一种用于引导口腔骨组织再生的膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医疗器具领域，具体涉及一种用于引导口腔骨组织再生的技术。
背景技术
随着材料与医疗技术的发展，口腔种植的应用越来越广泛，但在实际应用中常常遇到患者的骨量不足(高度和厚度)、种植体固位不良等问题。根据骨和软组织生长特点，多采用引导骨再生(GBR)或/和引导组织再生(GTR)技术进行骨扩增。但在修复过程中，成纤维细胞的生长速率远远大于骨细胞，因此有必要在牙槽骨上植入一层屏障膜阻挡成纤维细胞长入骨缺损区，为骨细胞的生长留有空间。从而实现手术区的修复。
骨组织引导再生技术的关键在于GBR膜材料。目前的常用的材料分为两大类：可吸收和不可吸收两类。不可吸收膜主要有聚四氟乙烯膜、钛加强型聚四氟乙烯膜、钛膜和微孔滤膜等。不可吸收膜生物相容性好,有着稳定的维持空间的作用,很多研究表明不可吸收膜确实能够保证理想的成骨效果，但因其不可吸收，需要二次取出,临床应用中也存在膜暴露、黏膜裂开，感染等并发症，导致成骨失败,此临床应用受到限制。一个良好的GBR膜应该同时具有良好的生物相容性、降解速度和组织愈合时间平衡，降解的产物在体内无不良反应，有一定可操作性和机械强度。临床上常用的可吸收膜为胶原膜，其最大的优点是不需要二次取出，但价格很高，降解速度快，塑形性也较差，质地柔软，膜下组织的再生空间难以维持，还可能出现膜塌陷、移位等并发症。
因此，临床上对GBR膜的要求需要同时具备良好的生物相容性，匹配骨组织修复周期的完全可降解性，良好的塑性以抵抗其他组织长入以及促成骨特性。金属镁及其合金材料由于其具备良好的生物相容性，和优异的促成骨特性而受到了骨科领域的研究者的广泛关注。但是镁及其合金存在着降解速率快，降解过程中产氢对植入部位周围组织造成压迫等在较大程度上妨碍了镁及其合金的应用。因此，严格控制镁合金的降解速率是制备优良的GBR膜的关键。
静电纺丝技术被认为是一种有效制作连续纳米纤维的方法，很多高分子材料可以纺丝出纳米级的纤维,其所制备的纤维膜的直径具有极大的表面积和高孔隙率，能够满足细胞黏附以及生长等需求。因此其在药物的释放、伤口的敷料、组织工程等生物医学领域已广泛应用，静电纺丝技术为制备GBR膜提供了一个新的方法，它可以通过调节溶液体系、电纺技术的参数以及改进电纺装置来控制纳米纤维的形态结构、力学和生物学性能等以满足不同的要求，诸多科研工作者也证实了采用静电纺丝的技术，制作的GBR膜的可行性。但是其不足之处在于静电纺丝技术制备的GBR膜原料常为高分子聚合物材料，这些材料在降解过程中会产生酸性产物，会对周围组织造成刺激甚至诱发炎症。
金属和高分子隶属于两种不同的材料，其二者结合后必定存在界面，这届导致了镁和高分子支架容易发生脱落。微弧氧化技术是一种处物理方法，不会向体系中引入外来元素从而诱发生物毒性。另外镁合金经微弧氧化处理后会在其表面形成细小的孔洞，其尺寸需要达到若干微米级别才能允许长的高分子链伸入孔洞中起到“锚定”的效果，以提高金属材料和高分子材料之间的界面结合力。
发明内容
本发明是针对当前可吸收GBR膜支撑力不足，不可降解或降解速率过快，骨修复能力较弱的问题而提出的一种用于引导口腔骨组织再生的膜及其制备方法，本发明不仅可为骨生长区提供足够的支撑力，而且具有很好的骨诱导性并可控制GBR膜被完全降解的时间。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明所述一种用于引导口腔骨组织再生的膜，包括多孔纯镁或镁合金网，在多孔纯镁或镁合金网的底面上设有高分子纺丝膜，在多孔纯镁或镁合金网的表面上设有镁与高分子的复合纺丝膜。
