一种负载活性生物玻璃的皮肤再生材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物医用材料，具体涉及一种负载活性生物玻璃的皮肤再生材料及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，主要由表皮层、真皮层和皮下组织构成，同时含有丰富的血管和神经。日常生活中由于各种原因如创伤、烧伤、溃疡、手术及先天性畸形等很容易造成皮肤的缺损。皮肤组织虽然具有较强的再生能力，但是对于大面积的全层皮肤缺损，由于真皮层的缺失，皮肤的再生能力明显不足。治疗全层皮肤缺损的关键是重建和再生真皮组织，促进创面尽早封闭，避免微生物入侵等并发症。迄今为止，自体皮移植仍然是临床治疗全层皮肤缺损最有效的方法。但是该方法面临着自体皮供应不足的缺点，如Ⅲ度烧伤面积超过30％时供皮部位就已不足。另一个常用的治疗方法就是采用人工皮肤。目前国际市场上人工皮肤有Apligraf、Integra、Transcyte、AlloDerm和Dermagraft等。
皮肤再生材料血管化速度是影响其再生性能、决定材料移植成活率的关键。由于皮肤再生材料中缺乏相互连通的血管网络，难以实现与创面区血管的快速连接。在移植初期，皮肤再生材料中的细胞所需要的营养物质主要依靠扩散作用来实现。在血供实现以前，皮肤再生材料中细胞的增殖和分化等功能常因营养成分的缺乏而受限，甚至导致细胞调亡，从而影响其再生速度和存活率。目前的皮肤再生产品的血管化速率较慢，植入物完全血管化一般需要几周(2-4周)的时间，增加了病人的住院时间和感染风险。因此，如何促进皮肤再生材料的血管化速度，进而缩短创面缺血时间，提高移植存活率，是皮肤再生与修复研究中亟待解决的关键问题。
为了提高皮肤再生材料的血管化速度，采用在植入物上负载血管化因子如内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等方法，取得了积极的效果。但由于生长因子不稳定，容易降解，而且直接注射生长因子需要多次重复操作，带来了极大的不便。使用能够快速促进机体自身分泌血管化细胞因子的生物活性支架材料成为一种可行的选择，也是人们研究的一个热门。
目前，临床所用的敷料一般为传统敷料和合成敷料，虽然这两种敷料具有成本低，来源广，对伤口渗出液吸收量大的优点。但是，其也有一定的局限性，例如：保湿效果差，抗菌性能低，易与伤口粘连，不利于创面的细胞附着、生长和分化等。
另外，皮肤再生产品的血管化速率较慢，植入物完全血管化一般需要几周(2-4周)的时间，增加了病人的住院时间和感染风险。因此，如何促进皮肤再生材料的血管化速度，进而缩短创面缺血时间，提高移植存活率，是皮肤再生与修复研究中亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种负载活性生物玻璃的皮肤再生材料及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种负载活性生物玻璃的皮肤再生材料的制备方法，包括以下步骤：
将丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇和活性生物玻璃与六氟异丙醇混合均匀，经过静电纺丝，得所述皮肤再生材料；
所述丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇和活性生物玻璃的质量之比为：丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇：活性生物玻璃＝1:0.1:0.1:0.1；
所述丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇和活性生物玻璃的质量之和与六氟异丙醇的体积之比为：1:8～12。
丝素蛋白具有良好的生物相容性、易加工性和可降解性，近年来在生物医学领域的应用研究非常活跃，丝素蛋白支架植入后，可以在早期促进周围组织VEGF和CD34等的表达，有利于组织血管化。
