一种双向皮层脑电极制备方法及其制备的双向皮层脑电极
技术领域
本发明涉及神经科学技术领域，具体涉及一种双向皮层脑电极制备方法及其制备的双向皮层脑电极。
背景技术
近年来，随着全世界范围“脑计划”的推出，脑电信号采集显得愈发重要。目前，凭借柔性电子学的发展和相关先进生物材料的开发，以柔性神经电极为主要工具的脑电信号采集监测是研究大脑皮质神经连接通路和高级认知功能重要且基础的研究平台，也是诊断、监测预警、调控并治疗各种神经疾病(如癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等)的有力工具。
神经电极按照使用时对研究对象的创伤程度可分为无创、微创和有创三类。其中无创的神经电极脑电图信号的信噪比因颅骨阻碍衰减而较差，更适合用于无创脑机接口的开发及应用，以及脑相关疾病的预警监测。微创的神经电极通过外科手术或手术机器人植入脑内深部核团，由于其空间分布的局限性难以用于探究神经元放电在不同大脑区域中的传导路径。皮层脑电极虽然需要进行外科开颅手术，但其通过超薄柔性电极基底和机械生物相容性材料的使用最大程度地降低了手术风险。
在需要进行外科开颅手术的活体动物模型实验中，结合药物刺激的双向皮层脑电极可以有效评估细胞类型特异性体外培养生物分子和药物对脑组织的作用。凭借时域、频域和空间分布丰富的皮层脑电数据，还可以研究正常情况和药物干预下的脑电传播效应和皮层脑网络的结构连接。在神经外科临床领域中，皮层脑电监测是术前定位癫痫患者致痫灶并决定手术治疗方案的关键技术。癫痫发作过程中长时间的高频神经放电往往会对大脑造成损害，与传统的静脉注射和血液循环给药方法相比，药物(如苯巴比妥、拉莫三嗪、腺苷等)在脑内的释放更快，效果更好，对癫痫的治疗非常有利，结合药物刺激的双向皮层脑电极有助于实现癫痫的诊断治疗并动态监测治疗过程。
然而，现有的结合药物刺激的双向皮层脑电极仍存在许多不足之处，包括药物释放层和电极位点的位置可能会出现重叠，导致药物刺激作用干扰皮层脑电信号的采集；药物释放层的形状和位置不可根据实际使用需求进行设计；在使用时通常先进行给药，然后再进行皮层脑电信号采集，由于药物释放速度较快，导致皮层脑电极不能在药物释放的第一时间进行皮层脑电信号的采集，无法实现动态采集皮层脑电信号的同时及时可控地进行相关脑疾病的药物干预治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双向皮层脑电极制备方法及其制备的双向皮层脑电极，以克服现有技术中存在的上述不足之处。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供了一种双向皮层脑电极制备方法，该方法包括以下步骤：
S1：制备聚合物基底层；
S2：制备聚合物封装层；
S3：制备蚕丝蛋白功能层；
S4：制备铝掩膜层；
S5：制备网格结构；
S6：制备电极位点和连接位点；
S7：制备蚕丝蛋白药物释放载体；
S8：制备双向皮层脑电极。
优选的，所述步骤S1包括：
S11：提供一基底，在所述基底上生长牺牲层；
S12：在所述牺牲层表面形成聚合物基底层。
优选的，所述步骤S2包括：
S21：在所述聚合物基底层表面生长电极材料层；
S22：在所述电极材料层表面形成聚合物封装层。
优选的，所述步骤S3包括：
在所述聚合物封装层上旋涂蚕丝蛋白溶液制备得到蚕丝蛋白功能层。
优选的，所述步骤S4包括：
在所述蚕丝蛋白功能层表面溅射沉积一层铝，并通过第一次光刻图形化制备得到铝掩膜层。
优选的，所述步骤S5包括：
