一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片及其应用

一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片及其应用

　　技术领域tt

　　本发明涉及一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片及其应用，属于基因芯片技术领域。tt

　　背景技术tt

　　树木溃疡病病原种类多样，寄主广泛，有性型和无性型并不是一一对应关系，无性型多tt样，其形态特征差异小，有性型在自然界中不常发现。目前检测鉴定的方法还依赖于病原菌tt的分离培养，这限制了生态条件下对树木溃疡病发生、发展和防治的研究。tt

　　现有技术中的病原菌鉴定检测手段主要停留在可培养技术、形态生物学及一些生化技术tt和常规分子方法上，这些技术和方法只能对非常有限的种群数量进行有限的研究，难以构成tt病原微生物较大规模种群流行生态学的研究。基于核酸序列和PCR技术的微生物检测技术和tt鉴定手段发展了十多年，主要分子技术平台有：失活梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient ttGel Electrophoresis，DGGE)、温度差异性凝胶电泳技术(Temperature Gradient Gel ttElectrophoresis，TGGE)、单链构象多态性技术(Single-strand Conformation Polymorphism，ttSSCP)、扩增片断长度多态性AFLP技术(Amplified Fragment Length Polymorphism)、荧光tt原位杂交技术(Fluorescent in-situ Hybridization，FISH)、RAPD(Random Amplified ttPolymorphic DNA)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)等。这些技术的应tt用虽极大地促进了微生物生态的发展，并大大提高了判定和分析微生物种群的能力，但这种tt以具有遗传背景的分子标记性方法，因不同对象和生态条件而变化，存在着种群限制和较为tt耗时的技术规程问题。随着越来越多的微生物种和其他生物种的基因组序列的测定完成，一tt批以组学为基础发展起来的高通量技术和平台被建立如生物芯片技术及其平台。而且，近些tt年这些技术迅速地向生态学和环境科学渗透发展，促进了分子生态学和生态基因组学tt(ecogenomics,ecological genomics)和宏基因组学(metagenomics)的快速发展。在这样一tt个生物分子手段与生态和环境技术逐渐结合的时代，对于植物病理学、流行学以及微生物生tt态相关学科而言，亟需基于更大规模生态下的微生物种群的监测、检测、鉴定和量化研究的tt先进技术，这一领域下的生物芯片技术和平台的应用和发展也正是在这时代背景下迅速兴起。tt

　　生物芯片是基于核酸杂交技术的微阵列技术，将含有生物信息的被称为探针的核酸序列tt或蛋白成分以微型点阵形式，排列在固体的基片上，来自待分析样本的核酸或蛋白(靶标)tt通过与其杂交、染色、扫描仪判读、结果输出分析，从而了解和反映出生物发育或在特定生tt态或环境下的基因表达、代谢及功能的特征。目前，根据用途、目的、探针性质以及构造生tt物芯片平台可以分有很多类型，如核酸芯片(基因芯片)、蛋白质芯片、抗体芯片；cDNA芯tt片、寡聚核苷酸芯片是、CHIP芯片；还有测序芯片、流体芯片、芯片实验(Lab on Chip)、ttChIP－chip等20多种类型，而商业化了的只是几个很有名的芯片公司，如Affymetrix、ttApplied Biosystems、Agilent、TaqMan等。这些生物芯片技术和平台中，按照用途可以简tt单地将他们归为表达型生物芯片和检测性生物芯片。表达型芯片是目前研究利用的主导类芯tt片，发展较早，应用目的主要是基因表达和转录图谱分析，目前已有很多的成熟的平台和技tt术，商业化的生物芯片绝大部分也是为这类目的设计的。检测性生物芯片以监测、检测、鉴tt定和量化为目标，应用目的如基因单碱基多态检测(SNP)，以及特定生态或环境下的生物种tt群属性及其功能基因的定性和定量研究。检测型芯片最近在医学临床、环境微生物检测鉴定、tt病虫害检疫、转基因植物检测等领域发展很快，一些专门为检测而发展起来的芯片平台也得tt到兴起，如ArrayTube平台技术。tt

　　ArrayTube生物芯片平台与技术是由德国Clondiag公司发展起来的可用于微生物检测和tt鉴定的可定制芯片体系。该平台和技术已经被欧美科学家们接受，尤其在欧洲，该平台与其tt它知名生物技术公司的平台一样得到较好的应用。利用该平台技术发表的科学结果在包括美tt国国家科学院院刊(PNAS)的许多知名期刊上发表。一些欧洲公司也以该平台和芯片生产为tttttt基础，消化研发出自己的一套检测系统，如荷兰的Check-Points BV公司，利用ArrayTubett平台和技术，开发出可以用于沙门氏亚型鉴定的芯片产品：Salmonella Serovar ArrayTM，tt他们希望通过这个平台能为全部的1000多个沙门氏亚型作鉴定。这生物芯片技术在病毒、细tt菌、真菌等微生物分型分化、个体和种群，以及致病功能基因和一些环境响应基因的鉴定、tt检测上都已经开展了工作和取得了相应的一些成果。ArrayTube平台技术的性能价比很高，tt一是分析通量上，远高于基于传统可培养技术及基于核酸和PCR方法发展出来的常规分子标tt记方法；二是通量处理具有即时性与平行进行的特点；三是与同类生物芯片技术相比，在芯tt片技术所需核心设备上，它占有非常大的优势，其它类型的生物芯片平台需要专门的芯片杂tt交仪和扫描仪，有的还需专门的样品制备装置，成本上百万人民币；ArrayTube生物芯片只tt需ArrayTube读器一台，杂交过程比常规实验室的分子杂交简单，读器成本价格不过10万人tt民币。ArrayTube芯片单管点阵常规密度为14x 14，管数可集成达8管，从而提高形成更高tt密度的ArrayTube芯片以满足更高通量目标检测的需要。初次定制单片成本也仅需300～500tt元人民币，续制单片成本可降至100元以内。tt

