一种宫膜干细胞库的构建方法

一种宫膜干细胞库的构建方法

　　技术领域tt

　　本发明涉及生物医学领域，具体涉及干细胞库的构建，更具体涉及宫tt膜干细胞库的构建。tt

　　背景技术tt

　　1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科tt技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就tt之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用tt前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注tt目的热点之一。干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力tt(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。tt干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组tt织器官和人体的潜在功能，改变了人类疾病的应对方法，医学界称为“万用tt细胞”。目前干细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，但这两种来源都tt存在着部分局限性，因此寻找一种克服肿瘤形成的潜在性、标本来源的缺tt乏及伦理学争议等弊端的干细胞来源具有重要意义。近年来，美国Musinatt领导的研究小组从健康女性的月经血中得到分离的干细胞。宫膜干细胞tt（MenSCs）避免了其他干细胞的不足，成为一种全新的具有重大研究和应tt用潜力的干细胞。tt

　　然而，经对现有技术文献的检索发现，报道的宫膜干细胞的获取方法tt中，并没有人针对分离过程中除菌的方法以及除菌的效果进行报道，不能tt保证宫膜干细胞分离的成功率，不利于后续过程的进行。tt

　　本发明者通过摸索，根据细胞与细菌、真菌等的密度差异，通过密度tt梯度离心以及一定范围内反复洗涤离心的方法，可以去除细菌、真菌等，tt进而降低宫膜干细胞染菌的可能性，提高分离的成功率。通过大规模扩增tt培养可以获得大量的宫膜干细胞，并长期保存，定期质量检测，以便为未tt来的临床以及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。tt

　　发明内容tt

　　本发明的目的是为了克服宫膜干细胞分离过程中的不足，实现高效的tt宫膜干细胞分离和长期保存。tt

　　本发明提供一种宫膜干细胞库的构建方法，包括月经血采集、宫膜干tt细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，该方法的tt特征在于：所述宫膜干细胞分离除菌包括用密度梯度离心或磁珠分选得到tt单个核细胞，并在密度梯度离心前后多次用缓冲液冲洗去除残余细菌和杂tt质，所述密度梯度离心法使用密度为1.077的细胞分离液，300-500×g，tt15℃-25℃离心20-40分钟，所述缓冲液冲洗中使用的缓冲液为含100U/mltt青霉素和100U/ml链霉素的PBS。tt

　　本发明的宫膜干细胞库的构建方法中，月经血的采集包括使用月事杯tt收集月经血，并保存在月经血保存液中，所述月经血保存液为添加肝素钠tt的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液。tt

　　本发明方法中，月经血保存液中还可添加抗菌物质，所述抗菌物质选tt自两性霉素、青霉素、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头tt孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、tt乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素和林可霉素。月tt经血保存液中添加的抗菌物质优选两性霉素、青霉素、链霉素。tt

　　本发明方法中的扩增步骤包括将分离所得单个核细胞于ttα-MEM+10％-20％血清完全细胞培养液中培养48-72小时后，更换新鲜的培tt养液，以后每3天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，用含EDTA的0.25％tt胰酶消化，然后进行传代培养。tt

　　本发明方法中的分析检测步骤包括无菌性检测、流式细胞仪检测、核tt型检测和分化能力检测。tt

　　本发明方法中的长期保存步骤包括将细胞以1×106至1×107细胞/mltt的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降tt温盒在-80℃冰箱中过夜进行程序降温法保存，然后转移到-196℃液氮中长tt期保存。tt

　　在长期保存过程中，进行定期检测，包括细胞复苏后进行细胞活性检tttttt测、无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。tt

　　细胞活性检测每隔12个月进行一次，将细胞复苏后用台盼蓝染色检tt测细胞存活率。tt

　　流式细胞仪检测包括细胞表面抗原CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、ttHLA的检测。tt

　　分化能力检测包括成骨分化能力、成脂分化能力和成软骨分化能力的tt检测。tt

　　本发明的宫膜干细胞库的构建方法中，扩增后的分析检测和长期保存tt过程中的定期检测都要进行无菌性检测，包括真菌的检测和细菌的检测。tt

　　本发明的一个具体实施方式包括以下步骤：tt

　　1、月经血的收集tt

　　利用月事杯收集月经血，保存在月经血保存液（含肝素钠的PBS盐缓tt冲溶液或SPB盐缓冲溶液）中，于4℃条件下运送到GMP车间。tt

　　2、宫膜干细胞的分离和除菌tt

　　利用密度梯度离心或磁珠分选方法收集单个核细胞（PBMC），通过多tt次PBS缓冲液反复冲洗，去除残留的细菌等物质。tt

　　3、宫膜干细胞的扩增tt

　　将分离得到的单个核细胞在α-MEM+10%-20%血清完全细胞培养液tt中培养，48-72小时后更换新鲜的培养液。以后每3天全换液一次，细胞tt长满约80%-90%时，用0.25%胰酶（含EDTA）消化，传代。tt

