一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片
技术领域t
本发明涉及一种基因诊断芯片，尤其是涉及一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片。t
背景技术t
帕金森病（parkinson’s disease, PD），又称震颤麻痹（paralysis agitans）,是一种常见的神经系统退行性疾病，病理以黑质多巴胺（Dopamine,DA）能神经元的丢失和残存神经元胞体内路易小体（Lewy body,LB）的形成为特点。一般认为帕金森病与遗传、环境、衰老等多种因素有关。随着分子生物学的发展，遗传因素在帕金森病的发病机制中起到的作用越来越受到关注。目前至少定位了18个帕金森病的致病基因位点，并克隆了13个致病基因。从遗传方式看，PD可呈常染色体显性遗传(autosomal dominant prkinson’s disease, AD-PD)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive parkinson’s disease, AR-PD)，一些病例呈散发。通常帕金森病多见于老年人，英国人群中PD发病率为140/十万，约3.6%的PD病人发病年龄小于45岁，称为早发性帕金森病，较晚发性帕金森病人更容易表现出家族聚集性。PD可由不同基因的不同突变引起，因此，找寻及鉴定本病的致病基因不仅是了解、阐明本病发病的必须途径，同时也是建立本病的基因诊断和基因治疗的先决条件。t
由于基因的突变是本病发生的原因之一，从长远看，对突变的鉴定使我们有可能使用纠正突变的基因疗法或其他针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病。迄今为止，PD已发现了13个致病基因， 其中与AD-PD相关的致病基因有7个，分别为SNCA、UCH-L1、LRRK2、GIGYF2、Omi/HTRA2、VPS35、EIF4G1，与AR-PD相关的致病基因有6个，分别为Parkin、PINK1、DJ-1、ATP13A2、PLA2G6、FBX07。这些致病的突变类型包括：错义突变、无义突变、插入突变、缺失突变、剪切位点突变、重排突变、移码突变、大片段缺失等多种类型，而点突变占有很重要的地位。对于基因微突变检测，目前多采用PCR结合DNA直接测序法，结果直观、可靠，但由于PD致病基因多，且很多致病基因序列长，应用PCR结合DNA直接测序法逐个进行基因检测筛查耗时长、耗资大。而目前已知在某些致病基因中可能存在相对常见的突变热点，如国内外报导的Parkin 基因IVS9+18C>T可能为隐性遗传PD的热点突变，如能建立对PD隐性遗传致病基因常见突变热点的基因筛查技术将大大提高PD的基因诊断效率，降低基因检测成本。t
由于帕金森病存在临床异质性及多基因遗传，给基因检测带来巨大困难，且需要耗费相当大的人力和物力。t
发明内容t
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种耗资少，能方便、快速进行筛查的帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片。t
本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是：t
本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片共有96个突变点序列，包含Parkin23个、PINK1 19个、DJ-1 6个、ATP13A2 14个、PLA2G6 25个、FBXO7 9个。t
本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片96个突变点序列的设计步骤：（1）利用pubmed数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和万方数据库（http://www.wanfangdata.com.cn）在线查阅帕金森病隐性遗传致病基因相关文献，检索词分别为“parkinson’s disease OR PD”和“帕金森病 OR PD”，选择帕金森病导致隐性遗传方式各基因中已报导的点突变（错义突变或剪切位点突变）位点，UCSC Genome Bioinformatics网站（http://genome.ucsc.edu）在线查询相应序列，突变点上下游各包含60个碱基，突变位点等位基因用“/”分开（TAG[T/G]ACG），将每个位点编号，输入序列、染色体定位信息，以EXCEL文档保存；（2）将初步选定的点突变位点的序列文档，用芯片设计软件（Asaay Design Tool, ADT）进行评分，得到评分文件，包含设计成功率、最小等位基因频率（minor allele frequencies. MAFs）；（3）合分析各位点评分结果，除去错误序列，选择设计成功率评分大于0.5的位点，进入下一步分析；（3）选择热点突变，选择的突变点，确保两序列之间距离大于60bp，突变点上下游各包含60bp，以避免交叉，影响芯片质量，最终确定96个突变点序列；（4）将SNPs资料交由Illumina公司制备成HSP GoldenGate Universal-32 BeadChips 基因诊断芯片。t
本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针。t
本发明建立起基于这一基因的诊断技术，对临床上可疑隐性遗传帕金森病及散发早发性患者进行确凿的基因水平的诊断，能立即得到较可靠的结果，其早期诊断率将大大提高，从而降低误诊率，有利于治疗。t
本发明可建立PD隐性遗传致病基因常见突变热点的基因筛查技术，将本发明之芯片应用于PD隐性遗传家系病人及散发早发性PD病人突变检测，耗资少，能方便、快速的对PD隐性遗传家系患者及散发早发性PD患者进行筛查，由于有多位点，可以有效地减少因个体差异所引起的漏检。t
附图说明t
图1为 Parkin基因c.850G>C突变位点的基因分型示意图。t
具体实施方式t
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。t
实施例t
本发明之帕金森病基因诊断芯片共有96个突变点序列，均为AR-PD，其中Parkin23个、PINK1 19个、DJ-1 6个、ATP13A2 14个、PLA2G6 25个、FBXO7 9个。t
本发明之帕金森病基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针，所述探针的序列表为：t
检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。t
具体操作方法如下：t
第一天：t
【1】制作SUD板t
1.取一个0.2ml 96孔裙边板,标记为SUD 板，每孔加5μl MS1工作液；t
