细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片
技术领域
本发明属于微流控芯片技术中的细胞转染与细胞分离领域，具体涉及一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片。
背景技术
转染，是将外源的生物大分子导入细胞的技术。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学研究中，其应用越来越广泛。近年来转染方法迅速发展并表现出多样性，其具体可细分为三类：即生物学方法、化学方法、物理方法。相比于生物学方法在安全性、化学方法对细胞选择性等方面的局限，物理方法不需要载体和其他化学物质的介导，适用的细胞种类更加丰富，因此得到了广泛的研究和应用。本专利主要采用物理方法中的电穿孔法进行细胞转染，常用的物理方法还包括：超声穿孔法、显微注射法、基因枪法、激光转染法等。早在二十世纪五十年代Weaver等学者就发现了电穿孔现象，电穿孔法通过电场作用瞬时提高了细胞膜的通透性，从而将难以穿透细胞膜的大分子转入细胞，较其它转染技术具有毒性小，成本低，效率高等特点。随着微机电系统技术与生命科学、分析科学等学科的交叉深入研究，微流控电穿孔芯片逐步成为人们的研究热点，大量的前人研究如Lin等人设计的金平板电极细胞转染微流控芯片、He等人设计的共面电极细胞转染微流控芯片表明电穿孔微流控芯片较传统电穿孔设备具有聚焦电场、降低所需的电压、简化装置等优点。但细胞经过电穿孔微流控芯片时仍然会受到电击、剪切力、气泡的影响，受到不同程度的损伤。为了解决成功转染的活细胞的收集效率问题，便于对转染结果的分析研究，引入细胞分离技术是一个切实可靠的方法。
细胞分离作为一个重要的纯化过程，在生物研究和分析诊断中有着不可替代的重要作用。目前使用最广泛的细胞筛选方法是流式细胞分析技术。但是流式细胞仪系统复杂、体积庞大，检测过程依赖于昂贵的生化及光学检测设备，还需要专业人员操作。随着微流控的理论逐渐成熟和微流控芯片加工技术的飞速发展，细胞分离技术正在朝着更精细的操作方式发展。目前基于微流控芯片的细胞分离方式主要分为免疫捕获细胞分离和无标签细胞分离，免疫捕获细胞分离指的是在细胞抗体上进行标定,利用抗体与特异性抗原的结合特异性来作为筛选细胞的方法。这种方法的优点是特异性强，所得的细胞纯度较高；但其缺点在于捕获的细胞表面多带有抗体或其他标记荧光等，这不仅改变了细胞的生理状态，而且使得捕获的细胞难以释放，不利于后续细胞的培养和状态性质的进一步观察研究。无标签细胞分离是通过外加的水力场、声场、电场等环境，根据细胞自身物理形态或利用黏附分子等对细胞表面施加瞬间作用力，使不同细胞在微流控通道所受外力不同，从而达到细胞分离的目的。水力场细胞分离方法对流道阻塞十分敏感，需要严格控制样品的细胞浓度；而声场器件可使用的材料种类有限且微加工工艺复杂，成本较高。相比之下，微流控介电泳细胞分离利用不同种类细胞在介电特性方面的差异来控制其在非均匀电场中产生不同的运动轨迹以实现细胞分离，同时还具有配置简单易操作、成本低等优势，并且与电穿孔同样基于电学方法实现，更适合与电穿孔技术相结合。
