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双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法

2021-03-23 03:06:40

双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法

　　技术领域tt

　　本发明涉及高通量测序技术领域，具体而言，涉及一种双链接头、其应用及构建末端配tt对DNA文库的方法。tt

　　背景技术tt

　　全基因组De novo测序也称为基因组从头测序，它不依赖于已有的序列信息，直接对某个tt物种的基因组进行测序，并通过生物信息学手段对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的tt基因组图谱。通过对某物种全基因组序列进行系统研究，可以获得该物种基因组和重要的功tt能基因序列信息，解析该物种的进化史，阐明该物种生长发育、重要性状的产生以及适应环tt境的分子机制。tt

　　二代测序出现前，利用一代Sanger测序技术，若干个模式生物如：拟南芥、水稻、小鼠tt和线虫等的全基因组计划也得以完成。然而，这种测序技术速度慢、通量低、成本太过昂贵，tt远远不能满足科学家们对于全面解析众多具有重要科研和经济价值物种的全基因组计划的需tt求。随着454、IIlumina和SOLid等二代测序技术的出现，很多De novo测序项目由二代测序tt技术完成。在上述三种测序平台中，Illumina测序兼具高通量、准确性高、单位数据成本低等tt优点，在短序列拼接组装软件开发成功并广泛应用后，成为动植物基因组测序的首选。以李tt瑞强等为首的技术团队针对IIlumina测序技术开发了软件，开创了将短多长用于动植物基因组tt组装的先河，并利用此技术完成了多个重要基因组的组装，如熊猫基因组、黄瓜基因组、马tt铃薯基因组等。。基于这种二代测序的基因组De novo测序和组装方法，需要获得该物种梯度tt插入片段文库数据：180bp、300bp和500bp小片段文库数据以及2～20K来源于长插入片段两tt端末端配对（mate-paired）的基因组文库进行重叠群（contig）组装和基因组骨架（scaffold）tt拼接，DNA长插入片段的文库。基因组mate-paired DNA文库测序是通过长插入片段文库构tt建并测序，获得基因组中较大跨度段两端的序列。这种从较大跨度两端所获得的序列对较大tt基因组或者复杂基因组的组装和基因组结构变异发掘具有非常重要的作用。构建基因组末端tt配对（mate-paired）DNA文库的关键在于如何将长片段（2K，5K，10K，20K）两端成功实tt现分子内环化，并保证一定的环化效率。常规的mate-paired DNA文库的环化是通过平末端的tt分子内连接的方式连接实现的，这种建库方法不但环化效率低，而且测序后较难有效分辨哪tt些序列为来源于连接位点两端，给后期的基因组的比对和组装带来困难。tt

　　发明内容tt

　　本发明旨在提供一种双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法，以解决现有技tt术中Mate-paired DNA文库的构建方法不但环化效率低，而且测序后较难有效分辨哪些序列来tttttt源于连接位点两端的技术问题。tt

　　根据本发明的一个方面，提供一种双链接头。该双链接头包括接头A和接头B，接头Att和接头B分别包括一个LoxP序列和将LoxP序列同方向地连接到待环化的DNA片段两端的tt辅助序列。tt

　　进一步地，接头A中的LoxP序列为正向LoxP序列，接头A中的辅助序列包括位于正向ttLoxP序列上游的粘性末端，以及位于正向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端，接头A两tt条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且正向LoxP序列的第32位碱基T进行了tt生物素标记；接头B中的LoxP序列为反向LoxP序列，接头B中的辅助序列包括位于反向ttLoxP序列上游的粘性末端，以及位于反向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端，接头B两tt条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且反向LoxP序列的第32位碱基T进行了tt生物素标记。tt

　　进一步地，接头A的碱基序列如图1所示，接头B的碱基序列如图2所示。tt

　　进一步地，双链接头包括：将图1中除正向LoxP序列外的碱基序列经过一个或几个碱基tt的取代和/或缺失和/或添加且具与接头A同样功能的核苷酸序列；以及将图2中除反向LoxPtt序列外的碱基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头B同样功能的tt核苷酸序列。tt

　　根据本发明的另一个方面，提供一种上述双链接头在构建末端配对DNA文库中的应用。tt

　　根据本发明的再一个方面，提供一种构建末端配对DNA文库的方法。该方法包括用于构tt建末端配对DNA文库的DNA片段进行环化的步骤，用于构建末端配对DNA文库的DNAtt片段进行环化的步骤包括：将用于构建末端配对DNA文库的DNA片段与权利要求1至4中tt任一项的双链接头连接，得到连接产物；连接产物中的DNA片段采用Cre重组酶体系进行环tt化。tt

