一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法

一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法

　　技术领域t

　　本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种可并行检测多种弧菌tt的基因芯片及其检测方法。tt

　　背景技术 tt

　　针对微生物检测的方法有多种，目前较广泛使用的有传统的生理生化tt实验法、免疫抗体检测技术、PCR检测技术等。传统的生理生化实验需tt要对待测样本的菌种分离培养，通过一系列繁琐的生理生化实验的特tt征、结果来甄别菌种，该方法虽然是微生物实验室中一种常用的、经tt典的鉴别方法，但其过程往往需要数天时间、需要耗费较大的人力物tt力、实验得到的表型特征可能受外界环境影响而出错、对于一些非典tt型株系及临近种较难根据表型分辨。特别是对于一些处于“活的不可tt培养状态”（VBNC）的细菌，传统的培养方法难以培养、甄别，这会tt在水产养殖和食品安全领域留下重大隐患。tt

　　PCR检测技术是通过设计特定的引物来大量扩增目的基因片段，根据待tt检测菌种的相关基因信息来鉴定菌种，PCR技术的灵敏度高而且快捷高tt效，特别是随着核酸测序技术的跨越式发展，使得PCR技术的耗费更低tt。但其检测的灵敏度往往受制于琼脂糖凝胶的灵敏度，且同时检测大tt量样本的能力有限，近年来在普通PCR技术的基础上又衍生出多重PCRtt技术能在一定程度上解决这个问题，但仍受限于可扩增的基因种类数tt。tt

　　免疫抗体检测技术特异性和灵敏度较高，但往往单次只能检验单一菌tt种，需要制备抗血清。tt

　　基因芯片技术自上世纪90年代以来进展飞速，其在功能基因组研究中tt作用巨大，随着材料学、机械自动化、全基因组测序等领域的不断发tt展，使得基因芯片在微生物检测领域也得到了越来越多的应用。基因tt芯片的基本原理是通过人工合成目的基因的核苷酸片段，点制于一定tt的载体上（如固相醛基芯片）；提取待测样本的全基因组DNA，通过PttCR等方式扩增目的基因片段，并在这些基因片段上标记荧光物质；将tt之加入芯片上在合适的条件下杂交，同源性高的片段会通过碱基互补tt配对而结合，经过清洗扫描，会在相应的点处出现荧光信号。tt

　　用于微生物检测领域的检测芯片也在原有芯片的基础上得到改进：使tt用的人工合成的寡核苷酸探针，再结合其他改进使得其特异性和灵敏tt度极高；荧光标记方法方式多样，大多使用荧光素Cy3标记的单碱基或tt者随机引物等物质，操作方便、耗费较低；芯片点制、扫描设备的自tt动化、智能化水平也在逐渐提高，tttttt可以大幅缩短检测时间、减少人为误差；芯片的高通量性体现在芯片tt打印密度的提高（目前已能达到每平方厘米打印104个探针），这在环tt境监测、食品检测中的大量、复杂样品的检测方面优势明显。tt

　　本发明的溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的基因芯片tt检测芯片能够实现对复杂样本的并行快捷、高通量、高特异性、高灵tt敏度检测，在此四种病原弧菌的基础上其还具有良好的可扩展性，这tt对于海水环境病原微生物的监控检测具有实际意义。tt

　　发明内容t

　　本发明的目的是提供一种可并行检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏tt弧菌、创伤弧菌的基因芯片及其检测方法，从而弥补现有技术的不足tt。tt

　　已有的基因芯片常常利用编码热休克蛋白的hsp60基因来做为菌株种类tt鉴定靶基因。该基因属于管家基因，其在细菌中广泛存在且具有种特tt异性差异，在当前的细菌分类学中通常被用为种类鉴定、系统发生分tt析的靶标。然而管家基因建立的鉴定探针只能鉴定到病原菌株的种类tt，在复杂的水产养殖环境中，往往同一菌中的不同株系其致病性有无tt、强弱也有差异，因此了解相关毒力基因是否存在具有实际意义。而tt申请人在长期的研究中发现，编码跨膜转录调控蛋白的toxR基因能够tt作为鉴定毒力基因的分子靶标，该基因对于致病菌株的毒素的产生具tt有关键性的调节功能，在致病菌株中也广泛存在。因此，本发明针对tt溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的这两种基因分别选tt取特异性片段设计探针，以保证各个菌种探针只和对应的菌种产生特tt异性信号。tt