电穿孔芯片中电场和流体力学对细胞活性的不利影响无法完全消除，电穿孔技术与介电泳技术结合，通过介电泳排除受损细胞，使收集的目标细胞的转染效率和细胞活力均达到较高水平。微流控芯片最大的特点之一集成化，为电穿孔技术与介电泳技术的结合提供了可能，它可以将生物和化学等领域中所涉及的样品反应、制备、分离和检测等基本功能集成到一块芯片上。而利用微流控技术把细胞转染技术与细胞分离技术集合在一个芯片，少有前例，目前唯一相关的公开技术为Zhihong Li等人设计的使用溅射与刻蚀技术制作的平行金属电极，倒模技术制作的聚二甲基硅氧烷材料微流体通道，与玻璃基板对其粘合而成的微流控芯片，在芯片前段电穿孔部分施加较高电场获得较大的转染效率，再通过介电泳部分分选出活细胞，最终得到了成功转染的活细胞。但是该设计存在以下局限性：首先，金属薄膜电极的使用会导致电场不均匀，影响电穿孔转染效率；其次，电穿孔与活细胞分选两功能模块的芯片设计，不仅增加了芯片长度，而且分别控制电穿孔与介电泳，导致在一个芯片上需要施加两个电信号，增加了操作复杂度。第三，该芯片的电极与流道是采用不同材料分别加工而成，工艺复杂且成本昂贵。区别于现有技术，本专利的以导电聚合物材料如AgPDMS、C-PDMS等构造的三维梯状结构的侧壁结构可同时作为电极和流道，且该结构通过软光刻倒膜工艺制备，使流道与电极结构一次成型，不存在分别加工的问题，简化了工艺并降低了成本。三维梯状结构侧壁电极的设计，不仅能够为细胞电穿孔提供更加均匀的电场，而且实现了电穿孔与介电泳分选电极共用，从而使电穿孔与介电泳能够同步进行，无需单独设计电穿孔与介电泳细胞分选分模块，加快了转染与分选的整体进程，提高了芯片的集成度，使用统一的电信号，简化了设备和实验操作。
发明内容
针对现有技术的局限，本发明的目的是提供一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片，采用两层梯状结构的侧壁电极作为微流道边界，允许电穿孔细胞转染与介电泳筛选活细胞同步进行。在流道中活细胞容易产生较大的正介电力进而可以被吸附在上层同时受到电脉冲刺激实现细胞转染，死细胞则受到负介电力被限制在下层，从而实现活死细胞分离，解决了电穿孔造成的细胞活性较低的缺陷。芯片加工采用软光刻倒膜工艺，由聚二甲基硅氧烷材料填充SU-8模具，使流道与电极结构一次成型，倒膜之后形成该微流控芯片，成本低，加工流程简单。
本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片，在结构从上到下依次包括：顶层(1)、电穿孔-介电泳功能层(2)、底层(3)。
顶层(1)作为电穿孔-介电泳功能层(2)的顶部，设有五个孔，分别为一个样品入口(4)、一个鞘流入口(5)以及一个目标细胞出口(6)和两个废弃细胞出口(7)；
电穿孔-介电泳功能层(2)由流道(11)和分别位于流道(11)两侧的一对侧壁电极(12)构成，侧壁电极(12)整体为双层平板式结构，一对侧壁电极(12)对称放置，形成与顶层(1)平行的电穿孔-介电泳功能层(2)；流道(11)与顶层(1)通过出入口连通；
两侧壁电极(12)之间形成长直空隙即为流道(11)，两侧壁电极(12)关于流道(11)对称；并且在流道(11)两侧边对应的任何一侧壁电极(12)侧壁为双层结构，在纵向上即深度方向呈倒阶梯状的双层结构，上层(8)相对于下层(9)向流道内伸出，因而将流道限定为上层窄下层宽的结构；电穿孔-介电泳功能层(2)沿流道(11)内流体流动方向依次分为流入区(14)、主流道(15)、收集区(16)，同时在流入区(14)前端和收集区(16)后端预留一段形成一对隔离沟道(13)；电穿孔-介电泳功能层(2)在流入区(14)入口处设有功能层样品入口(4’)，自功能层样品入口(4’)向两侧壁电极(12)各延伸出一条第一分流道(17)，然后第一分流道(17)再与流入区(14)末尾处的流道(11)连通，流道(11)与第一分流道(17)末端连通处为只有下层(9)连通而上层(8)不连通，从而形成桥状结构(10)；流入区(14)还设有一个功能层鞘流入口(5’)，功能层鞘流入口(5’)后面连接的流入区(14)流道(11)部分记为第二分流道(18)，流入区(14)与收集区中间的一段流道(11)即为主流道(15)；功能层鞘流入口(5’)连接的第二分流