　　进一步地，构建末端配对DNA文库的方法具体包括以下步骤：S1，将基因组DNA用物tt理方式随机破碎，富集用于构建末端配对DNA文库的DNA片段；S2，对步骤S1中富集得tt到的DNA片段进行末端补平，然后末端加dATP，纯化；S3，将步骤S2得到的产物和双链接tt头加入连接体系，进行连接反应；S4，对步骤S3得到的连接产物进行电泳分离，切取目标条tt带，回收纯化；S5，取步骤S4得到的产物采用Cre重组酶体系进行环化；S6，对步骤S5中tt未环化的产物进行消化；S7，对步骤S6中的产物进行破碎，使DNA片段大小集中在350～650bptt之间；S8，利用链霉素亲和磁珠对步骤S7的产物中带有生物素标记接头的序列进行富集；S9，tt对步骤S8的产物进行末端修复，然后末端加dATP；S10，对步骤S9的产物加测序所用接头；ttS11，利用测序引物对步骤S10的产物进行PCR扩增；S12，将步骤S11的产物电泳分离，切tt取350～650bp之间的DNA片段，回收、纯化，得到末端配对DNA文库。tt

　　进一步地，步骤S10中测序所用的接头为illumina测序所用的接头，步骤S11中的测序引tt物为illumina提供的P5和P7。tt

　　进一步地，步骤S5包括，先将步骤S4得到的产物进行定量，然后取200～300ng产物采tt用Cre重组酶体系进行环化。tt

　　进一步地，步骤S9、S10及S11均在磁珠上进行。tt

　　应用本发明的技术方案，基于Cre重组酶/LoxP作用系统特性（当两个LoxP序列位于一tt条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，而切除部分的tt序列将自动成环形状态而实现DNA长片段的环化）设计的双连接头，通过T-A克隆的方式高tt效地连接到用于构建mate-paired DNA文库的DNA片段的两端，然后采用Cre重组酶体系能tt够高效的使用于构建mate-paired DNA文库的DNA片段环化。tt

　　附图说明tt

　　构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实tt施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：tt

　　图1示出了接头A的结构示意图；tt

　　图2示出了接头B的结构示意图；tt

　　图3示出了实施例1中基因组破碎目标大小的条带琼脂糖凝胶电泳图（切胶回收前后）；tt

　　图4示出了实施例1中得到的Mate-paired DNA文库用安捷伦公司的2100生物分析仪tt（Agilent2100bioanalyzer）检测2100检测插入片段分布图；以及tt

　　图5示出了实施例1中得到的Mate-paired DNA文库个性化分析mate-paired DNA文库最tt终插入片段大小（insert-size）分布图。tt

　　具体实施方式tt

　　需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。tt下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。tt

　　为了解决现有技术中Mate-paired DNA文库的构建方法不但环化效率低，而且测序后较难tt有效分辨哪些序列来源于连接位点两端的技术问题，发明人提出了本发明的技术方案。tt

　　根据本发明一种典型的实施方式，提供一种双链接头，该双链接头包括接头A和接头B，tt接头A和接头B分别包括一个LoxP序列和将LoxP序列同方向地连接到待环化的DNA片段tt两端的辅助序列。tt

　　应用本发明的技术方案，基于Cre重组酶/LoxP作用系统特性（当两个LoxP序列位于一tt条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，而切除部分的tt序列将自动成环形状态而实现DNA长片段的环化）设计的双连接头，通过T-A克隆的方式高tt效地连接到用于构建mate-paired DNA文库的DNA片段的两端，然后采用Cre重组酶体系能tttttt够高效的使用于构建mate-paired DNA文库的DNA片段环化。tt

　　而且，应用Cre-LoxP系统构建mate-paired文库，长插入片段两端可通过加入的接头序列tt区分的，即：接头序列的两侧序列一定是长片段来源于两端的序列，解决了测序后较难有效tt分辨哪些序列来源于连接位点两端的技术问题。tt

　　优选的，双链接头包括接头A和接头B，其中，接头A中的LoxP序列为正向LoxP序列，tt接头A中的辅助序列包括位于正向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于正向LoxP序列下游tt的具有突出的3’T末端，接头A两条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且正向ttLoxP序列的第32位碱基T进行了生物素标记；接头B中的LoxP序列为包括反向LoxP序列，tt接头B中的辅助序列包括位于反向LoxP序列上游的粘性末端，以及位于反向LoxP序列下游tt的具有突出的3’T末端，接头B两条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，且反向ttLoxP序列的第32位碱基T进行了生物素标记。tt

