嗜热吸水链霉菌cDNA文库构建及两种大棚肺致病抗原多肽的表达和表达方法
技术领域t
本发明属于生物检测领域，具体涉及到嗜热吸水链霉菌cDNA文库的构建、表达序列标签（EST）测序，通过生物信息手段获得引起机体过敏反应的两种致病基因，筛选具有毒力作用的两种致病基因进行体外克隆并诱导两种大棚肺致病抗原多肽的表达，为后续开发新的农民肺诊断方法提供理论和实践依据。t
背景技术t
1.农民肺疾病发病及检测现状t
农民肺（Farmer’s lung disease）是因吸入具有抗原性的有机粉尘（如霉变枯草或其他霉变植物粉尘等）而引起一种外源性变态反应性肺泡炎，通常在暴露于各种发霉植物的农民中发病，故称之为“农民肺”。 其主要临床表现为咳嗽、呼吸困难、乏力、全身肌肉酸痛等，并可引发不同程度的心、肺功能障碍，重症患者甚至可因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。农民肺已经成为一种严重妨碍广大农民健康、影响劳动力的职业病，应给予高度重视。大棚作业农民肺----简称“大棚肺”，即为暴露于温室大棚环境内的一种农民肺，由于大棚种植方式不受气候因素的影响，且能有效提高土地利用率、增加土地产值、提高农民收入，在农村地区颇受农民的欢迎，已经成为我国农业经济的重要组成部分，但与此同时，大棚肺患病率与日俱增，对我国东北部分地区从事蔬菜、花卉、蘑菇大棚作业农民的大棚肺流行病学进行调查，其结果显示：我国东北地区大棚肺的患病率约为5.7%，其患病与多种因素有关。考虑到我国庞大的大棚从业农民数量，大棚肺已成为威胁大棚从业农民呼吸系统的主要疾病之一。t
农民肺按病理改变可分为支气管血管周围单核细胞浸润的急性期、肉芽肿形成的亚急性期、最终发展成为肺纤维化病变的慢性持续期。急性期、亚急性期大棚肺临床症状无特异性，需结合病史以及短时间内重复性进行血清生化学、肺功能、CT等检查才能确诊。因基层医院医生对大棚肺认知不足，常被误诊为普通感冒、哮喘等延误了最佳治疗时机，导致大棚肺患者反复入院，诊疗成本增加，加重了患病农民的经济负担和相应的社会负担。因此，临床上迫切需要一种快速、敏感、特异的用于大棚肺急性期、亚急性期的快速筛查及辅助诊断的检查方法，做到大棚肺的早期防治，解决患大棚肺农民“看病难、看病贵”的问题，减少大棚肺的患病率。t
2.cDNA文库的构建及嗜热吸水链霉菌在农民肺疾病诊断治疗中的重要作用t
从1976年Hofstetter成功的构建了第一个cDNA文库以来，cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一，通过构建cDNA文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，通过对遗传信息的功能注释可以对农作物进行遗传改良、对家畜进行品种优化，也是分析真菌基因表达图谱、功能和结构的重要资源，同时通过构建肿瘤组织的cDNA文库并获得大量的相关肿瘤抗原，将为肿瘤的治疗提供新的思路。全长cDNA文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的重要方法之一，有助于鉴定其基因组序列中的外显子及内含子的边界，可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。t
引起农民肺的病原体主要是嗜热放线菌，其中嗜热吸水链霉菌是我国农民肺的主要病原菌，放线菌孢子作为一种外源性物质具有抗原性，被患者吸入体内后引发免疫反应，当再次吸入抗原后，抗原抗体在体内形成免疫复合物并沉积于肺部，引起炎症反应，放线菌表面特异性抗原可能是引起农民肺的重要因素之一，同时，机体过敏反应可能与菌体表面致毒性物质有较大关系。我们通过构建嗜热吸水链霉菌的cDNA文库，通过生物信息手段获得引起机体过敏反应的两种致病基因，并将该致病基因进行体外表达，以期为农民肺的血清学检验奠定基础。t
发明内容t
本发明目的是：构建嗜热吸水链霉菌cDNA文库及两种大棚肺致病抗原多肽的表达和表达方法。t
本发明技术方案的理论基础：t
（1）引起农民肺的病原体主要是嗜热放线菌，其中嗜热吸水链霉菌是我国农民肺的主要病原菌。t