本发明所述一种用于引导口腔骨组织再生的膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤1将纯镁或镁合金箔片雕刻成多孔纯镁或镁合金网，并对多孔纯镁或镁合金网预处理，再浸入可降解高分子溶液中，自然风干后再进行热压处理，
步骤2将可降解医用级高分子材料和有机溶剂配置成静电纺丝液，电纺制成高分子纺丝膜，并在高分子纺丝膜中的溶剂完全挥发前，将多孔纯镁或镁合金网的底面贴在所述高分子纺丝膜上，所述静电纺丝液中可降解医用级高分子材料的质量百分数为15-18wt.％，所述静电纺丝液中的有机溶剂至少为1，1，1，3，3，3-六氟异丙醇(HFIP)、二氯甲烷、三氯甲烷及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一种，
步骤3将步骤2中的静电纺丝液与镁微粒共混形成共混静电纺丝液，采用静电纺丝工艺，紧接着镁网002粘接在高分子纺丝膜001后即在多孔纯镁或镁合金网的表面上覆盖镁与高分子的复合纺丝膜，得到由高分子纺丝膜、多孔纯镁或镁合金网及镁与高分子的复合纺丝膜叠加形成的用于引导口腔骨组织再生膜，所述共混静电纺丝液中的镁微粒占静电纺丝液中可降解医用级高分子材料质量的3-10％，且镁微粒的中粒径在20μm以下。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明涉及一种用于引导口腔骨组织再生膜技术，其在静电纺丝GBR的基础上添加了两种不同形态的金属镁，通过增加镁和高分子之间的界面结合力不仅有效的控制了由于镁腐蚀而产生的氢气的释放速率还中和了高分子聚合物水解后产生的酸性环境，在有效地抑制炎症反应的同时还具备一定的抗菌效果。镁网提供的支撑力远大于纯聚合物膜，为骨组织的生长提供了足够的支撑空间，并因镁箔优异的延展性便于塑性以获得良好的形态，整个膜材料就有完全可降解吸收特性，无需二次手术取出，降解产物中的镁离子可激励降钙素基因相关肽的表达，增加与骨细胞上的受体结合的几率，大大促进了骨细胞的增殖分化能力，加速了骨愈合的速度。可进一步提高患者种植后的回复几率。
1.通过向口腔引导骨组织再生膜中引入镁微粒和镁网，利用不同形态的镁活性差而导致的腐蚀速率差可以分级控制再生膜中镁的降解速率，具有分级释放镁离子的功效，其中镁网由于相邻的粒子间的连接作用导致表面积减小，单位质量的镁微粒与降解介质所接触的面积更大，反应活性位点更多，所以，比表面积大而活泼的镁微粒所在的镁/高分子复合纺丝膜003能迅速降解并营造碱性环境(图2)，在再生膜植入口腔环境时暴露在外侧，能在术后前期达到抵抗大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，绿脓假单胞菌等口腔容易滋生的细菌效果；比表面积小而迟钝的镁网所在的中间层002降解速率较慢，能达到长期缓释镁离子促骨组织生长的功效，这是由于牙周组织处于直接与血液接触的环境中，镁或其合金释放的镁离子可随时被代谢排出体内，镁离子的分级缓释作用有效地保障了牙周组织周围镁离子浓度水平，从而延长了再生膜促进骨组织生长作用的时间；疏松多孔的高分子纺丝膜侧001还原了牙成骨细胞生长的细胞外基质的三维结构，便于骨细胞黏附和迁移，进一步加快可骨组织的长成速度。
2.具有双侧异面结构的引导骨组织再生膜按照图7的相对位置紧密贴合牙槽骨侧的高分子纺丝膜侧膜层001不含镁微粒可有效地防止活泼的镁微粒迅速腐蚀造成氢气突释后对骨组织侧造成的直接压迫和刺激；而雕刻呈网状的再生膜中的镁网骨架使得整个中间层002镁总量降低，有效控制再生膜中在降解后镁释放的氢气总量，减少了氢气对牙周组织造成压迫和刺激相关炎症的产生。
3.以镁网为骨架的中间层002构成的双侧异面结构的再生膜同时具备作为骨组织生长的屏障膜的支撑作用，且所包覆的柔软的高分子纺丝膜侧001可紧密贴合骨缺损处防止移位，同时防止了尖锐的镁网对周围健康软组织造成的割伤。