　　因为根据本发明具体实施方式的双链接头具有位于正向LoxP序列上游的粘性末端，因此tt可以采用T-A的高效连接体系。待环化的DNA片段末端采用加dATP，一定浓度的接头与目tt标片段可以进行高效的连接。同样，正向LoxP序列下游的具有突出的3’T末端同样是便于tt与DNA片段进行T-A连接。接头A两条链的5’末端第一个碱基分别进行了磷酸化修饰，保tt证连接及环化反应的进行，且正向LoxP序列的第32位碱基T进行了生物素标记，以便于环tt化后续的建库中，将二次破碎后用连霉亲和素磁珠将目标片段富集。tt

　　为了防止修饰的生物素基团影响接头末端的连接（空间占位），尽量靠近粘性末端超出6tt个碱基的范围，因此在第32位的碱基T进行了生物素标记最合适。tt

　　之所以选择用生物素标记，是因为方便建库中采用链霉亲和素磁珠来分离建库过程中环tt化并二次破碎后的生物素化的核酸片段（该片段以接头A或B为界限，两端的序列为来源长tt链DNA的两端）。链霉亲和素和生物素的结合力非常的高（Kd=10-15），因此有非常广泛的应tt用。该磁珠是均一、超顺磁性的直径为2.8μm的磁珠，表面是共价连接的单层（而非多层）tt的重组链霉亲和素，并用BSA封闭。单层的链霉亲和素可以产生最多的生物的结合位点，不tt仅有利于自由生物素的结合，对于生物素化配体的捕获也没有问题。该磁珠具有快速的液相tt反应动力学。正因为链霉亲和素磁珠有独特和特定的表面，因此捕获、分离和下游的操作都tt非常高效。单层可以保证不会有链霉亲和素从磁珠表面掉下来，同时不会有多余的链霉亲和tt素吸附，保证了批次间的一致性，确保试验的结果。tt

　　根据本发明一种典型的实施方式，接头A的碱基序列如图1所示，接头B的碱基序列如tt图2所示。其中，如图1所示的碱基序列如下部分组成：正向和反向链的5’末端P表示第一tt个碱基进行了磷酸化修饰；最大的方框中的序列为正向的LoxP序列，包括8对碱基的方框示tt出了LoxP序列中确定方向的8对碱基，这8对碱基两侧的13个反向重复的碱基为Cre酶的tt结合域，最大的方框中倒数第3个碱基T为生物素修饰的碱基；最大的方框外小方框标记的tt碱基T用于与目标DNA片段进行T-A连接（双链的序列分别为：SEQ ID NO1:5’tt-CGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGT-3’，SEQ ID NO2:3’tt-CCAGCTATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATATGC-5’）。如图2所示的碱基tttttt序列如下部分组成：正向和反向链的5’末端P表示第一个碱基进行了磷酸化修饰；最大的方tt框中的序列为反向的LoxP序列，包括8对碱基的方框示出了LoxP序列中确定方向的8对碱tt基，这8对碱基两侧的13个反向重复的碱基为Cre酶的结合域，最大的方框中倒数第3个碱tt基T为生物素修饰的碱基；最大的方框外小方框标记的碱基T用于与目标DNA片段进行T-Att连接（双链的序列分别为：SEQ ID NO3:5’-ttGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-3’，SEQ ID NO4:3’-ttCCACGTATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATATCG-5’）。tt

　　根据本发明另一种的实施方式，在不改变正/反向LoxP序列下游的具有突出的3’T，正/tt反5’末端磷酸化修饰，以及正反向LoxP序列的第31或32位碱基T进行了生物素标记的原则tt下所做的修改。该双链接头包括将图1中除正向LoxP序列外的碱基序列经过一个或几个碱基tt的取代和/或缺失和/或添加且具与接头A同样功能的核苷酸序列；以及将图2中除反向LoxPtt序列外的碱基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头B同样功能的tt核苷酸序列。tt

　　根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述双链接头在构建mate-paired DNA文库中tt的应用。tt

　　根据本发明一种典型的实施方式，提供一种构建Mate-paired DNA文库的方法。该方法包tt括用于构建Mate-paired DNA文库的DNA片段进行环化的步骤，用于构建Mate-paired DNAtt文库的DNA片段进行环化的步骤包括：将用于构建Mate-paired DNA文库的DNA片段与权tt利要求1至4中任一项的双链接头连接，得到连接产物；连接产物中的DNA片段采用Cre重tt组酶体系进行环化。tt