壳聚糖作为一种天然高分子材料，不仅具有良好的生物相容性，而且具有抗菌、灭菌的作用，但是由于力学性能不足，使得其难以单独作为皮肤再生支架材料。
聚乙烯醇有良好的生物相容性、化学稳定性，不溶于大多数的有机溶剂。同时，它还具有良好的成纤性与成膜性，在化纤、药物、医学、食品、封装等行业有广泛的应用。
生物活性玻璃是一种具有良好生物相容性和可降解性的无机类生物活性材料，能够在植入部位迅速发生一系列表面反应，促进细胞迁移、增殖和组织修复。由于其化学组成与人体骨骼类似，常被用于骨和软骨组织工程支架材料。
静电纺丝纤维的直径小、比表面积大，使得它可以在众多领域得到广泛的应用。例如，由静电纺丝，所制备的静电纺丝膜，由于其纤维支架与细胞外基质在形态结构上相似，同时静电纺丝纤维支架的比表面积大，孔隙多，易于细胞的附着和生长。静电纺丝纤维膜的孔径一般在500nm-1000nm之间，远小于细菌的尺寸，可阻挡细菌感染。同时5～100m2/g的高比面积对于伤口渗液的吸收和真皮的生长极为有效。
本发明所述皮肤再生材料针对现有敷料保湿效果差、血管化速率慢的缺点，以丝素蛋白，壳聚糖、聚乙烯醇和生物玻璃以特定的配比作为基质，通过静电纺丝的方法，制备一种能够更好促进细胞附着、生长和分化潜力，同时能够促进血管化的皮肤再生材料。为创伤、烧伤等深度皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗提供了一种性能良好的皮肤替代物。该皮肤再生材料，作为皮肤替代物时，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦；可以广泛应用于创伤、烧伤和外科整形等方面。
丝素蛋白，壳聚糖、聚乙烯醇和生物玻璃以上述配比才能获得具有高拉伸应力、高杨氏模量和低断裂伸长率等力学性能以及高吸水性的材料。
丝素蛋白的浓度决定了静电纺丝的成膜性能，而丝素蛋白，壳聚糖、聚乙烯醇的成分配比，决定了静电纺丝溶液的浓度以及静电纺丝后获得的皮肤再生材料的吸水性能和力学性能(主要是拉伸应力和杨氏模量)，发明人发现，当壳聚糖和聚乙烯醇的添加比值过高，难以进行静电纺丝，添加比值过低，所得到的电纺膜得不到预期的吸水性能和力学性能，而生物玻璃的加入量过少则断裂伸长率较低，加入量过多，生物玻璃聚集在电纺膜的纤维和表面上，造成了应力聚集则拉伸应力和杨氏模量降低。六氟异丙醇的上述加入量可以实现壳聚糖和聚乙烯醇溶解形成合适浓度的纺丝液，有利于静电纺丝成膜。
优选地，所述活性生物玻璃的制备方法包括以下步骤：将正硅酸乙酯和磷酸三乙酯在硝酸催化下水解形成溶胶，后加入硝酸钙搅拌均匀，经过陈化、干燥、粉磨并且在680～720摄氏度下煅烧2～3小时后得所述活性生物玻璃。
优选地，所述正硅酸乙酯、磷酸三乙酯和硝酸钙的重量之比为：58.22:9.17:22.66；所述硝酸的浓度为2mol/L；所述陈化的条件为：在室温下陈化72h。所述正硅酸乙酯、磷酸三乙酯和硝酸钙的比、硝酸的浓度以及陈化的条件决定了活性生物玻璃的粒径，而合适尺寸的粒径更有利于静电纺丝的进行。
优选地，所述活性生物玻璃的粒径为20-30μm。在上述粒径尺寸范围的活性生物玻璃有利于本发明静电纺丝工艺。
优选地，所述丝素蛋白的制备方法包括以下步骤：用质量分数为0.5％的Na2CO3溶液煮沸处理蚕茧5次，每次1小时，温度为100摄氏度，浴比为l:100，用蒸馏水充分洗净，自然干燥，得到纯丝素纤维，用摩尔比为1:2:8的CaCl2、CH3CH2OH和H2O三元溶剂溶解，溶液与丝素纤维质量比为10：1，于75～80摄氏度下搅拌溶解1～2小时得到混合溶液，冷却后得到的溶液注入纤维素透析膜中，在流水中透析2～4天，将透析后的溶液，进行冷冻干燥，得所述丝素蛋白。
优选地，所述静电纺丝的条件为：温度为25～60℃，湿度为20～60％，电压为15～30kV，推送速率为1～5mL/h。
优选地，所述静电纺丝的条件为：温度为40℃，湿度为35％，电压为25kV，推送速率为2mL/h。在该静电纺丝条件下能制得均匀的电纺膜。