（2）cDNA文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的重要方法之一，高质量的cDNA文库在生物保护、遗传育种、病原诊断及肿瘤治疗等方面起有重要作用。t
本发明的技术方案是：t
构建的嗜热吸水链霉菌cDNA文库是，得到有义序列978个，获得单一基因347个，其中2段基因中的一段基因与胸膜肺炎放线菌外膜蛋白的同源性为51%，其开放阅读框(ORF)长度为1554 bp和，编码517个氨基酸；另一段基因与转铁蛋白B的同源性为42%，其开放阅读框(ORF)长度为726 bp，编码241个氨基酸。t
所说的从中筛选出具有毒力作用的基因进行体外克隆并诱导表达是，将所说的2段基因亚克隆入原核表达载体中，IPTG诱导表达产物的相对分子质量分别为63 000和30 000多肽。t
嗜热吸水链霉菌cDNA文库构建及两种大棚肺致病抗原多肽的表达和表达方法包括下列步骤是：t
1、嗜热吸水链霉菌cDNA文库的构建t
采用TRIZOL进行嗜热吸水链霉菌总RNA的提取并经OligotexTMmRNA 纯化试剂盒纯化为mRNA；利用多聚腺嘌呤脱氧核苷（PolyA）聚合酶进行3’末端加尾，按照SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒说明书合成双链cDNA；产物经蛋白酶K处理后用sfiI酶切，过吸附柱CHROMA SPIN-400进行分级，分离后的cDNA连入（λTriplEx2）载体中，噬菌体包装蛋白进行包装构成cDNA原始文库并以大肠杆菌XL-1 Blue为受体菌扩增文库。t
2、cDNA文库质量及插入片段鉴定t
将原始及扩增文库稀释成不同倍数于溶菌肉汤（LB）平板上培养过夜；文库滴度（PFU/ml）=噬菌斑数×稀释倍数×103/所用稀释文库液体积（μl）；向噬菌体与大肠杆菌XL1-Blue混合液的上层琼脂中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）培养过夜，进行蓝白斑筛选，重组率（%）=白斑/（白斑+蓝斑）；根据λTriplEx2多克隆位点序列设计引物（5’端：5'-GCCATTGTGTTGGTACCC-3'，3’端：5'-TAATACGACTGACTATAGGGC-3'），将LB/四环素琼脂平板平均分成8个扇形区域，每个区域选取3个共24个独立的噬菌斑进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定；反应结束后取10 μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。t
3、EST测序及序列分析t
将构建好的啫热吸水链霉菌cDNA文库中的全部克隆进行编号，取前1020编号的克隆，提取质粒，PCR鉴定，将含插入片段的克隆委托生工生物工程（上海）有限公司进行5’端测序，测序引物为质粒通用引物；对获得的表达序列标签（EST）序列按照以下步骤进行分析，利用Cross match及repeat masker软件去除载体片段、短于100 bp的序列及污染序列，得到高质量的EST数据集；利用聚类比对工具对以上数据进行聚类分析，降低数据冗余性；使用phrap软件对聚类后的集群进行拼接，得到一致性序列；将得到的一致性序列与SwissProt数据库进行同源比对、功能注释，根据功能注释在基因功能预测（GO）分类数据库中进行功能分类描述；利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上的相似性比较工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），对于相似度可靠性评价值（E值）< 0.1，同源性>30%的基因提取注释信息，进一步利用DNAMAN6.0软件进行氨基酸翻译及序列比对，从中筛选引起机体过敏反应的两种致病基因。t
4、目的基因的体外表达t