2.每孔加5μl 浓度为50ng/μl的DNA模板；t
3.盖热盖5秒,盖住96孔SUD 板；t
4.SUD 板250×g，离心1分钟；t
5.2300rpm震荡，20秒，250×g，离心1分钟；t
6.将 SUD 板放入加热箱，95℃，30分钟；t
7.取出SUD 板，250×g 离心1分钟。t
【2】沉淀SUD板t
1.轻轻去掉热盖。t
2.每孔加5μl PS1至SUD 板，盖透明膜。t
3.250×g 离心1分钟，2300rpm震荡20秒，直到溶液均呈蓝色。t
4.去掉透明膜，加15μl 异丙醇至每孔。t
5.盖透明膜，1600rpm震荡20秒，离心3000×g，20分钟，离心后底部应有的蓝色沉淀。t
6.去掉透明膜，倒掉上清，倒置在吸水纸上，吸收过多的上清液，8g倒置离心1分钟。t
7.SUD 板正置室温干燥15 分钟。t
【3】重悬SUD板t
1.每孔加10μlRS1,溶解DNA沉淀。t
2.盖上透明膜，250×g 离心1分钟。t
3.2300rpm震荡1min，直至所有沉淀完全被溶解。t
【4】制作ASE板t
1.SUD 板250×g 离心1分钟。t
2.取新的0.2ml96孔裙边板（ASE板），每孔加OPA10μl，OB1 30μl。t
3.小心去掉SUD 板的透明膜，从SUD 板中每孔取出10μl 加入至ASE 板。t
4.ASE 板盖热盖3秒，离心250×g，1分钟。t
5.震荡ASE 板 1600rpm，1分钟，直到所有的磁珠完全重悬。t
6.将封膜的ASE 板 放入70℃的加热箱，调为30℃，至少2小时，不超过16小时。t
第二天t
【5】加MELt
1.从加热箱中取出ASE 板 250×g 离心1分钟。t
2.将ASE 板放在磁板上，2分钟。t
3.用移液枪去上清50μl，操作不宜太久，磁珠易干，难震起来。t
4.加50μl Am1至每孔，盖透明膜。t
5.1600rpm 震荡20秒，至磁珠完全震起来。t
6.将ASE 板放磁板上2分钟，直到磁珠完全靠在两边。t
7.去上清50μl，加50μl AM1至每孔，盖透明膜。t
8.1600rpm震荡，20秒，至磁珠完全震起来。t
9.将ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。t
10.加AM1 50μl至每孔，盖膜。t
11.1600rpm 震荡20秒，直到把所有磁珠全部震起来为止。t
12.将ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。t
13.将ASE 板从磁板上取出，加UB1 50μl 至每孔。t
14.ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。t
15.将ASE 板从磁板上取出，加UB1 50μl 至每孔。t
16.ASE 板放在磁板上，2分钟，去上清50μl。t
17.将ASE 板从磁板上取出，在ASE 板 中加MEL 37μl，盖透明膜。t
18.1600rpm 震荡1分钟，至磁珠全部震匀。t
19.将ASE 板放在45℃加热箱中，15分钟。t
【6】PCR前期工作t
1.将一个新的裙边板编为PCR板。t
2.MMP管中加64μlDNA聚合。t
3.颠倒试管多次，混合溶液，将其倒入一个可放试剂的容器中。t
4.PCR板中，每孔加混合溶液30μl。t
5.盖上透明膜，250×g 离心1分钟。t
6.将PCR板置于避光区。t
7.将从加热箱中取出ASE 板，放在磁板上，去掉透明膜，去上清。t
8.把ASE 板从磁板上取下，加50μl UB1至每孔。t
9.把ASE 板放在磁板上，约2分钟，去上清50μl。t
10.每孔加35μl IP1，盖膜，1800rpm 震荡，1分钟,95℃加热箱中，1分钟。t
11.取出ASE 板，置磁板上2分钟。t
12.从ASE 板各取30μl上清液至PCR板，盖膜，置PCR仪上做PCR，总体积60μl。t
PCR反应程序：t
【7】PCR产物的结合t
1.从PCR仪上取下PCR板，250×g 离心1分钟。t
2.取20μl MPB至每孔，调移液枪至85μl，上下打匀，将缓冲液与模板充分混匀。t
3.每孔各取70μl 加入至过滤板中，过滤板下面套一个96孔板，盖膜，避光，室温孵育60分钟。t
【8】芯片前样品准备t
1.1000×g离心5分钟，25℃，在96孔过滤板中每孔加50μl UB2，盖盖子。t
2.1000×g离心5分钟，25℃，在96孔过滤板下换一个新的96孔板。t
3.在新的96孔板中，每孔各加30μl MH1。t
4.在96孔过滤板中每孔各加30μl 0.1N NaOH，洗脱DNA。t
5.1000×g 离心5min，25℃。t
6.离心后的过滤下来的液体前后、左右平行轻摇混匀t
7.盖膜，避光，准备芯片上样。t
【9】芯片杂交t
1. 将96孔过滤板过滤下来的样品每个取15μl 加入芯片。t
2. 上好样的芯片放入杂交盒置60℃，30分钟。t
3. 30分钟后调为45℃，至少放置16小时，不能超过18小时。t
第三天t
【10】清洗芯片t
1.将芯片从杂交盒中取出后置PB1中，抽提10次。t
2.提完后放在另一个PB1中，浸泡5分钟。t
3.放入XC4中上下提10次，浸泡5分钟。t
4.干燥0.68bar，50-55分钟。t
【11】芯片扫描及数据读取t
通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪用Illumina BeadScan软件进行芯片扫描。t
打开电脑，打开激光共聚焦微珠芯片扫描仪→用DMAP软件将每张芯片的Barcode文件在Illumina公司的网站上下载下来，并考入扫描用的电脑→双击打开Illumina BeadScan软件→按Edit →激光共聚焦微珠芯片扫描仪会自动打开Tray →把芯片放入激光共聚焦微珠芯片扫描仪的Tray上，用条形码识别器把芯片上的Barcode扫描→按Scan，激光共聚焦微珠芯片扫描仪开始扫描→扫描完毕按Done →关闭Illumina BeadScan软件，关闭激光共聚焦微珠芯片扫描仪，关电脑。t
【12】数据分析 t
通过激光共聚焦微珠芯片扫描仪扫描后得到的芯片结果，用GenomeStudio软件分析。t
双击打开GenomeStudio软件（电脑内存要大于2G）→按Genotyping建立新New Project→按Next→在Projects Repository处选择存储的路径，并建一个新文件的名字，按Next→点击Load sample intensities by selecting directories with intensity files, 按Next→选择.opa文件，选择需要分析的芯片编号Barcode，按Next→点击Import cluster positions from a cluster file，点击Pre-Calculate，按Finish，软件开始分析数据，得到样本基因分型的结果。每个SNP位点在cluster中独立分析，在SNP Graph界面分析每个突变位点的分型，鉴别基因型。芯片上每一个SNP位点的等位基因型被定义为“AA”、“BB”，即样本SNP位点等位基因为纯合型；“AB”为等位基因杂交型（参见图1。图中：左侧椭圆区域点表示基因型为AA，中间椭圆区域点表示基因型为AB，右侧椭圆区域点表示基因型为BB；左侧椭圆区域点为样品M12273的基因分型，提示该患者该突变位点的基因分型为AA。实际实验结果为彩图，左侧椭圆区域为红色点，中间椭圆区域为紫色点，右侧椭圆区域为蓝色点）。 t