道(18)与主流道(15)直连；主流道(15)在纵向上即深度方向被倒阶梯状的双层电极限制为处于上层窄的强电场区和下层宽的弱电场区；主流道(15)后面的区域为收集区(16)，收集区(16)包括此区域的流道(11)，此区域的流道(11)即为第三分流道(19)，即从主流道(15)直连的一条第三分流道(19)，第三分流道(19)的末尾连接功能层目标细胞出口(6’)；从主流道(15)末尾即第三分流道(19)开始部分的两侧分别对称延伸出一条第四分流道(20)，第四分流道(20)的尾部连接功能层废弃细胞出口(7’)，其中在主流道(15)与第四分流道(20)的连接分叉处仅与主流道(15)下层连通，贯穿整条流道(11)的电极上层阻挡了主流道(15)与两侧第四分流道(20)在上层的连通，并在分叉处形成桥状结构(10)；一对隔离沟道(13)分别连接样品入口(4’)和目标细胞出口(6’)并向外延伸，用绝缘材料(21)填充后，可使一对侧壁电极(12)绝缘。
所述的倒阶梯形状的一对侧壁电极(12)，上层(8)厚度为优选30～40μm，下层(9)厚度优选50～60μm，中间所夹流道(11)上层宽度优选120～150μm，下层宽度优选200～230μm。
功能层样品入口(4’)、功能层鞘流入口(5’)、功能层目标细胞出口(6’)、功能层废弃细胞出口(7’)分别为圆柱空腔，其直径均为大于流道(11)的宽度以及第一分流道(17)宽度和第四分流道(20)宽度；并且分别对应顶层(1)的样品入口(4)、鞘流入口(5)、目标细胞出口(6)、废弃细胞出口(7)。所述的样品入口(4)、鞘流入口(5)以及目标细胞出口(6)和两个废弃细胞出口(7)，孔直径相同，优选1.0～1.2mm。
第一分流道(17)、第四分流道(20)在深度方向上的结构与流道(11)在深度方向上的结构均是上层窄下层宽的结构。
底层(3)作为流道(11)的底部和器件的承载部分。
顶层(1)由透明绝缘材料构成，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)，玻璃；电穿孔-介电泳功能层(2)是由可以进行三维机械加工的导电材料制作的，如银-聚二甲基硅氧烷(Ag-PDMS)、碳-聚二甲基硅氧烷(C-PDMS)、重掺杂硅、金属、碳等。优选Ag-PDMS，C-PDMS，通过低成本倒模工艺加工实现。底层(3)为透明绝缘材料，优选聚二甲基硅氧烷，玻璃。所述的填充隔离沟道(13)的绝缘材料(21)，优选PDMS，树脂。
本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的制备方法，加工流程如图4所示，详细描述如下：
(1)光刻制备模具
光刻是用光刻胶、掩模和紫外光进行微制造，工艺如下:
①清洗硅片；
②使用匀胶机在硅片上旋涂第一层一定厚度的光刻胶(如图4步骤一)；
③在掩模板上制备所需的通道图案；将掩模板放置在硅片上方,紫外光照射旋涂有光刻胶的硅片,光刻胶发生光化学反应(如图4步骤二)；
④使用匀胶机在硅片上旋涂第二层一定厚度的光刻胶(如图4步骤三)；
⑤将掩模板放置在硅片上方,紫外光照射旋涂有光刻胶的硅片,光刻胶发生光化学反应(如图4步骤四)；
⑥用显影液通过显影的化学方法除去未经曝光的光刻胶；将掩模版上的图案精确地复制到光刻胶层上，SU-8模具制作完成(如图4步骤五)；
(2)Ag-PDMS导电聚合物的填充
①清洗过的银粉与PDMS按照17：3的比例均匀混合；
②转移至研钵中充分研磨，研磨至混合物呈膏状整体湿润有光泽；
③取适量Ag-PDMS均匀涂抹在SU-8模具表面，均匀按压使Ag-PDMS尽可能地填充进模具，使用白纸上去除多余的Ag-PDMS。(如图4步骤六)；
④将填充完成的模具在70℃温度下加热三小时；
(3)倒模