4.直接在金属镁上静电纺丝高分子纳米纤维容易造成高分子膜层脱落，本发明中的镁网先经过所设计的特殊微弧氧化工艺在镁网表面获得孔直径80％以上大于4μm的孔洞(图8)；经高分子溶液浸泡和热压处理时孔洞的直径足以使聚合物长分子链能够伸入镁网表面的微孔中(图9)，从而强化了“锚定作用”和高分子材料和金属材料之间界面结合力；在静电纺丝工艺时纺丝液发挥粘接剂的作用，使部分先形成的高分子膜层溶解，便于纺丝膜与原高分子膜结合紧密，有效防止附着在镁网上的静电纺丝纳米纤维膜的剥落(图10)。
5.经热压处理而附着在镁网上的高分子膜阻挡了水分子扩散进入微弧氧化而成的微米孔洞，延长了镁网完全降解的时间；可调控镁网浸入高分子溶液中的时间和其表面黏附的纺丝膜的成型时间而达到1-3月的周期；并可根据临床需要将膜层预弯或裁剪成所需的形状。
附图说明
图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：001为本发明所述再生膜底层纺丝膜；002为本发明所述再生膜多孔纯镁或镁合金网骨架；003为本发明所述再生膜表层复合纺丝膜；
图1为引导口腔骨组织再生膜的制备流程图。
图2为本发明所述再生膜的体外降解酸碱度曲线。
图3为纯镁或镁合金箔片激光雕刻后所形成的网孔形状及分布(以正六边形为例)。
图4为本发明所述再生膜结构示意图。
图5为本发明的所述的再生膜横截面图。
图6为本发明所述再生膜003侧局部扫面电镜放大图。
图7为本发明所述再生膜贴合在牙槽骨上的膜相对位置和方向。
图8为本发明所述微弧氧化处理工艺的微孔扫描电镜放大图。
图9为锚定作用机制图。
图10为本发明所述再生膜中镁网后处理前后表面附着纺丝膜机械剥离强度。
具体实施方式
本发明所述的一种用于引导口腔骨组织再生的膜，包括多孔纯镁或镁合金网002，在多孔纯镁或镁合金网002的底面上设有高分子纺丝膜001，在多孔纯镁或镁合金网002的表面上设有镁与高分子的复合纺丝膜003。在本实施例中，所述高分子纺丝膜001为可降解医用级高分子膜；所述镁与高分子的复合纺丝膜003为可降解医用级高分子与镁微粒的共混纺丝膜；在纯镁或镁合金网002上包覆有可降解高分子膜，纯镁或镁合金网的厚度为150-500μm；高分子纺丝膜001及复合纺丝膜003的厚度均为0.1-0.2mm。
本发明所述的一种用于引导口腔骨组织再生的膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤1将纯镁或镁合金箔片雕刻成多孔纯镁或镁合金网002，并对多孔纯镁或镁合金网002预处理，再浸入可降解高分子溶液中，自然风干后再进行热压处理，多孔纯镁或镁合金网可以由多种不同的广义制得，例如：可以采用激光雕刻技术，激光雕刻所采用的工艺参数为波长λ＝1064nm,激光功率P＝20W，孔形状可以为正六边形、正三角形、菱形、正方形、圆形等几何形状，且多孔纯镁或镁合金网的实际面积为所述纯镁或镁合金箔片面积的20-40％，纯镁或镁合金箔的厚度为150-500μm，
步骤2将可降解医用级高分子材料和有机溶剂配置成静电纺丝液，电纺制成高分子纺丝膜001，并在高分子纺丝膜001中的溶剂完全挥发前，将多孔纯镁或镁合金网002的底面贴在所述高分子纺丝膜001上，所述静电纺丝液中可降解医用级高分子材料的质量百分数为15-18wt.％，所述静电纺丝液中的有机溶剂至少为1，1，1，3，3，3-六氟异丙醇(HFIP)、二氯甲烷、三氯甲烷及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的一种；具体来说，在电纺制成高分子纺丝膜001过程中，以锡箔纸为负极，在锡箔纸上先纺制底层膜层001，以所述的静电纺丝液即高分子溶液为粘接剂，将多孔纯镁或镁合金网002的底面粘在所述高分子纺丝膜001上，整个动作时间需控制在10s内，以防止有机溶剂挥发而无法发挥粘接作用，