针对目的基因设计转铁蛋白B引物，上游引物：CGAGCTCGCATGCCGCCCCCGTGG，下游引物：TTGCGGCCGCAATCAAAGGCAAGAAAAGTGG；外膜蛋白引物，上游引物：CGGATCCGATGGCCATTGGCGAACATCG，下游引物：TTGCGGCCGCAATCACGTCCGGATCC；构建表达载体，PCR扩增目的基因，双酶切回收目的片段连接入pET-28a载体并转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定重组子，挑取含有目的片段的单克隆测序；将阳性重组子转化入BL21(DE3) 大肠杆菌并接种于含卡那霉素的LB平板培养过夜；挑取活化的单菌落在LB液体培养基中扩增培养，600 nm处吸光度值达1.5左右时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度达1 mmol/L，诱导4 h；超声波破碎菌体，离心收集上清，混入上样缓冲液，沸水浴加热5 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，考马斯亮蓝G250染色，冰醋酸脱色后，凝胶成像系统拍照保存。t
本发明的有益效果：t
1.cDNA文库质量及插入片段长度分析t
经琼脂糖凝胶电泳检测，合成的双链DNA弥散范围为250～2000 bp。原始cDNA文库及扩增文库滴度分别为5.6×105 PFU/ml和6.2×105 PFU/ml。蓝白斑筛选法计算得到文库的重组率为96.3%。构建原始cDNA文库后随机挑选24个单克隆进行PCR检测，结果显示，所挑取克隆均含有重组片段，其大小为500～4000 bp。t
2.嗜热吸水链霉菌cDNA文库的EST序列分析t
1020个克隆的序列已测定完成，得到有义序列978个，长度为500～2000 bp，平均为495 bp，对其进行聚类分析及拼接，获得347个单一基因，分别与美国国立生物技术信息中心网站的核酸序列及SwissProt蛋白数据库进行同源比对（E值<0.1），相似度高于30%者提取注释信息，同时进行基因功能预测（表1）。对获得的EST序列进行功能分类，发现有2段基因与报道的猪胸膜肺炎放线菌外膜蛋白及转铁蛋白B具有较高的同源性，推测其可能与嗜热吸水链霉菌引起的免疫反应有关。利用DNAMAN6.0软件将这2条基因翻译成2条完整的氨基酸序列，并分别定名为ST-omlA和ST-tbpB。其开放阅读框长度分别为1554 bp和726 bp，分别编码517和241个氨基酸，序列分析结果分别与胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白（GenBank登录号：AY278560.1）以及转铁蛋白（GenBank登录号：GQ465206.1，GQ465204.1，GQ465205.1）的同源性为51%和42%。t
表1 热吸水链霉菌EST 序列GO分类结果t
3.目的基因的体外表达t
将经PCR鉴定的阳性重组子测序，测序结果用DNAMAN6.0进行序列比对，进一步证明该克隆含有完全正确的目标序列，可以用于体外表达。将阳性克隆载体转入宿主菌后，经IPTG诱导，菌体裂解液10%SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色，结果显示，诱导后两种蛋白均有明显表达，且相对分子质量分别为30 000和63 000，与预期结果基本吻合。t
附图说明t
图1是cDNA文库的构建电泳图谱，图中M：标准参照物；1：双链DNA；2-25：随机挑取的24个克隆。t
图2是发现的外膜蛋白DNA及相应氨基酸序列表，Full-length：全长；ORF：开放阅读框。t
图3是发现的转铁蛋白B DNA及相应氨基酸序列表，Full-length：全长；ORF：开放阅读框。t
图4是免疫相关蛋白序列比对的示意图。t
图5是嗜热吸水链霉菌外膜蛋白和转铁蛋白B的体外表达电泳图谱，1：ST-tbpB表达产物，2：ST-omlA表达产物。t
具体实施方式t
构建的嗜热吸水链霉菌cDNA文库是，得到有义序列978个，获得单一基因347个，其中2段基因中的一段基因与胸膜肺炎放线菌外膜蛋白的同源性为51%，其开放阅读框(ORF)长度为1554 bp和，编码517个氨基酸；另一段基因与转铁蛋白B的同源性为42%，其开放阅读框(ORF)长度为726 bp，编码241个氨基酸。t
两种大棚肺致病抗原多肽的表达是，将所说的2段基因亚克隆入原核表达载体中，IPTG诱导表达产物的相对分子质量分别为63 000和30 000多肽。t
嗜热吸水链霉菌cDNA文库构建及两种大棚肺致病抗原多肽的表达和表达方法包括下列步骤是：t