　　本发明的一种可并行检测多种弧菌的基因芯片，包括有芯片载体，在tt芯片载体上固定有用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和创tt伤弧菌的核苷酸探针；tt

　　所述的用于检测溶藻弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxRtt基因中设计的；tt

　　所述的用于检测副溶血弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或tottxR基因中设计的；tt

　　所述的用于检测哈维氏弧菌的探针是从溶藻弧菌的toxR基因中设计的tt；tt

　　所述的用于检测创伤弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的。tt

　　所述的用于检测溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的核苷酸探针，tt其序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。tt

　　所述的用于检测副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的核苷酸tt探针，其tttttt序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。tt

　　所述的用于检测创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的核苷酸探针，其tt序列为SEQ ID NO：5。tt

　　所述的用于检测哈维氏弧菌（Vibrio haeveyi）的核苷酸探针，其序tt列为SEQ ID NO：6。tt

　　表1：本发明所用到的探针序列信息tt

　　本发明的芯片上还固定有显示探针坐标位置的阳性质控探针，其核苷tt酸序列为SEQ ID NO：7；而与阳性质控探针杂交的阳性质控片段的tt核苷酸序列为SEQ ID NO：8（表2）。tt

　　表2：阳性质控探针和阳性质控片段的序列信息tt

　　以上所有的探针的5’端均加上氨基进行修饰。tt

　　本发明的基因芯片的制备步骤为：tt

　　将核苷酸探针稀释至适当浓度后，在适当的温度、湿度条件下使用点tt制仪点制探针于固相醛基芯片上；然后将探针与芯片水合交联；洗脱tt去未连接的、连接不紧密的探针，封闭完成制备。tt

　　所述步骤核苷酸探针稀释至适当浓度，是使用缓冲液稀释至浓度为4-tt10 μ mol/L，与0.3M Na2HPO4溶液（pH=8.5）按照1:1的比例混合tt后进行点制。tt

　　所述在适当的温度、湿度条件下使用点制仪点制探针于固相醛基芯片tt上：点样在室温（20℃）、湿度60%-70%的条件下进行。tt

　　 本发明基因芯片用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创tt伤弧菌。tt

　　本发明所述的基因芯片的检测方法，依次包括以下步骤：（1）待检测tt样本核酸的提取；（2）普通或多重PCR扩增反应；（3）PCR产物的回tt收纯化；（4）荧光标记PCR反应；（5）预杂交；（6）杂交；（7）洗tt脱；（8）使用扫描仪扫描，分析结果。tt

　　所述步骤（1）待检测样本核酸的提取：按照DNA提取的方法或者使用tt试剂盒提取待检测样本的全基因组DNA作为模板备用。tt

　　所述步骤（2）的普通或多重PCR扩增体系是：10×PCR reaction bttuffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μttL，Taq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和10μM反向引物各1μL，tt待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且所述PCR反应的条件为：tt94℃ 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；7tt2℃ 7分钟，4℃保存。tt

　　所述步骤（3）PCR产物的回收纯化：按照PCR产物的回收纯化试剂盒的tt操作流程回收。tt

　　所述步骤（4）荧光标记PCR体系及步骤是：（1）预处理： PCR回收tt纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记的随机引物 0.75-1.5μL，双tt蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经95℃变性3分钟，置于冰上冷激tt3分钟；（2）荧光标记：再加入Klenow酶 1μL，Klenow buffer tt2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，荧光标记PCR的条件为：tt37℃ 90分钟，72℃ 10分钟。tt

　　所述步骤（5）、（6）预杂交和杂交：预杂交混合液的配制方法是去tt离子甲酰胺 500mL，50×标准柠檬酸盐溶液 100mL，50× Denharttdt’s溶液 100mL，10%十二烷基硫酸钠50mL，灭菌双蒸水定容至100tt0mL。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。杂交混合液的tt配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 100g。使用前按照1:10tt比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。且杂交液同步骤（4）所述的荧光标tt记产物的添加比例须近似1:1，另需加入10μM阳性质控 1μL。tt