序列表t
<110> 中南大学湘雅医院t
<120>一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片t
<160> 96t
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t
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ggctgggccg caggaccggg cgcggagcct cgcagggtcg ggctcgggct ccctaaccgt 60t
ytccgcttct tccgccagtc ggtggccggg ctggcggcgc ggttgcagcg gcagttcgtg 120t
g 121t
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gcggcgcggt tgcagcggca gttcgtggtg cgggcctggg gctgcgcggg cccttgcggc 60t
ygggcagtct ttctggcctt cgggctaggg ctgggcctca tcgaggaaaa acaggcggag 120t
a 121t
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t
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tagggctggg cctcatcgag gaaaaacagg cggagagccg gcgggcggtc tcggcctgtc 60t
mggagatcca ggtgagcggg gccgggtcct aagccgagcg gaggacggag ctaagcgcgg 120t
g 121t
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t
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agatccaggc aatttttacc cagaaaagca agccggggcc tgacccgttg gacacgagac 60t
rcttgcaggg ctttcggctg gaggagtatc tgatagggca gtccattggt aagggctgca 120t
g 121t
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t
<400> 26t
ttgcagggct ttcggctgga ggagtatctg atagggcagt ccattggtaa gggctgcagt 60t
sctgctgtgt atgaagccac catgcctaca ttgccccaga acctggaggt gacaaagagc 120t
a 121t
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gccaccatgcc tacattgccc cagaacctgg aggtgacaaa gagcaccggg ttgcttcca 60t
rggagaggccc aggtaccagt gcaccaggag aagggcagga gcgagctccg ggggcccct 120t
g 121t
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gtaccagtgc accaggagaa gggcaggagc gagctccggg ggcccctgcc ttccccttgg 60t
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t 121t
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ggttccttgt gggtgttcca ggcaggttcc tccagcgaag ccatcttgaa cacaatgagc 60t
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a 121t
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ccaggagctg gtcccagcga gccgagtggc cttggctggg gagtatggag cagtcactta 60t
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t 121t
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gggttctccg cgccttcacc tcttccgtgc cgctgctgcc aggggccctg gtcgactacc 60t
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t 121t
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gatgtgctgc cctcacgcct ccaccctgaa ggcctgggcc atggccggac gctgttcctc 60t
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g 121t
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agtacctttg tgtgaacaca cccagccccc gcctcgccgc catgatgctg ctgcagctgc 60t
yggaaggcgt ggaccatctg gttcaacagg gcatcgcgca cagagacctg aaatccgaca 120t
a 121t
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tggaaggcgt ggaccatctg gttcaacagg gcatcgcgca cagagacctg aaatccgaca 60t