　　4、宫膜干细胞的检测tt

　　将传代的细胞进行无菌性检测，流式细胞仪检测，成骨分化检测等一tt系列检测。tt

　　5、宫膜干细胞的冻存tt

　　将传代后的宫膜干细胞通过程序降温法保存，即将细胞以1×106-至tt1×107细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液tt中，采用程序降温盒在-80℃冰箱中过夜，然后转移到-196℃液氮中长期保tt存。tt

　　6、宫膜干细胞的定期检测tt

　　每隔一定的时间（例如：12个月），将宫膜干细胞复苏，进行细胞活tt率、无菌性、流式细胞仪、分化能力等各项检测，对保存的宫膜干细胞的tt质量进行监控。tt

　　发明人经过研究开发，提供了简便易行的除菌方法，在获得月经血样tt本后，经过密度梯度离心、磁珠分选等方法得到单个核细胞（PBMC），再tt通过多次PBS洗涤离心的方法去除残余的细菌等物质，以提高获得无菌的tt宫膜干细胞的成功率。通过扩增培养可以获得大量纯度较高的宫膜干细tt胞，并长期保存，定期质量检测，以便为未来的临床及科研应用研究提供tt大量的宫膜干细胞资源。tt

　　附图说明tt

　　图1为本发明实施例的人宫膜干细胞的获取方法及干细胞库的构建方tt法流程图。tt

　　图2为本发明实施例的人宫膜干细胞的生长曲线示意图。tt

　　图3为本发明实施例的人宫膜干细胞流式检测结果示意图。tt

　　具体实施例tt

　　以下用实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。本技术领域普通技tt术人员应当认识到，这些实验例仅仅用于举例说明本发明而不对本发明的tt范围构成任何限制，对本发明所作的任何改变，只要不违背本发明的精神tt实质，都将落在权利要求范围内。tt

　　实施例中的操作都国家认证的GMP车间中进行。操作流程见图1。tt

　　实施例1、月经血的采集tt

　　供者签署知情同意书后，将利用月事杯收集到的5ml-15ml月经血保tt存在等体积的月经血保存液（PBS，并添加100U/ml青霉素和100U/ml链tt霉素）中，4℃的条件下48小时内运送到国家认证的GMP车间。tt

　　实施例2、宫膜干细胞的分离tt

　　将5ml月经血混合液直接放在100mm的平皿中，补加5mlα-MEM（含tt20%的血清），在37℃、5%CO2的条件下静置培养。48小时后，更换10mltt新鲜培养液。对弃除的上清液进行无菌性检测（见表1）。tt

　　表1对宫膜干细胞的无菌性检测tt

　　

　　（注：阳性为供试管中培养基澄清，阴性为供试管中培养基显浑浊）tt

　　实施例3、宫膜干细胞的除菌分离tt

　　将5ml月经血混合液缓慢加入含5ml Ficoll分离液的15ml离心管中，tt利用密度梯度离心的方法，加速度和降速度均设为1,转速为300-500×g，tt离心20-40分钟后收集白膜层，即单个核细胞（PBMC）。将PBMC用10mlttPBS冲洗，1000rpm-1500rpm离心5-10分钟，弃除废液。该过程重复3次，tt去除残留的细菌等物质。将分离得到的目标细胞用3ml α-MEM（含tt10%-20%的血清）重悬，放在六孔板中在37℃、5%CO2的条件下静置培养，tt48小时后，更换3ml新鲜的培养液，显微镜下观察到贴壁细胞，细胞呈梭tt形。对弃除的上清液进行无菌性检测（见表1）。tt

　　实施例4、宫膜干细胞的扩增tt

　　将实施例3的六孔板每3天全换液一次，细胞长满约80%-90%时，用tt0.25%胰酶（含EDTA）在37℃下消化3-5分钟，离心后去除胰酶，用10mlttttttPBS洗涤3次，用10mlα-MEM（含20%的血清）重悬于T75培养瓶中，tt在37℃，5%CO2的条件下静置培养。细胞在7天左右形成集落，12天左tt右细胞长满约80%-90%，可以开始传代。宫膜干细胞的扩增进程见图2的tt生长曲线。tt

　　实施例5、宫膜干细胞检测tt

　　1）无菌性检测tt

　　将扩增后的宫膜干细胞送入药品非临床研究质量管理规范标准实验tt室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测（根据《中国药tt典》2010版三部附录XIIA无菌性检测的方法，检测分离得到的宫膜干细tt胞是否被细菌或真菌污染）。结果见表1。tt

　　2）流式细胞仪检测tt

　　取对数生长期的第3代MenSCs，用0.25%胰酶-EDTA消化后，tt以含10%-20%胎牛血清的α-MEM中和，1000-1500rpm离心3-5min，ttPBS清洗3遍以除去血清。调整细胞密度至106个细胞/ml，以1ml体tt积分装至无菌离心管中。分别按照说明书上的量加入鼠抗人CD14-FITC、ttCD44-FITC、CD45-FITC、CD29-PE、CD90-PE、HLA-PE抗体，混匀，4℃tt避光孵育30min。同时以未加抗体的细胞作为阴性对照，以相应的鼠抗人ttIgG1作为同型对照。孵育结束后，PBS清洗3遍除去未结合的抗体，ttBD流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况，CellQuest软件处理结果。其tt中CD14、CD29、CD90呈阳性，CD14、CD45、HLA呈阴性。结果见图tt3。tt

