料直径不均匀，无法形成均一的管状结构，无法保证材料的一致性，同时在纳米材料交叉的地方会形成粘连，导致纤维的直径变大，影响材料的整体性能。当浓度为18％时，所形成的纳米纤维材料如图1中D所示，纤维刚性变强，纤维直径不均匀，形成的材料由于刚性的加强导致柔性的降低，影响吸湿透气性能。
对比例2.不同电压下纳米静电纺丝材料的制备。
对比例2重复实施例2，与实施例2步骤(1)的不同之处在于所用纺丝电压为12kV，20kV和22KV。
图2中B为实施例2中(1)所制备的纳米静电纺丝材料，纳米材料直径均一，呈管状。当电压为12kv时，制备的纺丝材料如图2中A所示，纤维直径过大，无法形成管状结构，这样导致材料的表面体积比过低，影响复合材料整体性能。当电压为20kv和22kv时，结果如图2中C和D所示，材料发生过度的卷曲，无法形成直线的管状结构，或者形成过度断裂，纤维形成直线的距离很短，而且刚性过强，不能得到均一笔直的材料，无法为复合材料形成很好的基质。
对比例3.毛细管和收集屏之间的距离为15cm纳米静电纺丝材料的制备。
对比例3重复实施例2，与实施例2步骤(1)的不同之处毛细管和收集屏之间的距离为15cm。
对比例4.毛细管和收集屏之间的距离为20cm纳米静电纺丝材料的制备。
对比例4重复实施例3，与实施例3步骤(1)的不同之处毛细管和收集屏之间的距离为20cm。
图3中C和D分别是实施例2和实施例3步骤(1)中所制备的纳米静电纺丝材料，可见纤维均一通透，图3中A是对比例3步骤(1)中所制备的纳米静电纺丝材料，图3中B是对比例4步骤(1)中所制备的纳米静电纺丝材料，无论是对比例3还是对比例4的条件下，都未形成直线型的纳米纤维。
采用实施例1与实施例4制备的组织工程皮肤进行效果验证。
取成年大鼠，每组10只，分为三组，对各组中大鼠的表皮进行部分剥离，各组之间剥离程度相似，创面直径在4cm2-9cm2，其中一组用实施例1制备的组织工程皮肤进行移植，第二组使用实施例4制备的组织工程皮肤进行移植，最后一组不进行处理进行自然愈合。在处理不同天数中进行观察，并记录创面愈合情况。统计创面恢复率，创面恢复率＝(原始创面-测量创面)/原始创面×100％。(不含严重感染鼠)
表1不同组别大鼠移植后创面恢复情况
创面恢复结果如表1所示，在肉眼无明显感染症状的实验鼠统计中，移植本申请所述方法制备的组织工程皮肤实施例1组与实施例4组比未处理组具有较好的愈合效果。
此外，实施例1组中由于未添加药物处理，出现3只肉眼可见的严重感染，实施例4组仅1只出现严重感染，对照组中出现4只严重感染，其中1只死亡。
在移植后的20天，所有未感染组别大鼠创面已完全愈合，其中，实施例1与实施例4组疤痕大小明显小于未处理组。