rcatccttgt ggagctggac ccagacggct gcccctggct ggtgatcgca gattttggct 120t
g 121t
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atggtcactt tgcttgctcc ttcccagacg gctgcccctg gctggtgatc gcagattttg 60t
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gctgcctggc tgatgagagc atcggcctgc agttgccctt cagcagctgg tacgtggatc 60t
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g 121t
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ggggcggaaa cggctgtctg atggccccag aggtgtccac ggcccgtcct ggccccaggg 60t
magtgattga ctacagcaag gctgatgcct gggcagtggg agccatcgcc tatgaaatct 120t
t 121t
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acagcaaggc tgatgcctgg gcagtgggag ccatcgccta tgaaatcttc gggcttgtca 60t
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t 121t
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cagggcaagg cccaccttga aagccgcagc taccaagagg ctcagctacc tgcactgccc 60t
ragtcagtgc ctccagacgt gagacagttg gtgagggcac tgctccagcg agaggccagc 120t
a 121t
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ttgggttgag actgtgttaa cagatgttct agctacagct tcccttcctg ttgcagagac 60t
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c 121t
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aatgtgcttc atctaagcct ctggggtgaa catattctag ccctgaagaa tctgaagtta 60t
racaagatgg ttggctggct cctccaacaa tcggccgcca ctttgttggc caacaggctc 120t
a 121t
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ttttttaagg cttgtaaaca tataacataa aaatggcttc caaaagagct ctggtcatcc 60t
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g 121t
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<400> 43t
tcagtgttct taaatatgat aacatctttc tcgtagatta aggtcaccgt tgcaggcctg 60t
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g 121t
<210> 44t
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acagtgtagc cgtgatgtgg tcatttgtcc tgatgccagc cttgaagatg caaaaaaaga 60t
sggaccatat gatgtggtgg ttctaccagg aggtaatctg ggcgcacaga atttatctga 120t
g 121t
<210> 45t
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<400> 45t
tttggttttc ttttcactag tctgctgctg tgaaggagat actgaaggag caggaaaacc 60t
rgaagggcct gatagccgcc atctgtgcag gtgacgtgca ggggcagcct gtgttgcagc 120t
g 121t
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<212> DNAt
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<400> 46t
ctaaagacaa aatgatgaat ggaggtcatt acacctactc tgagaatcgt gtggaaaaag 60t
mcggcctgat tcttacaagc cgggggcctg ggaccagctt cgagtttgcg cttgcaattg 120t
t 121t
<210> 47t
<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 47t
atgcgtgttt tccaggtact tgctgcgaac ccaccacacc tttgttttct gcccccaaca 60t
sgaggctgca tgcacatgaa gtgtccgcag ccccagtgca ggctcgagtg gtgctggaac 120t
t 121t
<210> 48t
<211> 121t
<212> DNAt
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gccggcgatg agcgcgagga gccggcatga gcgcagacag cagccctctc gtgggcagca 60t
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t 121t
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gctgcggtat tacctcttcc agggccagcg ctatatctgg atcgagaccc agcaagcctt 60t
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t 121t