　　优选的，构建Mate-paired DNA文库的方法具体包括以下步骤：tt

　　S1，将基因组DNA用物理的方式随机破碎，富集用于构建Mate-paired DNA文库的DNAtt片段；tt

　　S2，对步骤S1中富集得到的DNA片段进行末端补平，然后末端加dATP，纯化；tt

　　S3，将步骤S2得到的产物和上述双链接头加入连接体系，进行连接反应；tt

　　S4，对步骤S3得到的连接产物进行电泳分离，切取目标条带，回收纯化；tt

　　S5，取步骤S4得到的产物采用Cre重组酶体系进行环化；tt

　　S6，对步骤S5中未环化的产物进行消化，其中未环化的产物包括了单链DNA和双链ttDNA；tt

　　S7，对步骤S6中的产物进行破碎，使DNA片段大小集中在350～650bp之间；tt

　　S8，利用链霉素亲和磁珠对步骤S7的产物中带有生物素标记接头的序列进行富集；tt

　　S9，对步骤S8的产物进行末端修复，然后末端加dATP；tt

　　S10，对步骤S9的产物加测序所用接头；tt

　　S11，利用测序引物对步骤S10的产物进行PCR扩增；tt

　　S12，将步骤S11的产物电泳分离，切取350～650bp之间的DNA片段，回收、纯化，得tt到Mate-paired DNA文库。tt

　　优选的，步骤S10中测序所用的接头为illumina测序所用的接头，步骤S11中的测序引物tt为illumina提供的P5和P7，使构建的文库可以在IIlumina测序平台上成功测序。tt

　　优选的，步骤S5进一步包括，先将步骤S4得到的产物进行定量，然后取200～300ng产tt物采用Cre重组酶体系进行环化。之所以选择这个范围，是因为在此范围内既要保障足够的分tt子内环化空间（同一个分子两端环化起来），又要防止分子间的线性连接。tt

　　优选的，步骤S9、S10及S11均在磁珠上进行，使用链霉亲和素磁珠达到富集生物标记tt的目标DNA片段的目的。tt

　　为了对得到的Mate-paired DNA文库进行检测和测序，本发明的技术方案进一步包括对步tt骤上述获得的Mate-paired DNA文库进行2100检测和Q-PCR定量，并采用Illumina公司的ttHiseq2000测序平台进行测序，生物信息学对该文库进行个性化评估，确定各项指标。tt

　　在本发明一种典型的实施方式中，上述mate-paired DNA文库构建的方法，步骤S1中所tt用基因组DNA为20μg任何材料的DNA，包括动物、植物、微生物等。DNA破碎仪为Digilabtt公司的plus DNA Shearing Device。tt

　　步骤S2的补平所用的酶为：T4DNA聚合酶，0.2U/μl，T4多聚核苷酸激酶，终浓度0.5ttU/μl；加dATP所用酶：Klenow(3’-5’exo-)，终浓度0.5U/μl；dATP终浓度：0.2mM。tt

　　步骤S3所用的接头A和B的终浓度：0.1μM，连接酶：T4DNA快速连接酶（Rapid ligase），tt连接酶在连接体系中的浓度为30U/μl。tt

　　步骤S4产物回收所用MinElute PCR Purification Kit（QIGEN）试剂盒。tt

　　步骤S5定量采取Qubit定量；环化体系为：产物300ng，Cre酶（NEB）的终浓度为0.1ttU/μl。tt

　　步骤S6单链DNA和双链DNA进行消化体系为：ATP终浓度44mM；依赖于ATP的线tt性双链核酸消化酶（Plasmid-Safe ATP-Dependent Dnase）终浓度0.5U/μl；单链核酸外切酶tt（Exonuclease I）终浓度0.6U/μl。tt

　　步骤S7采用Covaris S220将环化的DNA分子进行破碎。tt

　　步骤S8中采用M-270streptavidin magnetic beads对步骤S7的产物中带有生物tt素标记接头的序列进行富集。tt

　　步骤S9末端修复体系：T4DNA聚合酶终浓度0.2U/μl；T4多聚核苷酸激酶终浓度0.5ttU/μl；dNTP终浓度0.4mM；加dATP体系：Klenow(3’-5’exo-)，终浓度0.5U/μl；dATP终tttttt浓度0.2mM。tt

　　步骤S10中加测序接头体系：T4DNA连接酶终浓度60U/μl；接头（adaptor，含Index）tt终浓度0.5μM。tt

　　步骤S11PCR体系：5XReaction Buffer（NEB）1/2体积；引物P5，P7终tt浓度0.5μM。tt

　　下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。tt

　　下述实施例中的方法如无特别说明均为常规方法，所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生tt物公司合成，所用试剂如无特别说明均为Enzymatics公司的产品，所用水为超纯水。tt