　　所述步骤（7）洗脱中使用的三种洗脱液配制及操作方法：洗脱液Ⅰ为tt1×柠檬酸钠盐溶液和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0tt.2×柠檬酸钠盐tttttt溶液；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前须60℃预热各洗脱tt液，在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分tt钟。tt

　　所述步骤（8）使用扫描仪扫描，分析结果：使用扫描仪扫描出结果，tt可肉眼查看合成的点是否有信号，亦可使用分析软件量化各点的信号tt值。tt

　　本发明在传统基因芯片的基础上经过一系列的优化探索，使得整个样tt品检测时间在24小时内完成，若不算入制备基因芯片的时间则能在12tt小时内完成检测；而且探针特异性能达到100%；芯片能达到识别3.5fttg细菌全基因组DNA（或4 CFU/mL 菌体）的灵敏度水平,这高出PCR检tt测技术、免疫抗体检测技术两个数量级，且已达到国内外基因芯片研tt究中在微生物检测其他领域的灵敏度最高水平；优化的标准操作流程tt尽可能避免人为操作的影响，稳定性更好。总体而言，本发明能够突tt破现有微生物检测技术的种种弊端，实现对海水环境中的病原菌株能tt够实现高通量、高特异性、高灵敏度、高效快捷的检测，对于渔业养tt殖、水产品中病害监测预警具有实际意义。tt

　　附图说明t

　　图1：本发明基因芯片检测溶藻弧菌全基因组DNA梯度浓度的灵敏度曲tt线；tt

　　图2：本发明基因芯片检测溶藻弧菌菌体梯度浓度的灵敏度曲线。tt

　　具体实施方式t

　　1.探针的设计tt

　　本发明的基因芯片用来检测渔业养殖环境、水产品中的溶藻弧菌、副tt溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌。其使用的探针均根据菌种的hsp6tt0和toxR基因的高变区序列设计而成，经过BLAST比对保证其特异性，tt探针序列同其他已公开专利的近似探针的序列比对信息见表3。所使用tt引物、探针由专门的公司商业合成。tt

　　表3. 本发明所申请探针同其他已公开专利的近似探针的序列比对信tt息tt

　　注：近似探针专利公开号：1. CN101475986A;2. CN101475986A;3.tt CN101967510A; 4. CN101967510A; 5. CN101113476A。tt

　　2. 所述基因芯片的构建 ：tt

　　（1）商业合成的寡核苷酸探针稀释至适当浓度：使用1×TE缓冲液稀tt释至浓度为4-10 μmol/L，与0.3M Na2HPO4溶液（pH=8.5）按照1:tt1的比例混合后点制于固态醛基芯片上。在室温（20℃），湿度60%-7tt0%的条件下使用点制仪点制探针于醛基芯片上。tt

　　表4. 本发明的基因芯片探针的一种点样阵列tt

　　

　　（2）探针与芯片水合交联：点制之后需要在37℃湿盒内水合杂交12小tt时。tt

　　（3）水合后芯片处理：使用双蒸水清洗3次，每次2分钟，洗脱去未连tt接的、连接不紧密的探针。使用0.2% NaBH4封闭：使芯片完全浸没，tt静置5分钟后，150 rpm震荡5分钟，再静置5分钟；最后用双蒸水清洗tt3次，每次2分钟。离心去除芯片表面水迹，离心参数：2000rpm，2分tt钟。4℃避光保存备用。tt

　　3. 所述的基因芯片的检测方法tt

　　（1）待检测样本核酸的提取：按照DNA提取的方法或者使用试剂盒提tt取待检测样本（如海水鱼类）的全基因组DNA作为模板备用。tt

　　（2）PCR扩增：普通或多重PCR扩增体系为：10×PCR reaction buttffer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μLtt，Taq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和10μM反向引物各1μL，tt待检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：94℃tt 7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ tt7分钟，4℃保存。tt

　　（3）PCR产物的回收纯化：按照商业化的PCR产物回收纯化试剂盒的操tt作流程回收。tt

　　（4）荧光标记PCR： PCR回收纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记tt的随机引物 0.75-1.5μL，双蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经tt95℃变性3分钟，置于冰上冷激3分钟；再加入Klenow酶 1μL，Klenttow buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，PCR标记的tt条件为：37℃ 90分钟，72℃ 10分钟。tt