<210> 50t
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t 121t
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tgcatcttcc tcatttcctc catctccatc tgcctgtcgc tgtacaagac cagaaagcaa 60t
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tggctgccct ctctgtcctg gctctcctcg gcaccatcta cagcatcttc atcctctacc 60t
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t 121t
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aacctactga agccgcagac aacgccagtt atccaggctc tgcgaaggac ccgcatccgc 60t
rccgtcatgg tgacagggga caacctgcag acagcggtga ctgtggcccg gggctgtggc 120t
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tgaagcactt ccccaagctg ctgcccaagg tcctggtcca gggcactgtc tttgcccgca 60t
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g 121t
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tcccttgaca cttcgttcag cgtcttcaag tacatggctc tgtacagcct gacccagttc 60t
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a 121t
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c 121t
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gagcagaaga cagagctggt gtgcgagcta cagaagcttc agtactgcgt gggcatgtgc 60t
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ggggcgctgc tcagcgtgcc cgtgctcagc agcctgctgc tgcagatggt cctggtgacc 60t
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cagacaacct gcccaactac gagaacaccg tggtcttctc tctgtccagc ttccagtacc 60t
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t 121t
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<400> 66t
ctcagaaggg gtgtgcggag atgatcatca gcatggacag cagccagatc cacagcaaag 60t
rcccccgtta cggagccagc cccctccact gggccaagaa cgcagagatg gcccgcatgc 120t
t 121t
<210> 67t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 67t
ccgctgcacc tggccatgtc gaaagacaac gtggagatga tcaaggccct catcgtgttc 60t
rgagcagaag tggacacccc gaatgacttt ggggagactc ctacattcct agcctccaaa 120t
a 121t
<210> 68t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 68t
catcccttct ccctggaaag agctcagccc ccaccgatca gcctaaacaa cctagaacta 60t
yaggatctca tgcacatctc acgggcccgg aagccagcgt tcatcctggg ctccatgagg 120t
g 121t
<210> 69t
<211> 121t
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<400> 69t
acctgctgtg cctggatgga ggaggagtga aaggcctcat catcatccag ctcctcatcg 60t
ycatcgagaa ggcctcgggt gtggccacca aggacctgtt tgactgggtg gcgggcacca 120t
g 121t
<210> 70t
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<212> DNAt
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<400> 70t
ccaggcccta cgagtcgggg cccctggagg agttcctgaa gcgggagttt ggggagcaca 60t
ycaagatgac ggacgtcagg aaacccaagg tgatgctgac agggacactg tctgaccggc 120t
a 121t
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<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 71t
ccaaggtgat gctgacaggg acactgtctg accggcagcc ggctgaactc cacctcttcc 60t
rgaactacga tgctccagaa actgtccggg agcctcgttt caaccagaac gttaacctca 120t
g 121t
<210> 72t
<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 72t
ggatgaggtc agtgacacag tgctggtcaa cgccctctgg gagaccgagg tctacatcta 60t