　　1、基因组DNA的破碎tt

　　样品：人标准品基因组DNA样品，即Promege公司购买的人基因组DNA样本（Human ttGenomic DNA）。tt

　　1）样品浓度和完整性测定tt

　　使用Qubit（美国Invitrogen）对样品DNA浓度测定，进行精准定量，并使用0.8%琼脂tt糖凝胶，120v电压，电泳1小时，检测样品质量，确保人标准品基因组DNA样品完整无降解。tt综合凝胶电泳与Qubit的结果，对样品的浓度、总量和质量是否合格进行确定：（合格标准）tt基因组完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带应在最大条带40kb以上。若有脉冲场电泳tt结果，则DNA主带应在48.5kb以上；无蛋白质、RNA或肉眼可见杂质污染（若样品含有RNAtt污染，须按样品体积加入1/10体积的浓度为10mg/ml的RNase并在37℃处理30min）；样tt品浓度达到150ng/μl以上；tt

　　2）如果样品浓度＜100ng/μl，则需对样品进行浓缩；tt

　　3）取25μg基因组DNA；37℃温育30min；12000rpm离心5min，转移上清到一新的tt1.5ml离心管中；用QIAGEN EB(Elution buffer)或TE（Tris-EDTA）缓冲液补足到200μl；tt

　　4）用液压剪切装置（HydroShear device）将样本破碎在目标区域富集（参数设置根据实tt验设置最佳条件）。tt

　　2、末端修复和加dATPtt

　　末端修复体系如表1所示：tt

　　表1tt

　　20℃温育30min；修复后用1.8倍样品体积的AMpure XP磁珠（Beads）纯化样品。tt

　　加dATP体系如表2所示：tt

　　表2tt

　　37℃温育30min；加dATP反应后，后用1.8倍样品体积的Ampure XP磁珠（Beads）纯tt化样品，用80μl超纯水洗脱样本。tt

　　3、加A、B接头tt

　　连接体系如表3所示：tt

　　表3tt

　　25℃温育15min；产物加入溴酚蓝，65℃灭活10min。tt

　　4、片段大小选择tt

　　1）准备0.6%的琼脂糖凝胶（BIO-RAD Certified Megabase Agarose）125ml（1×TAE），tt推荐的电泳梳孔为1mm（长）×9mm（宽）×10mm（高）的7孔梳，溶胶时加入千分之一tt的Gel red染料；tt

　　2）取出制胶用的胶托、胶梳和凝胶架，注意选用宽孔胶梳并注意和胶托配套。仔细清理tt胶托、胶梳和凝胶架然后用纯水冲洗最后用无水乙醇擦拭，晾干待用。tt

　　3）装配好凝胶架，将冷却至50℃的琼脂糖溶液倒入凝胶架中凝固，须注意琼脂糖溶液tt中不应有气泡。待琼脂糖在室温凝固后将其放入4℃冰箱冷却至少30min。tt

　　4）拔掉胶梳，连同胶托将琼脂糖凝胶从凝胶架中取出待用；若琼脂糖凝胶需要隔夜放置tt时需拔掉梳子，放入保鲜袋中密封保存。tt

　　5）用自来水反复仔细清洗电泳槽，然后用蒸馏水冲洗三遍，再用无水乙醇擦拭电泳槽，tt室温晾干后，在电泳槽中加入少量1倍Tris-乙酸缓冲液（1×TAEbuffer）润洗后待用。tt

　　6）放入刚制备的琼脂糖凝胶并将预冷的电泳缓冲液1×TAE倒入电泳槽中，贴好标签准tt备电泳。tt

　　7）打开电泳仪电源，调好电压和电泳时间开始电泳。先用100V电泳20min使样品进入tt凝胶，再将电压调低至25V电泳18～20小时，过程中需关注电泳状态是否正常。tt

　　8）切胶（目标区域）如图3，用QIAquick QIAEX II凝胶回收试剂盒进行胶纯化回收，tt最后体积为81μl；取1μl定量。tt

　　5、环化tt

　　环化体系：tt

　　1）在PCR管中加入以下反应体系tt

　　A）10μl10×Cre缓冲液tt

　　B）80μl步骤4产物DNA（Filled-in DNA，300ng）tt

　　C）10μl Cre重组酶（Cre Recombinase）(1U/μl)tt

　　2）涡旋振荡，然后在PCR仪中进行反应tt

　　A）37℃保温50分钟；tt

　　B）70℃保温10分钟；tt

　　C）4℃保存。tt

　　6、线性DNA消化tt

　　1）反应体系：tt

　　A）2.2μl DTT（DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇，100mM）（直接先加入混匀后再加入其tt它反应物）tt