　　（5）预杂交：预杂交液的配制方法是去离子甲酰胺 500mL，50×标tt准柠檬tttttt酸盐溶液 100mL，50× Denhardt’s溶液 100mL，10%十二烷基硫tt酸钠50mL，灭菌双蒸水定容至1000mL。使用前按照1:10比例加入100μttg/mL变性鲑精DNA。按照10μL /cm2的比例在已经制备好的基因芯片tt的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时tt。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。tt

　　（6）杂交：杂交液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 1tt00g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。将杂交液同步tt骤（4）所述的荧光标记产物按照近似1:1的比例混合，另需加入10μttM阳性质控 1μL。按照10μL /cm2的比例在已经预杂交好的基因芯tt片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。tt

　　（7）洗脱：使用的三种洗脱液进行洗脱：洗脱液Ⅰ为1×柠檬酸钠盐tt溶液和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐tt溶液；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前须60℃预热各洗脱tt液，在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分tt钟。随后离心甩干水分（2000rpm，2分钟）。tt

　　（8）扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分tt析软件量化各点的信号值。阳性结果有清晰的杂交信号。tt

　　4. 使用基因芯片检测溶藻弧菌tt

　　(1).待检测样本核酸的提取：按照DNA提取的方法或者使用试剂盒提取tt溶藻弧菌的全基因组DNA作为模板备用。tt

　　(2).PCR扩增：普通或多重PCR扩增体系为：10×PCR reaction bufttfer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μL，ttTaq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和10μM反向引物各1μL，待tt检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：94℃ tt7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7tt分钟，4℃保存。tt

　　(3).PCR产物的回收纯化：按照商业化的PCR产物回收纯化试剂盒的操tt作流程回收。tt

　　(4).荧光标记PCR： PCR回收纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记tt的随机引物 0.75-1.5μL，双蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经tt95℃变性3分钟，置于冰上冷激3分钟；再加入Klenow酶 1μL，Klenttow buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，PCR标记的tt条件为：37℃ 90分钟，72℃ 10分钟。tt

　　(5).预杂交：预杂交液的配制方法是去离子甲酰胺 500mL，50×标准tt柠檬tttttt酸盐溶液 100mL，50×Denhardt’s溶液 100mL，10%十二烷基硫酸tt钠50mL，灭菌双蒸水定容至1000mL。使用前按照1:10比例加入100μgtt/mL变性鲑精DNA。按照10μL/cm2的比例在已经制备好的基因芯片的点tt样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时。然tt后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。tt

　　(6).杂交：杂交液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 10tt0g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。将杂交液同步tt骤（4）所述的荧光标记产物按照近似1:1的比例混合，另需加入10μttM阳性质控 1μL。按照10μL /cm2的比例在已经预杂交好的基因芯tt片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。tt

　　(7).洗脱：使用三种洗脱液进行洗脱：洗脱液Ⅰ为1×柠檬酸钠盐溶液tt和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液tt；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前各洗脱液须60℃预热，tt在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分钟。tt随后离心甩干水分（2000rpm，2分钟）。tt

　　(8).扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分tt析软件量化各点的信号值，亦可用肉眼查看打印的点是否有信号。汇tt总点制阵列信息和扫描信息从而确定检测结果。tt

　　(9)本实施例方法的检测结果表明，基因芯片仅对溶藻弧菌的hsp60基tt因和toxR基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；特异性好tt，在其他弧菌的探针处也没有出现非特异性信号。tt

　　5. 使用基因芯片检测副溶血弧菌tt

　　检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片仅对副溶血弧tt菌的hsp60基因和toxR基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况tt；特异性好，在其他弧菌的探针处也没有出现非特异性信号。tt

　　6. 使用基因芯片检测创伤弧菌tt

　　检测方法同实施例4，检测结果表明，基因芯片仅对创伤弧菌的hsp60tt基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；特异性好，在其他tt弧菌的探针处也没有出现非特异性信号。tt

　　7. 使用基因芯片检测哈维氏弧菌tt

　　检测方法同实施例4，检测结果表明，基因芯片仅对哈维氏弧菌的toxttR基因检测出较强的信号值，没有出现假阴性情况；特异性好，在其他tt弧菌的探针tttttt处也没有出现非特异性信号。tt

　　8. 基因芯片的灵敏度检测tt

　　(1).菌体浓度稀释：将经过过夜纯培养、菌体浓度为4.0×1012CFU/mLtt的溶藻弧菌以100倍梯度稀释于1×PBS溶液，依次稀释至4.0 CFU/mLtt，并设置空白对照一组。tt