kgagcaccgc gaggagttcc agaagctcat ccagctgctg ctctcaccct gagggtcccc 120t
a 121t
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<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 73t
ctgggcaaga tggtggtgga ctgttgcacg gatccagacg ggcgggctgt ggaccgggca 60t
ygggcctggt gcgagatggt cggcatccag tacttcagat tgaaccccca gctggggacg 120t
g 121t
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<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 74t
cgtttcaacc agaacgttaa cctcaggcct ccagctcagc cctcagacca gctggtgtgg 60t
ygggcggccc gaagcagcgg ggcagctcct acttacttcc gacccaatgg gcgcttcctg 120t
g 121t
<210> 75t
<211> 121t
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caggacctga tccgcaaggg tcaggccaac aaggtgaaga aactctccat cgttgtctcc 60t
stggggacag ggaggtcccc acaagtgcct gtgacctgtg tggatgtctt ccgtcccagc 120t
a 121t
<210> 76t
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<212> DNAt
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<400> 76t
gtcaacccca ggaactcaca gagtggattc cgactcttcc agctggagtt ggaggctgac 60t
rccctagtga atttccatca gtattcttcc cagctgctac ccttctatga gagctcccct 120t
c 121t
<210> 77t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 77t
ggctgacccc gctgcacctg gcctgccagc tggggaagca ggagatggtc cgcgtgctgc 60t
ygctgtgcaa tgctcggtgc aacatcatgg gccccaacgg ctaccccatc cactcggcca 120t
t 121t
<210> 78t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 78t
aagacccccg ttacggagcc agccccctcc actgggccaa gaacgcagag atggcccgca 60t
kgctgctgaa acggggctgc aacgtgaaca gcaccagctc cgcggggaac acggccctgc 120t
a 121t
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<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 79t
tagtgctgct gacccacggg gccaacgcgg atgcccgcgg agagcacggc aacaccccgc 60t
ygcacctggc catgtcgaaa gacaacgtgg agatgatcaa ggccctcatc gtgttcggag 120t
c 121t
<210> 80t
<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 80t
gatctcatgc acatctcacg ggcccggaag ccagcgttca tcctgggctc catgagggac 60t
kagaagcgga cccacgacca cctgctgtgc ctggatggag gaggagtgaa aggcctcatc 120t
a 121t
<210> 81t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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gccctggcca ttctgcacag taagtccatg gcctacatgc gcggcatgta ctttcgcatg 60t
raggatgagg tgttccgggg ctccaggccc tacgagtcgg ggcccctgga ggagttcctg 120t
a 121t
<210> 82t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 82t
gctcctactt acttccgacc caatgggcgc ttcctggacg gtgggctgct ggccaacaac 60t
mccacgctgg atgccatgac cgagatccat gagtacaatc aggacctgat ccgcaagggt 120t
c 121t
<210> 83t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 83t
aagactgttt ttggggccaa ggaactgggc aagatggtgg tggactgttg cacggatcca 60t
sacgggcggg ctgtggaccg ggcacgggcc tggtgcgaga tggtcggcat ccagtacttc 120t
a 121t
<210> 84t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 84t
ccgcacctgg gactgcgtcc tggtcaaccc caggaactca cagagtggat tccgactctt 60t
mcagctggag ttggaggctg acgccctagt gaatttccat cagtattctt cccagctgct 120t
a 121t
<210> 85t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 85t