在所述牺牲层上刻蚀所述蚕丝蛋白功能层、所述聚合物封装层和所述聚合物基底层制备得到网格结构。
优选的，所述步骤S6包括：
S61：在所述铝掩膜层上进行第二次光刻图形化；
S62：在所述电极材料层上刻蚀所述蚕丝蛋白功能层和所述聚合物封装层，制备得到用于记录皮层脑电信号的电极位点和用于将记录的皮层脑电信号传输到脑电信号采集设备的连接位点。
优选的，所述步骤S7包括：
S71：在所述铝掩膜层上进行第三次光刻图形化；
S72：在所述聚合物封装层上根据预先设计的形状和位置刻蚀所述蚕丝蛋白功能层，并将刻蚀后的结构浸入含有待加载药物的溶剂制备得到蚕丝蛋白药物释放载体。
优选的，所述步骤S8包括：
释放所述步骤S7所得结构上的牺牲层，制备得到具有采集皮层脑电信号功能和药物刺激功能的双向皮层脑电极。
本发明另一方面提供了一种利用上述双向皮层脑电极制备方法之一制备的双向皮层脑电极。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用以铝为硬掩膜版的光刻工艺和MEMS工艺融合制备具有采集皮层脑电信号功能和药物刺激功能的双向皮层脑电极，两种工艺兼容性较好，且都具有微米级的加工精度，避免了蚕丝蛋白药物释放载体和电极位点的位置重叠，从而使得药物刺激作用不会干扰到高质量皮层脑电信号的采集；
2、本发明蚕丝蛋白药物释放载体的形状和位置可以根据实际使用需求进行预先设计，能够实现在蚕丝蛋白药物释放载体的不同位置上加载药物，有利于研究药物作用于脑皮质连接网络的时空分布特点，也有利于原位评估药物的疾病干预治疗效果；
3、本发明可同时原位评估药物分子对多脑区神经放电活动的影响，也可在动态采集皮层脑电信号的同时及时可控地进行相关脑疾病如癫痫的药物干预治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或者现有技术中的技术方案，下面将对实施例或者现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1是本发明实施例一提供的双向皮层脑电极制备方法的流程示意图，其中：1-基底，2-牺牲层，3-聚合物基底层，4-电极材料层，5-聚合物封装层，6-蚕丝蛋白功能层，7-铝掩膜层，8-网格结构，9-电极位点，10-连接位点；
图2是本发明实施例一提供的静息、癫痫和苯巴比妥释放状态的皮层脑电功率谱密度曲线示意图；
图3是本发明实施例一提供的癫痫大鼠在药物释放前后皮层脑电各通道电压信号示意图；
图4是本发明实施例一提供的静息、癫痫和苯巴比妥治疗状态的皮层脑电频谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
实施例一
本实施例提供了一种双向皮层脑电极制备方法，如图1所示，该方法包括以下步骤：
S1：制备聚合物基底层。
本步骤中，制备聚合物基底层的具体过程包括：
S11：提供一基底1，在所述基底1上生长牺牲层2。
本步骤中，选取硅片作为基底1，先采用清洗液(如浓H2SO4)对所述硅片进行清洗，然后采用PECVD在所述基底1表面生长SiO2作为牺牲层2。当然，所述基底1和所述牺牲层2还可以选择其他合适的材料，在此不做限制。
作为示例，所述牺牲层2的厚度为1-3μm。在本实施例中，所述牺牲层2的厚度为2μm。在其他实施例中，所述牺牲层2的厚度还可以为1μm、1.5μm、2.5μm、3μm等。
S12：在所述牺牲层2表面形成聚合物基底层3。
本步骤中，在所述牺牲层2表面旋涂并固化聚酰亚胺作为聚合物基底层3。当然，所述聚合物基底层3还可以选择其他合适的材料，在此不做限制。