步骤3事先将步骤2中的静电纺丝液与镁微粒共混形成共混静电纺丝液，同时采用静电纺丝工艺，紧接着步骤2将镁网002粘接在高分子纺丝膜001上后即在多孔纯镁或镁合金网002的表面上纺丝覆盖上镁与高分子的复合纺丝膜003，得到由高分子纺丝膜001、多孔纯镁或镁合金网002及镁与高分子的复合纺丝膜003叠加形成的口腔骨组织再生膜，所述共混静电纺丝液中的镁微粒占静电纺丝液中可降解医用级高分子材料质量的3-10％，且镁微粒的粒径在20μm以下，以下是共混静电纺丝液的一种制备方法：共混静电纺丝液是由有机溶剂+高分子+镁微粒机械混合搅拌过夜制成，其中镁微粒占高分子溶质质量3-10％，而在整个混合体系中固体(镁+高分子)占有机溶剂的15-18wt.％。在本实施例中，
在将纯镁或镁合金网002浸入可降解高分子溶液之前，对纯镁或镁合金网002进行微弧氧化处理，使纯镁或镁合金网002上形成微孔；所述微弧氧化处理的电极溶液配方为：12.5～13.5g/L的Na2SiO3，4.5～5.5g/L的Na3PO4，2.5～3.0g/L的NaOH，并在恒流模式下以450～500Hz频率和3.8～4.0A的电流进行表面处理，工作电压加至260～280V，微弧氧化处理时间为12-20min，获得80％以上微孔直径大于4μm的镁网，以使可降解医用级高分子长分子链能够伸入镁网表面的微孔中(图8)，从而加固了“锚定作用”和高分子材料和金属材料之间界面结合力。
所述可降解高分子溶液的浓度为0.1-0.125g/mL，溶质为完全可降解医用级高分子且至少包括聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、聚乙烯醇(PVA)、胶原及壳聚糖中的一种。
纯镁或镁合金网002在可降解高分子溶液中的浸泡时间为60-90min，浸泡后进行的热压为：将浸渍高分溶液的纯镁或镁合金网002放在两块热压板之间，热压板置于加热炉中；对加热炉升温的同时加压，加热至50-170℃并保温，加压至0.1-0.15MPa并保持压力，保温保压时间为15-25min，待保温保压结束后自然冷却，采用热压处理能使高分子链渗入微米级孔洞中强化锚定作用。
对多孔纯镁或镁合金网002预处理包括：用5％冰醋酸溶液酸洗60s并自然风干，以及，150-200℃下退火20min。
下面结合一些具体实施例对本发明作进一步的说明，实际不止下列实施例。
实施例1
(1)以纯度为99.9％的镁板材为料，热轧制到150μm厚，采用激光雕刻技术在箔片上雕刻实际面积占比20％的且均匀分布的正六边形孔。
(2)采用5％冰醋酸酸洗30s，自然晾干后在150℃下退火处理20min。
(3)微弧氧化处理：在12.5g/L的Na2SiO3，4.5g/L的Na3PO4，2.5g/L的NaOH的电极溶液中以直流电模式下在450Hz频率和3.8A的电流进行表面处理，工作电压加至260V，微弧氧化处理15min；最后镁网用去离子水洗涤三次并在自然晾干。
(4)将镁网浸泡在浓度为0.1g/mL以HFIP为溶剂的聚己内酯(PCL)溶液中60min，取出后自然晾干。
(5)在热压温度T＝50℃，保持压力P＝0.1MPa下保温保压10min，使高分子链渗入微米级孔洞中，自然冷却后备用。
(6)分别制备聚己内酯含量为15wt.％的纯高分子溶液A和在A的基础上制备含3％镁的聚己内酯纺丝液B的并搅拌过夜，以A液利用静电纺丝技术先纺制膜厚0.1mm的底层纺丝膜001。
(7)以纺丝液B液为粘接剂，将镁网粘在底层纺丝膜001上，接着立即纺制第二层复合纺丝膜003，直至将镁网完全覆盖住。以构成“高分子纺丝膜001-镁网-镁/高分子复合纺丝膜003”结构的GBR膜。
实施例2
(1)以镁含量超过98％的Mg-Zn合金板材为原料，200℃下热轧制到200μm厚，采用激光雕刻技术在箔片上雕刻实际面积占比30％的且均匀分布的菱形形孔。