　　3）成骨分化检测tt

　　0.25%胰酶-EDTA将细胞消化下来，以104个细胞/ml的密度分别接tt种至3块六孔板，待细胞贴壁后更换成骨诱导液（α-MEM添加10%FBS、tt100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠和0.05mM抗坏血酸）诱导分化tt28天。每周更换2次成骨诱导液。tt

　　3.1碱性磷酸酶（ALP）检测tt

　　消化获得的MenSCs在成骨诱导液诱导分化14天时，进行ALP活tt力测定：吸去六孔板中的培养液，PBS洗3遍，加入400μl裂解缓冲液tttttt(1.5M Tris-HCl，1mM ZnCl2，1mM MgCl2，1%Triton-X100，pH 9.2)，tt37℃裂解30min，13,000rpm离心10min，取20μl上清用ALP试剂tt盒检测碱性磷酸酶活性，酶标仪读取405nm处吸光值。经计算ALP检测tt值是10IU/106个细胞。tt

　　3.2茜素红矿化节染色tt

　　MenSCs细胞成骨诱导分化28天时，进行茜素红染色以观察矿化节tt形成。具体步骤为：六孔板中的细胞用PBS洗三次，加入70%的冷乙tt醇，4℃固定1小时，去离子水洗3遍除去残留的乙醇，加入3ml 0.1tt%茜素红溶液（pH 8.3）室温下染色15min，间歇晃动，去离子水洗5次tt除去未结合的茜素红，37℃，PBS清洗15min，显微镜观测到红色矿化tt节。tt

　　实施例6、宫膜干细胞冻存tt

　　细胞长满约80%-90%时，利用胰酶（含EDTA）消化后，PBS冲洗3tt次，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无tt菌检测，支原体检测，细胞计数和活力测定，以确定其是否到达合格标准。tt经过检测符合标准的宫膜干细胞按1×106~2×107个细胞/ml的密度在冻存液tt（DMSO、胎牛血清和α-MEM培养液1:2:7）中重悬，分装入冻存管。在tt冻存管外贴标签，标签上记录细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、tt细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期等，完整tt记录每一样本的真实冷冻状况，将信息准确无误地扫描入数据管理系统，tt完成细胞库信息录入和构建。冻存管放入程序降温盒在-80℃冰箱中过夜，tt次日将冻存管转移到-196℃液氮罐中相应的空格中长期保存。冻存空间具tt有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，并符合国家相关文件tt规定。tt

　　实施例7、宫膜干细胞定期检测tt

　　每隔12个月，将宫膜干细胞复苏，取50μl细胞悬液添加50μl台盼蓝tt染液，染色3min，将细胞混合液加入细胞计数板中，显微镜下观察，计算tt并未染成蓝色的细胞比例即细胞存活率，细胞存活率需大于等于95%。并tttttt按照上述方法进行无菌性检测、流式细胞仪检测、成骨分化检测等各项检tt测，以便对保存的宫膜干细胞进行质量监控。定期将检测报告交给供者。tt

　　实施例8、宫膜干细胞在含微载体的转瓶中进行培养扩增tt

　　在本实施例中使用的是含有微载体的转瓶培养扩增细胞，转瓶工作体tt积为125ml，微载体为Cytodex-3。按照如下步骤进行操作。tt

　　①转瓶预处理：125ml转瓶清洗干净，烘干至完全干燥，加入20mltt硅化液(Sigmacote,Sigma)于转瓶中，缓慢旋转转瓶使硅化液浸润瓶壁，吸tt去硅化液后，将转瓶置于通风处风干12h，蒸馏水冲洗备用。tt

　　②微载体预处理：本实施例中微载体密度定为2g/L，由于培养体积tt为50ml，因此称取0.1gCytodex-3转瓶中，加入20ml PBS浸泡3h，吸tt去后加入20ml新的PBS，121℃高压蒸汽灭菌20min，吸去PBS并加入20ttml含15%胎牛血清的α-MEM培养液，37℃浸泡过夜。tt

　　③宫膜干细胞的接种：取4平皿生长至80%融合的宫膜干细胞，0.25tt%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培养液终止消化，1,000rpmtt离心5min，新鲜培养液重悬，以4×104个细胞/ml的密度接种在三维微载tt体上。将含有8×106个细胞的悬液加入含有Cytodex-3的转瓶中，再分别tt补足培养液至25ml，置于Wheaton磁力搅拌器上间歇搅拌，间歇搅拌条tt件为45rpm搅拌2min，停止13min，如此循环3h，37℃，5%CO2。接tt种结束后，分别补入25ml培养液至50ml最终工作体积，转速调整为55ttrpm，每2天更换2/3培养液直至培养结束。tt

　　④宫膜干细胞的获取：停止转瓶内的搅拌，弃去上清液，0.25%胰tt酶-EDTA消化后，以含15%胎牛血清的培养液终止消化，1,000rpmtt离心5min，新鲜培养液重悬，可得到5.8×105个细胞/ml密度的细胞。tt