本发明的目的还在于提供一种采用所述负载活性生物玻璃的皮肤再生材料的制备方法制备而成的皮肤再生材料。
本发明的目的还在于提供一种敷料，所述敷料包含所述负载活性生物玻璃的皮肤再生材料。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种负载活性生物玻璃的皮肤再生材料及其制备方法，本发明以丝素蛋白，壳聚糖、聚乙烯醇和生物玻璃作为基质，通过静电纺丝的方法，制得的皮肤再生材料具有高拉伸应力、高杨氏模量和低断裂伸长率等力学性能以及高吸水性，能够促进创面血管化，缩短创面的愈合时间，是一种性能良好的皮肤替代物。该皮肤再生材料，作为皮肤替代物时，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦；可以广泛应用于创伤、烧伤和外科整形等方面。并且各材料来源广泛，成本低；采用静电纺丝的制备方法，具有生产效率高，易于产业化生产的优点。
附图说明
图1为活性生物玻璃的扫描电镜图；
图2实施例1～5所述皮肤再生材料扫描电镜图；
图3为实施例1～5所述皮肤再生材料的纤维直径分布图；
图4为实施例1～10所述皮肤再生材料的吸水率；
图5为实施例1～5所述皮肤再生材料的细胞活性；
图6为术后14天，实施例1～5所述皮肤再生材料对大鼠创面的修复情况；(a):实施例1，(b)：实施例2，(c):实施例3，(d):实施例4，(e)：实施例5；
图7为术后14天，实施例1～5所述皮肤再生材料对大鼠创面修复的H&E染色情况；(a):实施例1，(b)：实施例2，(c):实施例3，(d):实施例4，(e)：实施例5；
图8为术后14天，实施例1～5所述皮肤再生材料对大鼠创面修复的Masson染色情况；(a):实施例1，(b)：实施例2，(c):实施例3，(d):实施例4，(e)：实施例5；
图9为术后14天，实施例1～5所述皮肤再生材料对大鼠创面修复的CD31染色情况；(a):实施例1，(b)：实施例2，(c):实施例3，(d):实施例4，(e)：实施例5；
图10术后14天，实施例1～5所述皮肤再生材料对大鼠创面修复的α-SMA染色情况；(a):实施例1，(b)：实施例2，(c):实施例3，(d):实施例4，(e)：实施例5。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1～10中，所述皮肤再生材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇和活性生物玻璃与六氟异丙醇在室温下搅拌混合均匀，搅拌速率为400rpm/24h，得静电纺丝液；所述丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇和活性生物玻璃的质量之比见表1，所述丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇和活性生物玻璃的质量之和与六氟异丙醇的体积之比为：1:10；
(2)将静电纺丝液在温度为40℃，湿度为35％，电压为25kV，推送速率为2mL/h下，用静电纺丝机进行纺丝制备皮肤再生材料，纺丝时间为4h，得所述皮肤再生材料。
其中，丝素蛋白的制备方法包括以下步骤：用质量分数为0.5％的Na2CO3溶液煮沸处理蚕茧5次，每次1小时，温度为100摄氏度，浴比l:100，用蒸馏水充分洗净，自然干燥，得到纯丝素纤维，用摩尔比为1:2:8的CaCl2、CH3CH2OH和H2O三元溶剂溶解，溶液与丝素纤维质量比为10：1，于75～80摄氏度下搅拌溶解1～2小时得到混合溶液，冷却后得到的溶液注入纤维素透析膜中，在流水中透析2～4天，将透析后的溶液，进行冷冻干燥，得丝素蛋白。
活性生物玻璃的制备方法包括以下步骤：将正硅酸乙酯和磷酸三乙酯在2mol/L的硝酸催化下水解形成溶胶，后加入硝酸钙搅拌均匀，经过陈化、干燥、粉磨并且在680～720摄氏度下煅烧2～3小时后得到活性生物玻璃粉体。