作为示例，所述聚合物基底层3的厚度为1-3μm。在本实施例中，所述聚合物基底层3的厚度为2μm。在其他实施例中，所述聚合物基底层3的厚度还可以为1μm、1.5μm、2.5μm、3μm等。
S2：制备聚合物封装层。
本步骤中，制备聚合物封装层的具体过程包括：
S21：在所述聚合物基底层3表面生长电极材料层4。
本步骤中，在所述聚合物基底层3表面先通过紫外光刻工艺将LC100A光刻胶图形化，然后采用电子束蒸发沉积工艺制备一层铬/金合金层，并通过溶脱剥离工艺图形化得到电极材料层4。当然，所述紫外光刻工艺所采用的光刻胶还可以为其他合适的光刻胶，所述电极材料层4还可以选择其他合适的材料，在此不做限制。
作为示例，所述光刻胶的厚度为1-3μm。在本实施例中，所述光刻胶的厚度为2μm。在其他实施例中，所述光刻胶的厚度还可以为1μm、1.5μm、2.5μm、3μm等。
作为示例，所述铬/金合金层的厚度为1nm/100nm-2nm/200nm。在本实施例中，所述铬/金合金层的厚度为1.5nm/150nm。在其他实施例中，所述铬/金合金层的厚度还可以为1nm/100nm、1.25nm/125nm、1.75nm/175nm、2nm/200nm等。
S22：在所述电极材料层4表面形成聚合物封装层5。
本步骤中，在所述电极材料层4表面旋涂并固化聚酰亚胺作为聚合物封装层5。当然，所述聚合物封装层5还可以选择其他合适的材料，在此不做限制。
作为示例，所述聚合物封装层5的厚度为1-3μm。在本实施例中，所述聚合物封装层5的厚度为2μm。在其他实施例中，所述聚合物封装层5的厚度还可以为1μm、1.5μm、2.5μm、3μm等。
S3：制备蚕丝蛋白功能层6。
本步骤中，先将6-7wt％的蚕丝蛋白水溶液旋涂在所述聚合物封装层5上，静置过夜干燥，然后用70％(v/v)的甲醇处理2min，最终得到厚度为1-2μm的蚕丝蛋白功能层6。所述蚕丝蛋白功能层6可以充当掩膜版以及药物释放载体。
在本实施例中，所述蚕丝蛋白水溶液采用包含7wt％蚕丝蛋白的水溶液。在其他实施例中，所述蚕丝蛋白水溶液还可以采用包含6wt％、6.25wt％、6.5wt％、6.75wt％蚕丝蛋白的水溶液。
本步骤中，所述蚕丝蛋白水溶液的制备过程如下：将蚕茧在0.02M Na2CO3水溶液中煮沸30min，用蒸馏水冲洗3次(每次30min)以去除Na2CO3和丝胶蛋白。脱胶后的茧在空气中干燥12h后，将其溶于9.3M LiBr溶液，并在60℃下溶解4h。使用Slide-A-Lyzer透析盒在蒸馏水中透析2d。随后，以18000rpm的转速离心2次，每次离心20min。通过测量溶液的体积和最终干重，确定最终蚕丝蛋白水溶液的浓度约为6-7wt％。
S4：制备铝掩膜层7。
本步骤中，在所述蚕丝蛋白功能层6表面溅射沉积一层铝，并通过紫外光刻工艺和铝腐蚀工艺进行第一次光刻图形化制备得到铝掩膜层7。
在本实施例中，所述紫外光刻工艺所采用的光刻胶为LC100A。在其他实施例中，所述紫外光刻工艺所采用的光刻胶还可以为其他合适的光刻胶，在此不做限制。
作为示例，所述光刻胶的厚度为1-3μm。在本实施例中，所述光刻胶的厚度为2μm。在其他实施例中，所述光刻胶的厚度还可以为1μm、1.5μm、2.5μm、3μm等。
在本实施例中，所述铝腐蚀工艺采用体积比为6:1的1.3wt％NH4F溶液和1.6wt％HF溶液混合制成的缓冲氢氟酸溶液。在其他实施例中，所述铝腐蚀工艺还可以采用其他合适的酸性腐蚀溶液，在此不做限制。