　　B）2.2μl ATP（adenosine-triphosphate，腺嘌呤核苷三磷酸，100mM）tt

　　C）10μl依赖于ATP的线性双链核酸消化酶Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase(10U/μl)tt

　　D）6μl单链核酸外切酶Exonuclease I(20U/μl)tt

　　2）点动涡旋振荡，然后在PCR仪中进行反应tt

　　A）37℃保温30分钟tt

　　B）80℃保温20分钟tt

　　C）4℃保存tt

　　3）使用QIAquick PCR产物纯化试剂盒QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化，用tt122μlEB溶解。tt

　　7、二次破碎tt

　　1）打开超声波DNA破碎仪CovarisS220，脱气并预冷至6℃至8℃；tt

　　2）将核酸外切酶处理的DNA转移至T6玻璃管，为了确保持续片段化DNA，T6玻璃管tt内的液面要达到管的顶部，可通过添加超纯水的方法将T6玻璃管内的气体排出；tt

　　3）片段化参数如表4所示：tt

　　表4tt

　　4）破碎后PCR回收试剂盒回收（50μl）。可保存于-15℃～-25℃。tt

　　8、纯化生物素标记的DNA（M-270链酶亲和素磁珠（streptavidin beads）纯化）tt

　　1）振荡重悬M-270链酶亲和素磁珠（streptavidin magnetic beads）。tt

　　2）吸取20μl重悬的磁珠置于1.5ml离心管，将离心管放置在磁分离架上等待1分钟，tt小心吸取弃上清。tt

　　3）用50μl磁珠结合缓冲液（Bead Binding Buffer）洗涤磁珠。小心的重悬沉淀，轻弹离tt心管，短暂离心1～2秒，将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，弃上清。重复此步骤一tt次。tt

　　4）用50μl磁珠结合缓冲液（Bead Binding Buffer）重悬磁珠。tt

　　5）加入来自步骤7处理后的样品50μl，20℃在热混合器上温浴15分钟。（每2mintt震荡15s，600rpm）。tt

　　6）将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μl的磁珠洗涤缓冲液tt（Bead Wash BufferⅠ）洗涤磁珠，每次洗涤轻轻吹打重悬磁珠五次，重悬沉淀，轻弹离心管，tt短暂离心1～2秒，将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，弃上清。tt

　　7）重复步骤6）2次。tt

　　8）将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μl的EB洗涤磁珠，每tt次洗涤轻轻吹打重悬磁珠五次，重悬沉淀，短暂离心1-2秒，将离心管放置在磁分离架上，等tttttt待1分钟，弃上清。tt

　　9）用200μl的QIAGEN EB buffer洗磁珠，将EB和磁珠混匀后，放置冰上，准备进行末tt端修复体系。tt

　　9、末端修复tt

　　在1.5ml的离心管中配制末端修复反应体系，如表5所示：tt

　　表5tt

　　1）将使用后的试剂放回原试剂盒中并-20℃保存；tt

　　2）将8-9）中的离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，弃上清，加入末端修复混合体tt系100μl；tt

　　3）在热混合器（hermomixer）中20℃温浴30分钟，每2分钟重悬磁珠一次，混合时应tt尽可能的轻柔。tt

　　4）将1.5ml离心管置于磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清。用200μl的磁珠洗脱缓冲tt液（Bead Wash BufferⅠ）洗涤磁珠三次，每次洗涤轻轻吹打重悬磁珠约5次。tt

　　5）用200μl的EB洗涤磁珠，每次洗涤轻轻吹打重悬磁珠5次。tt

　　6）用200μl的QIAGEN EB缓冲液洗磁珠，将EB和磁珠混匀后，放置冰上，准备加Att体系。tt

　　10、末端加Att

　　预先从-20℃保存的试剂盒中取出10×Blue缓冲液和1mM dATP，将其置于冰上融化并tt使其充分混匀，将酶从-20℃冰箱取出置于-20℃冰盒上。tt

　　1）在1.5ml的离心管中配制末端加“A”反应体系，如表6所示：tt

　　表6tt

　　2）将9-8）中的离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，弃上清，加入末端加A混合体tt系50μl，轻轻混匀；tt