1、嗜热吸水链霉菌cDNA文库的构建t
采用TRIZOL进行嗜热吸水链霉菌总RNA的提取并经OligotexTMmRNA 纯化试剂盒纯化为mRNA；利用多聚腺嘌呤脱氧核苷（PolyA）聚合酶进行3’末端加尾，按照SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒说明书合成双链cDNA；产物经蛋白酶K处理后用sfiI酶切，过吸附柱CHROMA SPIN-400进行分级，分离后的cDNA连入（λTriplEx2）载体中，噬菌体包装蛋白进行包装构成cDNA原始文库并以大肠杆菌XL-1 Blue为受体菌扩增文库。t
2、cDNA文库质量及插入片段鉴定t
将原始及扩增文库稀释成不同倍数于溶菌肉汤（LB）平板上培养过夜；文库滴度（PFU/ml）=噬菌斑数×稀释倍数×103/所用稀释文库液体积（μl）；向噬菌体与大肠杆菌XL1-Blue混合液的上层琼脂中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）培养过夜，进行蓝白斑筛选，重组率（%）=白斑/（白斑+蓝斑）；根据λTriplEx2多克隆位点序列设计引物（5’端：5'-GCCATTGTGTTGGTACCC-3'，3’端：5'-TAATACGACTGACTATAGGGC-3'），将LB/四环素琼脂平板平均分成8个扇形区域，每个区域选取3个共24个独立的噬菌斑进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定；反应结束后取10 μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。t
3、EST测序及序列分析t
将构建好的啫热吸水链霉菌cDNA文库中的全部克隆进行编号，取前1020编号的克隆，提取质粒，PCR鉴定，将含插入片段的克隆委托生工生物工程（上海）有限公司进行5’端测序，测序引物为质粒通用引物；对获得的表达序列标签（EST）序列按照以下步骤进行分析，利用Cross match及repeat masker软件去除载体片段、短于100 bp的序列及污染序列，得到高质量的EST数据集；利用聚类比对工具对以上数据进行聚类分析，降低数据冗余性；使用phrap软件对聚类后的集群进行拼接，得到一致性序列；将得到的一致性序列与SwissProt数据库进行同源比对、功能注释，根据功能注释在基因功能预测（GO）分类数据库中进行功能分类描述；利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上的相似性比较工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），对于相似度可靠性评价值（E值）< 0.1，同源性>30%的基因提取注释信息，进一步利用DNAMAN6.0软件进行氨基酸翻译及序列比对，从中筛选出引起机体过敏反应的两种致病基因。t
4、目的基因的体外表达t
针对目的基因设计转铁蛋白B引物，上游引物：CGAGCTCGCATGCCGCCCCCGTGG，下游引物：TTGCGGCCGCAATCAAAGGCAAGAAAAGTGG；外膜蛋白引物，上游引物：CGGATCCGATGGCCATTGGCGAACATCG，下游引物：TTGCGGCCGCAATCACGTCCGGATCC；构建表达载体，PCR扩增目的基因，双酶切回收目的片段连接入pET-28a载体并转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定重组子，挑取含有目的片段的单克隆测序；将阳性重组子转化入BL21(DE3) 大肠杆菌并接种于含卡那霉素的LB平板培养过夜；挑取活化的单菌落在LB液体培养基中扩增培养，600 nm处吸光度值达1.5左右时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度达1 mmol/L，诱导4 h；超声波破碎菌体，离心收集上清，混入上样缓冲液，沸水浴加热5 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，考马斯亮蓝G250染色，冰醋酸脱色后，凝胶成像系统拍照保存。t