aacagcacca gctccgcggg gaacacggcc ctgcacgtgg cggtgatgcg caaccgcttc 60t
kactgtgcca tagtgctgct gacccacggg gccaacgcgg atgcccgcgg agagcacggc 120t
a 121t
<210> 86t
<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 86t
tgcagctggg tcgagcgctg ctgctgcgct tcacgggcaa gcccggccgg gcctacggct 60t
wggggcggcc gggcccggcg gcgggctgtg tccgcgggga gcgtccaggc tgggccgcag 120t
g 121t
<210> 87t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 87t
accccacgct ggatgccatg accgagatcc atgagtacaa tcaggacctg atccgcaagg 60t
ktcaggccaa caaggtgaag aaactctcca tcgttgtctc cctggggaca gggaggtccc 120t
c 121t
<210> 88t
<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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<400> 88t
gtttgtcgtg acctctttac tgcttcaaat gacccactcc tgtggaggtt tttatatctg 60t
sgtgattttc gagacaatac tgtcagagtt caagacacag attggaaaga actgtacagg 120t
a 121t
<210> 89t
<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 89t
ctgagaccac gctttgatcc agttggccca cttccaggac ctaaccccat cttgccaggg 60t
ygaggcggcc ccaatgacag atttcccttt agacccagca ggggtcggcc aactgatggc 120t
c 121t
<210> 90t
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<212> DNAt
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ggattgtttc tggggacttg atatgtttga ttcttcaaga tgacattcca gcgcctaata 60t
yaccttcatc cacagattca gagcattctt cactccagaa taatgagcaa ccctctttgg 120t
c 121t
<210> 91t
<211> 121t
<212> DNAt
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tttaaagacc agctggtgta tcctcttctg gcttttaccc gacaagcact gaacctacca 60t
ratgtatttg ggttggtcgt cctcccattg gaactgaaac tacggatctt ccgacttctg 120t
g 121t
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<211> 121t
<212> DNAt
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atttttccct tttcctttgt agacaatact gtcagagttc aagacacaga ttggaaagaa 60t
ktaggtattt ttaaatatta agactaatgt ccataacaca gaaatgacta gtgaattaat 120t
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<210> 93t
<211> 121t
<212> DNAt
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<400> 93t
ctctcacctg tgtgcctttg ggaaacctga ttgttgtaaa tgctacacta aaaatcaaca 60t
rtgagattag aagtgtgaaa agattgcagc tgctaccaga atcttttatt tgcaaagaga 120t
a 121t
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<211> 121t
<212> DNAt
<213> 人类t
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atcagttcac tcattcctgg tcctggggag acgcccagcc agtttcctcc actgagacca 60t
ygctttgatc cagttggccc acttccagga cctaacccca tcttgccagg gcgaggcggc 120t
c 121t
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<212> DNAt
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tctttactgc ttcaaatgac ccactcctgt ggaggttttt atatctgcgt gattttcgag 60t
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a 121t
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<213> 人类t
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<400> 96t
ttcttcactc cagaataatg agcaaccctc tttggccacc agctccaatc agactagcat 60t
rcaggatgaa caaccaagtg attcattcca aggacaggca gcccagtctg gtgtttggaa 120t
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