　　3）在热混合器中37℃温浴30分钟，每2分钟重悬磁珠一次，混合时应尽可能的轻柔（每tt2min震荡15s，600rpm）。tt

　　4）将1.5ml离心管置于磁分离架上，等待1分钟，弃上清。用200μl的磁珠洗脱缓冲tt液（Bead Wash BufferⅠ）洗涤磁珠三次，每次洗涤轻轻吹打重悬磁珠约5次。tt

　　5）用200μl的EB洗涤磁珠两次，每次洗涤轻轻吹打重悬磁珠5次。tt

　　6）移去最后一次洗涤的缓冲液（EB），加入19μl的EB重悬磁珠。将磁珠转移至一新的tt1.5ml离心管中。tt

　　11、加测序接头tt

　　1）预先从-20℃保存的试剂盒中取出连接缓冲液（2×Adapter Ligation Buffer）和接头（PE ttAdapter Oligo Mix），将其置于冰上融化并充分混匀，直至缓冲液中没有任何固体不溶物。tt

　　2）在1.5ml的离心管中配制接头（Adapter）连接反应体系，如表7所示：tt

　　表7tt

　　3）轻轻地吹打接头（Adapter）连接反应体系确保磁珠在反应体系中充分悬浮。tt

　　4）在热混合器（Thermomixer）中20℃温浴15分钟，每2分钟重悬磁珠一次，混合时tt应尽可能的轻柔（每2min震荡15s，600rpm）。tt

　　5）将1.5ml离心管置于磁分离架上，等待1分钟，弃上清。用200μl的磁珠洗脱缓冲tt液Ⅰ（Bead Wash BufferⅠ）洗涤磁珠三次，每次洗涤轻轻吹打重悬磁珠约5次。tt

　　6）可选择：建库用gDNA低质量（有降解）建议用200μl的磁珠洗脱缓冲液Ⅱ（Bead Wash ttBufferⅡ）洗涤磁珠一次，注意磁珠洗脱缓冲液Ⅱ（Bead Wash BufferⅡ）只能在加接头后使用，tt其它洗涤步骤中均不可加Bead Wash BufferⅡ；tt

　　7）用200μl的EB洗涤磁珠两次，每次洗涤轻轻吹打重悬磁珠5次。tt

　　8）移去最后一次洗涤的缓冲液（EB），加入23μl的EB重悬磁珠。将磁珠转移至一新的tt0.2ml PCR管中。tt

　　12、PCR扩增、出库tt

　　1）从-20℃保存的试剂盒中取出Phusion DNA聚合酶、PCR引物PE1.0和PCR引物ttPE2.0，将其置于冰上化冻并充分混匀Phusion DNA聚合酶。tt

　　2）在0.2ml的离心管中配制PCR反应体系，如表8所示：tt

　　表8tt

　　3）在PCR仪中运行下列程序：tt

　　PCR循环数为18.tt

　　A）98℃保温30s；tt

　　B）17循环：98℃保温10s，65℃保温30s，72℃保温30s；tt

　　C）72℃保温5min；tt

　　D）4℃保存。tt

　　4）反应结束后用磁分离架移取PCR反应体系的上清，将此上清进行电泳。tt

　　5）电泳选择片段（350～650bp）tt

　　用凝胶回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）进行胶纯化回收，回收连接产物并溶于tt20μl EB（Elution Buffer，洗脱缓冲液）中。打印好标签并贴在离心管管壁上，方便查找，至tt此文库基本制备完成。tt

　　13、库检、上机tt

　　1）将步骤12中所得的纯化产物稀释到1ng/μl，取出1μl用于Agilent2100（美国Agilenttt公司）检测，另外再取1μl用于QPCR（Biorad公司）检测，根据检测结果图4，决定上机浓tt度。tt

　　2）根据步骤1）所得的浓度，将文库稀释到上机要求后，在Illumina公司的Hiseq2000tt测序平台进行测序。tt

　　14、信息分析tt

　　对下机数据进行个性化分析，使用BWA较严格的参数比对到人基因组上，比对结果如附tt图5和表9。tt

　　表9（生物序列比对软件（BWA）比对结果）tt

　　参数解释：tt

　　All read1number：用于比对评估的高质量测序读取1（read1）的条数；tt

　　All read2number：用于比对评估的高质量测序读取2（read2）的条数；tt

　　All read1map number：比对上的读取1（read1）的条数；tt

　　All read2map number：比对上的读取2（read2）的条数；tt

　　注：在做这些数据统计之前，已经对没有比对（map）上的读取碱基（reads）和多处比对tt的读取（reads）以及质量数低于20的读取（reads）进行的了过滤，所以all read1num应该是tttttt过滤之后的read1的条数，all read1比对上的数目（map num）是比对（map）上读取（read）tt的条数，因为之前已经对没有比对（map）上的做了过滤，所以是100%的比对。tt