①将填充完成的模具放置在大小合适的铝箔纸盒子里，填充有Ag-PDMS的表面朝上，倒入PDMS，高度控制在大约2-3mm；
②在70℃温度下加热三小时，三小时后PDMS固化；
③倒入的PDMS与填充进模具的Ag-PDMS自然键合成为一体，将这一整体从模具中轻轻脱模出来(如图4步骤七)；
(4)基底键合
①将上一步得到的器件有流道结构的表面朝上，在出入口的地方自上至下打孔，使流道能够与外界联通；
②对打孔后的器件进行异丙醇超声清洗，去离子水冲洗，氮气吹干，加热去除水分后保持器件洁净；
③使用匀胶机在玻璃表面旋涂一层PDMS，把旋涂后玻璃片放在加热板上70℃加热10分钟，玻璃表面PDMS半干后，将洁净器件有流道结构的表面和玻璃片接触，并轻轻按压，获得半完成的芯片(如图4步骤八)。隔离沟道(13)用少量半固化绝缘材料(21)填充(如图5)；
(5)组装。将芯片侧面电极部分的PDMS切割至露出电极，电极通过银胶(22)与导线(23)相连(如图6)；
所述的一对侧壁电极(12)，当其由导电聚合物通过倒模工艺加工而成时，为避免模具上填充侧壁电极(12)的大面积的浅槽在填充时难以填充完整，增加填充成功率，可优化模具图案，将模具原来用于填充侧壁电极的大面积浅槽图案改进成分隔的网格型填充槽。填充后倒模的侧壁电极呈现网格型状(24)，网格形状仍然具有彼此的电学导通性，同时易于加工时的填充。
本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片，其分离细胞的原理如图8所示，具体描述如下：
样品自样品入口(4)由下层(9)进入流道，同时缓冲溶液自鞘流入口(5)由上层(8)进入流道，缓冲溶液将样品限制在流道(11)两侧边缘部分；样品中受负介电力或弱正介电力的细胞被限制在下层(9)，样品中受强正介电力的细胞被吸附在上层(8)，受强正介电力的细胞在上层(8)同时受到电穿孔作用，因电穿孔作用而降低活性的细胞掉落在下层(9)，下层(9)中的细胞被鞘流的限制作用，限制在流道(11)两侧边缘部分，途经桥型结构(10)由废弃细胞出口(7)排出。而上层(8)中的细胞也受到鞘流的限制作用但由于桥型结构(10)的阻挡作用，沿着主流道由目标细胞出口(6)排出。
转染细胞包括但不限于哺乳动物细胞、细菌等。亦可单独作为细胞分选器件，基于正、负介电力，包括但不限于循环肿瘤细胞(CTC)分选，活细胞提取，血细胞提取，血浆提取等。
进行转染分离的激励信号电压幅值优选600-900V/cm，频率优选100～200kHz。鞘流流速为优选5～10μl/min，样品流流速优选10～20μl/min。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明涉及的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片，通过与电穿孔同步的介电泳分选，筛选转染后的存活细胞以提高细胞活性，克服了通用电穿孔技术细胞活性普遍较低的问题；区别于现有的兼具电穿孔与活细胞分选两功能模块的芯片设计，本发明通过独特的倒阶梯状侧壁电极，允许电穿孔与介电泳细胞分选共用同一模块的设计，实现转染与分选电极共用，使转染与分选得以同步进行，加快了转染与分选的整体进程，具有集成度更高，体积更轻巧的优势，使用统一电信号，简化了设备。并且电穿孔与介电泳均基于电学方法实现，无需生化转染试剂或抗体等标记物辅助，简化了操作、降低了成本，进一步减小了对细胞表面可能造成的改变；本发明的以导电聚合物材料构造的三维倒阶梯状侧壁结构可同时作为电极和流道，且该结构通过软光刻倒膜工艺制备，使流道与电极结构一次成型，简化了工艺并降低了成本。
附图说明