作为示例，所述铝掩膜层7的厚度为200-400nm。在本实施例中，所述铝掩膜层7的厚度为300nm。在其他实施例中，所述铝掩膜层7的厚度还可以为200nm、250nm、350nm、400nm等。
S5：制备网格结构8。
本步骤中，在所述牺牲层2上通过微波等离子体工艺刻蚀所述蚕丝蛋白功能层6、所述聚合物封装层5和所述聚合物基底层3制备得到网格结构8。
S6：制备电极位点9和连接位点10。
本步骤中，制备电极位点9和连接位点10的具体过程包括：
S61：在所述铝掩膜层7上进行第二次光刻图形化。
本步骤中，在所述铝掩膜层7上通过紫外光刻工艺和铝腐蚀工艺进行第二次光刻图形化。
在本实施例中，所述紫外光刻工艺所采用的光刻胶为LC100A。在其他实施例中，所述紫外光刻工艺所采用的光刻胶还可以为其他合适的光刻胶，在此不做限制。
作为示例，所述光刻胶的厚度为1-3μm。在本实施例中，所述光刻胶的厚度为2μm。在其他实施例中，所述光刻胶的厚度还可以为1μm、1.5μm、2.5μm、3μm等。
在本实施例中，所述铝腐蚀工艺采用体积比为6:1的1.3wt％NH4F溶液和1.6wt％HF溶液混合制成的缓冲氢氟酸溶液。在其他实施例中，所述铝腐蚀工艺还可以采用其他合适的酸性腐蚀溶液，在此不做限制。
S62：在所述电极材料层4上刻蚀所述蚕丝蛋白功能层6和所述聚合物封装层5，制备得到用于记录皮层脑电信号的电极位点9和用于将记录的皮层脑电信号传输到脑电信号采集设备的连接位点10。
本步骤中，在所述电极材料层4上通过微波等离子体工艺刻蚀所述蚕丝蛋白功能层6和所述聚合物封装层5，制备得到暴露于空气中的电极位点9和连接位点10。所述电极位点9直接与大脑皮层细胞接触记录所产生的皮层脑电信号。所述连接位点10在温度为160-180℃(例如170℃)，压力为0.5-0.7MPa(例如0.6MPa)的条件下通过各向异性导电胶与柔性印刷电路进行电连接，将记录的皮层脑电信号传输到脑电信号采集设备，以实现皮层脑电的实时监测。
S7：制备蚕丝蛋白药物释放载体。
本步骤中，制备蚕丝蛋白药物释放载体的具体过程包括：
S71：在所述铝掩膜层7上进行第三次光刻图形化。
本步骤中，在所述铝掩膜层7上通过紫外光刻工艺和铝腐蚀工艺进行第三次光刻图形化。
在本实施例中，所述紫外光刻工艺所采用的光刻胶为LC100A。在其他实施例中，所述紫外光刻工艺所采用的光刻胶还可以为其他合适的光刻胶，在此不做限制。
作为示例，所述光刻胶的厚度为1-3μm。在本实施例中，所述光刻胶的厚度为2μm。在其他实施例中，所述光刻胶的厚度还可以为1μm、1.5μm、2.5μm、3μm等。
在本实施例中，所述铝腐蚀工艺采用体积比为6:1的1.3wt％NH4F溶液和1.6wt％HF溶液混合制成的缓冲氢氟酸溶液。在其他实施例中，所述铝腐蚀工艺还可以采用其他合适的酸性腐蚀溶液，在此不做限制。
S72：在所述聚合物封装层5上根据预先设计的形状和位置刻蚀所述蚕丝蛋白功能层6，并将刻蚀后的结构浸入含有待加载药物的溶剂制备得到蚕丝蛋白药物释放载体。
本步骤中，在所述聚合物封装层5上根据预先设计的形状和位置通过氧等离子体工艺刻蚀所述蚕丝蛋白功能层6，并用铝腐蚀液腐蚀掉残余铝掩膜层7。将刻蚀后的结构浸入含有待加载药物的溶剂制备得到蚕丝蛋白药物释放载体。
在本实施例中，所述待加载药物可以根据实际需要进行选择，所述溶剂采用去离子水溶液，使得所述待加载药物更易于分散溶解。在其他实施例中，所述溶剂还可以采用其他合适的溶液，在此不做限制。