　　(2).待检测样本核酸的提取：从各稀释组中取1.5 mL菌液，按照DNAtt提取的方法或者使用试剂盒提取各浓度梯度溶藻弧菌的全基因组DNA作tt为模板备用；同时取实施例4（1）中的溶藻弧菌的全基因组DNA，测定tt其全基因组DNA浓度（3.5×108fg/μl），并以100倍梯度稀释于1×TttE溶液，依次稀释至3.5fg/μl，各稀释浓度梯度溶藻弧菌的全基因组ttDNA也作为模板备用。tt

　　(3).PCR扩增：普通或多重PCR扩增体系为：10×PCR reaction bufttfer 2.5μL，25mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTPs mixture 4μL，ttTaq DNA聚合酶 2.5U，10μM正向引物和10μM反向引物各1μL，待tt检样品DNA 1-2μL，双蒸水补足25μL。且PCR反应的条件为：94℃ tt7分钟；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 7tt分钟，4℃保存。tt

　　(4).PCR产物的回收纯化：按照商业化的PCR产物回收纯化试剂盒的操tt作流程回收。tt

　　(5).荧光标记PCR： PCR回收纯化DNA产物5μL， 100μM Cy3标记tt的随机引物 0.75-1.5μL，双蒸水补足19μL，上述混合物于PCR仪经tt95℃变性3分钟，置于冰上冷激3分钟；再加入Klenow酶 1μL，Klenttow buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs mixture 2.5μL，PCR标记的tt条件为：37℃ 90分钟，72℃ 10分钟。tt

　　(6).预杂交：预杂交液的配制方法是去离子甲酰胺 500mL，50×标准tt柠檬酸盐溶液 100mL，50×Denhardt’s溶液 100mL，10%十二烷基tt硫酸钠50mL，灭菌双蒸水定容至1000mL。使用前按照1:10比例加入10tt0μg/mL变性鲑精DNA。按照10μL/cm2的比例在已经制备好的基因芯片tt的点样区加入预杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中预杂交1小时tt。然后取出离心（2000rpm，2分钟）备用。tt

　　(7).杂交：杂交液的配制是在预杂交液的配方中加入硫酸葡聚糖 10tt0g。使用前按照1:10比例加入100μg/mL变性鲑精DNA。将杂交液同步tt骤（4）所述的荧光标记产物按照近似1:1的比例混合，另需加入10μttM阳性质控 1μL。按照10μL /cm2的比例在已经预杂交好的基因芯tt片的点样区加入杂交混合液，盖上盖片，置于60℃湿盒中杂交2小时。tt

　　(8).洗脱：使用三种洗脱液进行洗脱：洗脱液Ⅰ为1×柠檬酸钠盐溶液tt和0.2%十二烷基硫酸钠溶液混合物；洗脱液Ⅱ为0.2×柠檬酸钠盐溶液tt；洗脱液Ⅲ为0.1×柠檬酸钠盐溶液。且洗脱前各洗脱液须60℃预热，tt在42℃、150rpm的条件下依次使用上述三种洗脱液震荡洗脱15分钟。tt随后离心甩干水分（2000rpm，2分钟）。tt

　　(9).扫描芯片，分析结果：使用扫描仪扫描芯片，输出图像。使用分tt析软件量化各点的信号值。汇总点制阵列信息和扫描信息从而确定检tt测结果。tt

　　本实施例方法的检测结果表明，所述芯片能够检测出3.5fg的溶藻弧菌tt全基因组DNA（见附图1）；此外当菌体浓度为4 CFU/mL时，基因芯片tt能够检测出较高的信号值（见附图2）。说明本发明的基因芯片灵敏度tt较高。tt

　　9. 使用基因芯片检测费氏弧菌和灿烂弧菌tt

　　检测方法同实施例4，检测结果扫描图像表明，基因芯片除阳性质控点tt出现杂交信号外，在其他弧菌的探针处均没有出现杂交信号，这表明tt该基因芯片。的探针对近缘弧菌不会产生假阳性结果。tt

　　上述的结果表明，本发明的基因芯片能够灵敏的检测溶藻弧菌、副溶tt血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌。tt