图1为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的整体结构示意图，从上起依次为顶层(1)、电穿孔-介电泳功能层(2)、底层(3)。
图2为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的电穿孔-介电泳功能层(2)的整体结构示意图。
图3为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的电穿孔-介电泳功能层(2)的俯视图。
图4为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的加工流程图。
图5为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的隔离沟道(13)填充示意图，分别为(a)填充前(b)填充后。
图6为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的侧壁电极(12)使用银胶(21)和导线(22)与外接电路连接操作图。
图7为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的电穿孔-介电泳功能层(2)的网格型状(21)电极示意图。
图8为本发明所述的一种细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片的分离细胞原理图。
附图标记如下：1、顶层，2、电穿孔-介电泳功能层，3、底层，4、样品入口，5、鞘流入口，6、目标细胞出口，7、废弃细胞出口，4’、功能层样品入口，5’、功能层鞘流入口，6’、功能层目标细胞出口，7’、功能层废弃细胞出口，8、上层，9、下层，10、桥型结构，11、流道，12，侧壁电极，13、隔离沟道，14、流入区，15、主流道，16、收集区，17,第一分流道，18、第二分流道，19、第三分流道，20、第四分流道，21、绝缘材料，22、银胶，23、导线，24、网格型状。
具体实施方式
本发明所述的一种集电穿孔细胞转染与穿孔存活细胞筛选功能于一体的流式电穿孔微流控芯片，在结构从上到下依次包括：顶层(1)、电穿孔-介电泳功能层(2)、底层(3)。
顶层(1)作为电穿孔-介电泳功能层(2)的顶部，设有五个孔，分别为一个样品入口(4)、一个鞘流入口(5)以及一个目标细胞出口(6)和两个废弃细胞出口(7)；
电穿孔-介电泳功能层(2)由流道(11)和分别位于流道(11)两侧的一对侧壁电极(12)构成，侧壁电极(12)整体为双层平板式结构，一对侧壁电极(12)对称放置，形成与顶层(1)平行的层；流道(11)与顶层(1)通过出入口连通；
电穿孔-介电泳功能层(2)由流道(11)和分别位于流道(11)两侧的一对侧壁电极(12)构成。两侧壁电极(12)之间所夹的长直空隙即为流道(11)，两侧壁电极(12)关于流道(11)对称；并且在流道(11)两侧边对应的任何一侧壁电极(12)侧壁为双层结构，即纵向即深度方向呈倒阶梯状的双层结构，上层(8)相对于下层(9)向流道内伸出，因而将流道限定为上层窄下层宽的结构；电穿孔-介电泳功能层(2)沿流道(11)内流体流动方向依次分为流入区(14)、主流道(15)、收集区(16)，同时在流入区(14)前端和收集区(16)后端预留一段形成一对隔离沟道(13)；电穿孔-介电泳功能层(2)在流入区(14)入口处设有功能层样品入口(4’)，自功能层样品入口(4’)向两侧壁电极(12)各延伸出一条第一分流道(17)，然后第一分流道(17)再与流入区(14)末尾处的流道(11)连通，流道(11)与第一分流道(17)末端连通处为只有下层(9)连通而上层(8)不连通，从而形成桥状结构(10)；流入区(14)还设有