(2)采用5％冰醋酸酸洗30s，自然晾干后在180℃下退火处理20min。
(3)微弧氧化处理：在13.0g/L的Na2SiO3，5.0g/L的Na3PO4，2.5g/L的NaOH的电极溶液中以直流电模式下在500Hz频率和3.8A的电流进行表面处理，工作电压加至260V,微弧氧化处理20min；最后镁网用去离子水洗涤三次并在自然晾干。
(4)将镁网浸泡在浓度为0.12g/mL以HFIP：DMF＝1:1为溶剂的聚乳酸乙醇酸(PLGA)溶液中75min，取出后自然晾干。
(5)在热压温度T＝85℃，保持压力P＝0.12MPa下保温保压15min，使高分子链渗入微米级孔洞中，自然冷却后备用。
(6)分别制备聚乳酸乙醇酸含量为18wt.％的纯高分子溶液A和在A的基础上制备含6％镁的聚乳酸乙醇酸纺丝液B的并搅拌过夜，以A液利用静电纺丝技术先纺制膜厚0.15mm的底层纺丝膜001。
(7)以纺丝液B为粘接剂，将镁网粘在底层纺丝膜001上，接着立即纺制第二层纺丝膜003，直至将镁网完全覆盖住。以构成“高分子纺丝膜001-镁网-镁/高分子复合纺丝膜003”结构的GBR膜。
实施例3
(1)以纯度超过97％的Mg-Ca合金板材为原料，200℃下热轧制到300μm厚，采用激光雕刻技术在箔片上雕刻实际面积占比35％的且均匀分布的等边三角形孔。
(2)采用5％冰醋酸酸洗30s，自然晾干后在200℃下退火处理20min。
(3)微弧氧化处理：在13.0g/L的Na2SiO3，5.5g/L的Na3PO4，2.5g/L的NaOH的电极溶液中以直流电模式下在500Hz频率和4.0A的电流进行表面处理，工作电压加至280V,微弧氧化处理20min；最后镁网用去离子水洗涤三次并在自然晾干。
(4)将镁网浸泡在浓度为0.125g/mL以三氯甲烷为溶剂的聚乳酸(PLA)溶液中90min，取出后自然晾干。
(5)在热压温度T＝100℃和保持压力P＝0.15MPa下保温保压15min，使高分子链渗入微米级孔洞中，自然冷却后备用。
(6)分别制备聚乳酸含量为18wt.％的纯高分子溶液A和在A的基础上制备含9％镁的聚乳酸纺丝液B的并搅拌过夜，以A液利用静电纺丝技术先纺制膜厚0.20mm的底层纺丝膜001。
(7)以纺丝液B为粘接剂，将镁网粘在底层纺丝膜001上，接着立即纺制第二层纺丝膜003，直至将镁网完全覆盖住。以构成“高分子纺丝膜001-镁网-镁/高分子复合纺丝膜003”结构的GBR膜。
实施例4
(1)以纯度超过97％的Mg-Zn-Ca合金板材为原料，200℃下热轧制到500μm厚，采用激光雕刻技术在箔片上雕刻实际面积占比40％的且均匀分布的正方形孔。
(2)采用5％冰醋酸酸洗30s，自然晾干后在200℃下退火处理20min。
(3)微弧氧化处理：在13.5g/L的Na2SiO3，5.5g/L的Na3PO4，3.0g/L的NaOH的电极溶液中以直流电模式下在500Hz频率和4.0A的电流进行表面处理，工作电压加至280V,微弧氧化处理25min；最后镁网用去离子水洗涤三次并在自然晾干。
(4)将镁网浸泡在浓度为0.125g/mL以二氯甲烷为溶剂的胶原溶液中90min，取出后自然晾干。
(5)在热压温度T＝60℃和保持压力P＝0.15MPa下保温保压15min，使高分子链渗入微米级孔洞中，自然冷却后备用。
(6)分别制备胶原含量为18wt.％的纯高分子溶液A和在A的基础上制备含10％镁的胶原纺丝液B的并搅拌过夜，以A液利用静电纺丝技术先纺制膜厚0.20mm的底层纺丝膜001。
(7)以纺丝液B为粘接剂，将镁网粘在底层纺丝膜001上，接着立即纺制第二层纺丝膜003，直至将镁网完全覆盖住。以构成“高分子纺丝膜001-镁网-镁/高分子复合纺丝膜003”结构的GBR膜。