　　Insertsize peak：基于数据评估得到的实际文库大小；tt

　　All PE map reads pair：双端比对上（PE）比对数据中所有比对上的读取（reads）对数；tt

　　注：所谓PE数据比对上的reads是指两条reads都比对到同一条染色体上。tt

　　PE right direction pair：双端比对上（PE）比对数据中PE方向正确的读取（reads）对数；tt

　　注：对于小片段文库来说，比对方向是相对的。tt

　　对于大片段文库来说，由于需要环化，所以方向是背向的。tt

　　在比对结果中，一般通过比较读取（reads）比对到染色体（或scaffold）上起始坐标来判tt断reads的位置关系，就大片段库来说，如果判断读取1（read1）的位置和读取2（read2）的tt位置关系满足方向为背向时，认为是方向正确的。否则是双端比对上方向错误的碱基对（PE tterror direction pair），因为对大片段库来说，会存在很多环化不完全的情况，所以双端比对上tt方向正确的碱基对（PE right direction pair）的值一般都不算高，当然，这个值越高说明环化效tt果越好，对后面分析起的帮助会越大。tt

　　当然，统计的前提是，这两条读取（reads）都比对到同一条染色体上，并且read1和read2tt的方向是相反的。所以，不难解释为什么双端比对上方向正确的碱基对（PE right direction ttpair%）+双端比对上方向错误的碱基对（PE error direction pair）%不等于100%。tt

　　双端比对上方向错误的碱基对（PE error direction pair）：PE比对数据中PE方向错误的readstt对数(PE error direction/All PE map reads pair)；tt

　　双端比对上同一链的碱基对（PE same strand pair）：PE比对数据中同一条链上的reads对tt数(PE same strand/All PE map reads pair)；tt

　　注：同一条链（same strand）是指两条读取（reads），虽然比对到同一条染色体上了，但tt这两条reads的方向是相同的，也就是我们称是同一条链（一般两条读取（reads）应该是一个tt比对到正链上，一条比对到负链上。）tt

　　当然，这样的读取（reads）也是没有办法用于后续的分析中的，所以，这个值的比例也tt是越低越好。tt

　　双端比对上不同染色体的碱基对（PE dirrerent chr pair）：PE比对数据中比对到不同染色tt体或scaffold上reads对数(PE dirrerent chr/All PE map reads pair)；tt

　　注：一般来说，用这些读取（reads）之间的连锁（link）关系可以看到出scaffold拼接状tt况的好坏，也就是说，如果一对读取（reads）都正确的比对到了这条scaffold上，那么这条scaffoldtt上就会有一个link，反应到图上就是这样的一个结构，弧线代表一个link关系，连锁（link）tt关系越多，代表这个文库的reads对这条scaffold的支持情况越好，那么装出来的scaffold就tttttt越可靠。tt

　　所以说，比对（map）到同一条染色体或是scaffold上的reads才是需要的，所以，双端tt比对上方向错误的碱基对（PE dirrerent chr pair）的比例，也是越低越好。tt

　　SD(20%)：方向正确的PE比对数据中符合文库实际峰值上下游20%的读取（reads）对数tt比率（20%SD Reads/PE right direction pair）；tt

　　注：对于大片段库reads来说，即使他们都比对到同一条scaffold上，并且比对方向也是tt正确的，但我们也不能确定一定是我们需要的，因为我们还需要考虑两条读取（reads）之间tt的插入峰（insertsize）是否符合要求，也就是说，我们认为只有符合文库实际峰值上下游20%tt的读取（reads），并且是PE正确比对的reads才是有效的reads。所以，SD(20%)是我们统计tt双端比对上方向正确的碱基对（PE right direction pair）中，满足插入峰（insertsize）要求的读tt取（reads）对数所占的比例的大小，当然，这个值越大说明我们可用的读取（reads）越多。tt

　　双端比对上方向正确的碱基对（PE right direction pair）所占比例达到了67%，SD(20%)tt占到了95.6%，这些数据都是可用数据，插入峰（Insertsize peak）在4964bp，集中在5k位置，tt可见文库质量非常好。tt

　　以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员tt来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等tt同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。tt

　　序列表tt

　　<110>北京诺禾致源生物信息科技有限公司tt

　　<120>双链接头、其应用及构建末端配对DNA文库的方法tt

　　<130>PN15194NHZYtt

　　<160>4tt

　　<170>PatentIn version3.1tt

　　<210>1tt

　　<211>40tt

　　<212>DNAtt

　　<213>artificialtt