本步骤中，所述蚕丝蛋白药物释放载体的形状和位置可以根据实际使用需求进行预先设计，能够实现在所述蚕丝蛋白药物释放载体的不同位置上加载药物，有利于研究药物作用于脑皮质连接网络的时空分布特点，也有利于原位评估药物的疾病干预治疗效果。
S8：制备双向皮层脑电极。
本步骤中，释放所述步骤S7所得结构上的牺牲层2，制备得到具有采集皮层脑电信号功能和药物刺激功能的双向皮层脑电极。
在本实施例中，所述网格结构的设计可以使制备的双向皮层脑电极自发地共形贴覆于大脑皮层表面，并且和单层柔性电极的制备具有很好的工艺兼容性，使得稳定且高信号质量的皮层脑电监测可以与活体脑组织手术很好地兼容。
本实施例采用以铝为硬掩膜版的光刻工艺和MEMS工艺融合制备具有采集皮层脑电信号功能和药物刺激功能的双向皮层脑电极，两种工艺兼容性较好，且都具有微米级的加工精度，避免了所述蚕丝蛋白药物释放载体和所述电极位点的位置重叠，从而使得药物刺激作用不会干扰到高质量皮层脑电信号的采集。
下面采用青霉素诱导的癫痫大鼠模型来验证实施例一制备得到的双向皮层脑电极的采集脑电信号和药物刺激的双向功能。
在本实施例中，将释放牺牲层后的皮层脑电极浸没于一定浓度的苯巴比妥溶液中，实现蚕丝蛋白功能层的药物加载，得到具有采集皮层脑电信号功能和药物刺激功能的双向皮层脑电极。通过皮下注射青霉素(2.5μL800U/μL青霉素钠水溶液)诱发大鼠的单灶性癫痫。将上述双向皮层脑电极共形贴覆于大鼠颅内皮质表面，实时动态监测其各个脑区的脑电信号和异常的突发性放电信号。上述双向皮层脑电极检测到癫痫发作伴随的快速脑电信号发放，在如图2所示的皮层脑电功率谱密度(PSD)曲线中，青霉素诱导癫痫情况下0-40Hz的脑电能量分布明显高于静息状态(特别是5-40Hz左右的较高频率)。在上述双向皮层脑电极共形贴覆于大鼠颅内皮质表面并正常采集脑电信号后，蚕丝蛋白药物释放载体开始将苯巴比妥原位刺激于癫痫发作的大脑。图3中同时原位监测到的皮层脑电电压信号表明苯巴比妥被释放后，先前的痫状放电信号明显减弱，说明上述双向皮层脑电极在动态采集皮层脑电信号的同时可以及时可控地进行癫痫的药物干预治疗。加载在丝质基质中的约10毫克苯巴比妥被释放，并直接在脑脊液中扩散到癫痫发作的大鼠的脑组织中，苯巴比妥显著稳定了皮层脑电(ECoG)频谱，癫痫症状得到了有效的抑制，如图4所示。
实施例二
本实施例提供了一种利用实施例一的制备方法制备的双向皮层脑电极。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明采用以铝为硬掩膜版的光刻工艺和MEMS工艺融合制备具有采集皮层脑电信号功能和药物刺激功能的双向皮层脑电极，两种工艺兼容性较好，且都具有微米级的加工精度，避免了蚕丝蛋白药物释放载体和电极位点的位置重叠，从而使得药物刺激作用不会干扰到高质量皮层脑电信号的采集；
2、本发明蚕丝蛋白药物释放载体的形状和位置可以根据实际使用需求进行预先设计，能够实现在蚕丝蛋白药物释放载体的不同位置上加载药物，有利于研究药物作用于脑皮质连接网络的时空分布特点，也有利于原位评估药物的疾病干预治疗效果；
3、本发明可同时原位评估药物分子对多脑区神经放电活动的影响，也可在动态采集皮层脑电信号的同时及时可控地进行相关脑疾病如癫痫的药物干预治疗。
应当注意的是，以上实施例只为解释说明所用，而不应被当成是对本发明所包含内容范围的限制。由于受篇幅限制，发明人仅对较为典型的实施方法进行了描述，但本领域技术人员应当充分认识到本发明可以针对未脱离发明内容主旨的创新点及优点作相关修改，且所有这类修改都应包含在本发明所定义的和等同意义的内容范围之内。