一个功能层鞘流入口(5’)，功能层鞘流入口(5’)后面连接的流入区(14)流道(11)部分记为第二分流道(18)，流入区(14)与收集区中间的一段流道(11)即为主流道(15)；功能层鞘流入口(5’)连接的第二分流道(18)与主流道(15)直连；主流道(15)在纵向上即深度方向被倒阶梯状的双层电极限制为处于上层窄的强电场区和下层宽的弱电场区；主流道(15)后面的区域为收集区(16)，收集区(16)包括此区域的流道(11)，此区域的流道(11)即为第三分流道(19)，即从主流道(15)直连的一条第三分流道(19)，第三分流道(19)的末尾连接功能层目标细胞出口(6’)；从主流道(15)末尾即第三分流道(19)开始部分的两侧分别对称延伸出一条第四分流道(20)，第四分流道(20)的尾部连接功能层废弃细胞出口(7’)，其中在主流道(15)与第四分流道(20)的连接分叉处仅与主流道(15)下层连通，贯穿整条流道(11)的电极上层阻挡了主流道(15)与两侧第四分流道(20)在上层的连通，并在分叉处形成桥状结构(10)；一对隔离沟道(13)分别连接样品入口(4’)和目标细胞出口(6’)并向外延伸，用绝缘材料(21)填充后，可使一对侧壁电极(12)绝缘。
所述的倒阶梯形状的一对侧壁电极(12)，上层(8)厚度为优选30～40μm，下层(9)厚度优选50～60μm，中间所夹流道(11)上层宽度优选120～150μm，下层宽度优选200～230μm。
功能层样品入口(4’)、功能层鞘流入口(5’)、功能层目标细胞出口(6’)、功能层废弃细胞出口(7’)分别为圆柱空腔，其直径均为大于流道(11)的宽度以及第一分流道(17)宽度和第四分流道(20)宽度；并且分别对应顶层(1)的样品入口(4)、鞘流入口(5)、目标细胞出口(6)、废弃细胞出口(7)。所述的样品入口(4)、鞘流入口(5)以及目标细胞出口(6)和两个废弃细胞出口(7)，孔直径相同，优选1.0～1.2mm。
第一分流道(17)、第四分流道(20)在深度方向上的结构与流道(11)在深度方向上的结构均是上层窄下层宽的结构。
底层(3)作为流道(11)的底部和器件的承载部分。
顶层(1)由透明绝缘材料构成，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)，玻璃；电穿孔-介电泳功能层(2)是由可以进行三维机械加工的导电材料制作的，如银-聚二甲基硅氧烷(Ag-PDMS)、碳-聚二甲基硅氧烷(C-PDMS)、重掺杂硅、金属、碳等。优选Ag-PDMS，C-PDMS，通过低成本倒模工艺加工实现。底层(3)为透明绝缘材料，优选聚二甲基硅氧烷，玻璃。所述的填充隔离沟道(13)的绝缘材料(21)，优选PDMS，树脂。
本发明所述的一种集电穿孔细胞转染与穿孔存活细胞筛选功能于一体的流式电穿孔微流控芯片的制备方法，加工流程如图4所示，详细描述如下：
(1)光刻制备模具
光刻是用光刻胶、掩模和紫外光进行微制造，工艺如下:
①清洗硅片。
②使用匀胶机在硅片上旋涂第一层一定厚度的光刻胶(如图4步骤一)。
③在掩模板上制备所需的通道图案；将掩模板放置在硅片上方,紫外光照射旋涂有光刻胶的硅片,光刻胶发生光化学反应(如图4步骤二)。
④使用匀胶机在硅片上旋涂第二层一定厚度的光刻胶(如图4步骤三)。
⑤将掩模板放置在硅片上方,紫外光照射旋涂有光刻胶的硅片,光刻胶发生光化学反应(如图4步骤四)；
⑥用显影液通过显影的化学方法除去未经曝光的光刻胶；将掩模版上的图案精确地复制到光刻胶层上，SU-8模具制作完成(如图4步骤五)；
(2)Ag-PDMS导电聚合物的填充；
①清洗过的银粉与PDMS按照17：3的比例均匀混合。
②转移至研钵中充分研磨，研磨至混合物呈膏状整体湿润有光泽。