表1丝素蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇和活性生物玻璃的重量比(重量份)
图1为活性生物玻璃的扫描电镜图。由图中可以得知，该活性生物玻璃为球形，粒径为20-30um，粒径均匀。
图2为不同实施例的皮肤再生材料的扫描电镜图。由图2可以得知，这些实施例所制备的皮肤再生材料，均为网状结构，由不同大小的纤维交织组成。其中实施例4和5的皮肤再生材料上均匀分布着活性生物玻璃。结合图3，可以得知，实施例1的纤维直径为650nm，实施例2的纤维直径为563nm，实施例3的纤维直径为418nm，实施例4和5的纤维直径分别为565nm和580nm。
图4为不同实施例的皮肤再生材料的吸水率。由于创面在愈合的过程中会有渗出液产生，及时吸收创面的渗出液，保持创面的干爽度，有利于创面的恢复。而且吸水率是皮肤再生材料的一大评价指标。由图4可以得知，实施例4的吸水率最高，为1577％；均高于实施例5～10；而实施例1的吸水率最低为950％；实施例2和3，其吸水率分别为：1183％和1458％。
表2为各实施例皮肤再生材料的力学性能。皮肤再生材料的力学性能，直接影响到该材料在实际应用上的效果。皮肤再生材料，要求具有高拉伸应力、高杨氏模量和低断裂伸长率。由表2可以得知，实施例4的拉伸应力和杨氏模量最大，断裂伸长率最小，为7.85±0.23MPa，49.29±3.34MPa和38.76±7.76％。而实施例1的拉伸应力和杨氏模量最小，断裂伸长率最大，为2.12±0.13MPa，4.03±0.32MPa和126±10％。
表2各实施例皮肤再生材料的力学性能
图5为不同实施例的皮肤再生材料的细胞活性。材料的细胞活性，是评价皮肤再生材料的重要指标，能够直接反应出皮肤再生材料对细胞的存活，增殖和分化等影响。由图5可以得知，实施例4的细胞存活率最高，为110±2.16％，实施例5的细胞存活率次之，为：90.23±2.16，而且实施例1的细胞存活率最低，为：73.56±3.26，说明实施例4的皮肤再生材料的细胞活性最好，对细胞的增殖，分化具有促进的作用。
图6为术后14天，不同实施例的皮肤再生材料对大鼠创面的修复情况。由图6可以得知，经过实施例4的皮肤再生材料处理，创面面积已经大大缩小，创面几乎完全修复，是五个实验例中，恢复的最快的。而实施例5，缺损部位仍有小的伤口。相比之下，实施例1、实施例2和实施例3实验组，其烧伤创面修复的比较慢，伤口愈合程度较低并且在伤口处依然可见少量脓液。
图7和8分别为术后14天，不同实施例的皮肤再生材料对大鼠创面修复的H&E和Masson染色情况。综合图7和8可以得知，术后14天，实施例4和实施例5组织中炎症细胞水平很低，说明已基本无感染，另外，成束的胶原均匀分布于创面修复部位，且沉积量最大。特别是实施例4，新出现的表皮和新生的真皮连接紧密，而且有毛囊和血管出现，其组织结构与正常皮肤组织无异。相比之下，实施例1、实施例2和实施例3实验组，依然能观察到一定量的炎症细胞存在，并且没有观察到表皮结构。
图9和10分别为术后14天，不同实施例的皮肤再生材料对大鼠创面修复的CD31和α-SMA染色情况。在组织修复过程中，血管化进程与创面部位细胞(尤其是内皮细胞)的活动和功能有着密切的关系，血管化速度的快慢，直接影响到创面修复的快慢。因此，血管化速度是评价皮肤再生材料的重要指标。新生血管内皮细胞表面特异性标记物CD31和成熟血管特异性标记物α-SMA，是评价血管化的主要方法。CD31主要是检测新生血管的生成数量的，而aSMA主要是检测成熟血管的生成数量的。由图9和10，可以得知，术后14天，各实施例的创面上都有新生血管和成熟血管的出现，明显能够看到实施例4组的新生血管和成熟血管量最多，明显多于其他各实施例。表明实施例4的皮肤再生材料能促进新生血管和成熟血管生成，生成的血管数量最多，相比具有快速血管化能力，在皮肤再生修复中具有非常广泛的应用潜力和应用前景。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