③挑取适量膏状的Ag-PDMS均匀涂抹在SU-8模具表面，涂有Ag-PDMS的表面接触白纸，均匀按压使Ag-PDMS尽可能地填充进SU-8模具。在白纸上拖动模具磨去多余的Ag-PDMS，使模具的空白区域填满Ag-PDMS，而模具上突出来的部分没有Ag-PDMS且与填充的Ag-PDMS表面平齐(如图4步骤六)。
④将填充完成的模具在70℃温度下加热三小时。
(3)倒模；
①将填充完成的模具放置在大小合适的铝箔纸盒子里，填充有Ag-PDMS的表面朝上，倒入PDMS，高度控制在大约2-3mm。
②在70℃温度下加热三小时，三小时后PDMS固化。
③倒入的PDMS与填充进模具的Ag-PDMS自然键合成为一体，将这一整体从模具中轻轻脱模出来(如图4步骤七)。
(4)基底键合；
①将上一步得到的器件有流道结构的表面朝上，在出入口的地方自上至下打孔，使流道能够与外界联通。
②对打孔后的器件进行异丙醇超声清洗，去离子水冲洗，氮气吹干，加热去除水分后保持器件洁净。
③使用匀胶机在玻璃表面旋涂一层PDMS，把旋涂后玻璃片放在加热板上70℃加热10分钟，玻璃表面PDMS半干后，将洁净器件有流道结构的表面和玻璃片接触，并轻轻按压，获得半完成的芯片(如图4步骤八)。隔离沟道(13)用少量半固化绝缘材料(21)填充(如图5)。
(5)组装。将芯片侧面电极部分的PDMS切割至露出电极，电极通过银胶(22)与导线(23)相连(如图6)。
所述的一对侧壁电极(12)，当其由导电聚合物通过倒模工艺加工而成时，为避免模具上填充侧壁电极(12)的大面积的浅槽在填充时难以填充完整，增加填充成功率，可优化模具图案，将模具原来用于填充侧壁电极的大面积浅槽图案改进成分隔的网格型填充槽。填充后倒模的侧壁电极呈现网格型状(24)，网格形状仍然具有彼此的电学导通性，同时易于加工时的填充。
实施例
本实施例使用上述实施方式所得的细胞电穿孔转染与活细胞分选同步实现的微流控芯片进行细胞转染与穿孔存活细胞筛选效果测试，具体步骤如下：
(1)配制实验用的缓冲溶液(8mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,and 250mM蔗糖)，另外每毫升缓冲溶液中加入50μl碘化丙啶(PI)作为递送溶液；
(2)测试芯片。
①将缓冲溶液通入芯片中，检查芯片的密闭性。
②连接电路，通过观察电压，检查芯片的电学特性。
(3)收取细胞
①丢弃培养器皿中的旧培养液；
②用10ml磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)冲洗并丢弃；
③加入2ml胰蛋白酶，轻轻摇动，放入细胞培养箱6分钟。
④加入5ml培养液，共7ml细胞液转移到15ml试管中，试管放入离心机中，以1500转/分钟的速度离心2分钟。
⑤离心后，丢弃上清液，在试管中加入8ml培养液，反复吹打分散。
(4)染色；每毫升细胞液加入2μl钙黄绿素(Calcein)，染色十分钟。
(5)将用Calcein染色的细胞离心两次，弃上清液，置于递送溶液中，以20μl/min的速度注入芯片。同时给芯片施加频率为100kHz的正弦信号，通过调整电压来使电场保持在700V/cm。
(6)在显微镜下观察细胞的运动轨迹，分别收集通过芯片的细胞，取30μl置于载玻片上观察转染效果，并拍照记录数据。
一般，在未输入电信号时，细胞分散地悬浮在流道中间。输入电信号后，受强正介电力作用的细胞被吸附到上层，排列在上层的流道两侧，由目标细胞出口排出。受弱正介电力作用和负介电力作用的细胞被吸附到下层的流道两侧，由废弃细胞出口排出。由目标细胞出口排出的细胞为活细胞且转染效果明显，由废弃细胞出口排出的细胞为死细胞。说明使用上述实施方式所得的微流控芯片可以实现细胞转染与穿孔存活细胞筛选。