　　发明内容tt

　　针对上述现有技术，本发明针对我国杨树溃疡病病原真菌的的种类特点，提供了一种检tt测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，以及其在检测杨树溃疡病病原真菌中的应用。tt

　　本发明是通过以下技术方案实现的：tt

　　一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，包括载体，以及位于载体上的寡核苷酸探针、tt杂交过程阳性对照点及空白的点涂层；所述寡核苷酸探针包括28条真菌探针，其序列如SEQ ttID NO.2、3、8～33所示，，详见表1；或所述寡核苷酸探针包括35条真菌探针，其序列如ttSEQ ID NO.1～35所示，详见表1；所述杂交过程阳性对照为Biotin。tt

　　表1寡核苷酸探针序列及物种信息tt

　　进一步地，所述载体为1.5mlEppendort离心管，芯片点制在截面了的底部内面(为ttArrayTube芯片)。tt

　　进一步地，所述寡核苷酸探针、杂交过程阳性对照及空白的点涂层呈阵列式分布在载体tt上。tt

　　进一步地，所述载体上的阵列式分布布局为人为规定，可以任意布局，比如图1所示的tt布局，(图中空白格和阴影格都示意为点阵的每个排布位点，点阵阴影区域的组合用于指示芯tttttt片图像方位，该区域非固定，可以随探针数量和设计而另选边区位点组成)。芯片点阵为14tt×14、面积为1平方毫米，图中a1-a14和b1-b14组合示表1中的芯片点阵行列，阿拉伯数tt字表示位于该点上的探针ID，比如矩阵中位置[a4，b14]、[a2,b9]、[a13,b6]的探针IDtt都是1，表明该三个位点上放置的都是名为BDO-1的探针，其杂交靶标物种是葡萄座腔菌。tt

　　本发明的寡核苷酸探针是针对杨树溃疡病病原真菌而设计的特异性探针，以ITS和ttEF1-a为靶标序列，共设计了28条真菌探针(ITS:14条，EF1-a：14条)或前后共涉及tt有35条真菌探针，分别针对Botryosphaeria mamane、B.rhodina、B.sarmentorum、ttB.eucalyptrum、Leucostoma niveum、B.australis、B.sarmentorum、B.tsugae、B.corticis、ttB.australis、B.ribis、B.dothidea、Fusicoccum viticlavatum、Entoleuca mammmte、Valsa ttsordida、V.ambiens等5属16个种。探针设计参数是：长度18～35bp，Tm控制在2℃变tt化内、GC％在30～80。tt

　　本发明的检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片的制备为Arrtube管芯片平台，但不限该tt平台。，芯片可委托芯片公司制备，各探针的点样浓度和点样量可依具体应用时不同基因芯片tt平台的制备要求而定。tt

　　本发明的检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，可以用于检测杨树溃疡病病原真菌，具tt体应用方式如下：tt

　　(一)样品制备：提取待检测物的真菌DNA，然后利用真菌特异性引物多重PCR扩增DNAtt和生物素荧光标记DNA，得标记的DNA扩增产物，用于下述杂交反应；tt

　　(二)杂交反应：取上述标记的DNA扩增产物，与杂交液混合，加样于芯片的点样区，tt杂交反应；杂交反应后，洗去杂交液；tt

　　(三)信号检测和结果分析：向芯片中加入辣根过氧化物酶，洗去未反应的辣根过氧化tt物酶；再加入底物四甲基对联苯二胺，则辣根过氧化物酶将底物转化成蓝色沉淀，洗去未反tt应的底物四甲基对联苯二胺；检测(通过AT－IconoClust软件即时检测)沉淀及其分布的tt位置，判断待检测物中是否含有杨树溃疡病病原真菌，判断依据为：若芯片上有蓝色沉淀，tt则待检测物中含有杨树溃疡病病原真菌，反之则无；并可根据寡核苷酸探针的阵列式分布判tt断出待检测物中含有哪种杨树溃疡病病原真菌(寡核苷酸探针及对应的杨树溃疡病病原真菌tt详见表1)。tt

　　进一步地，所述步骤(一)中，DNA提取采用常规CTAB法，具体为：2×CTAB缓冲液：tt2％CTAB，200mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L EDTA(pH8.0)，1.4mol/L NaCl，2％PVP，tt0.5％β-巯基乙醇；10×CTAB提取液：10％CTAB，0.7mol/L NaCl，其余同CTAB缓冲液；tt

　　具体方法如下：tt

　　(1)取冷冻干燥菌丝0.05g放入2mL离心管，用研磨杵研磨至粉末；tt

　　(2)加入1mL65℃预热的2×CTAB缓冲液和20μLβ-巯基乙醇，放入65℃的水浴tt锅中水浴60min；tt

　　(3)12000r/min离心，取上清液，放入新的离心管中，加入等体积的混合液(氯仿∶tt异戊醇＝24∶1，体积比)，上下颠倒2～3min，混匀，12000r/min离心10min；tt

　　(4)重复步骤(3)1～2次，直到界面层的沉淀物质很少后，进入下一步骤；tt

　　(5)取上清液放入新的离心管中，加入上清液1/10体积的10×CTAB缓冲液，再加入tt等体积的混合液(Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，体积比)，上下颠倒，混匀2～3ttmin，12000r/min离心10min；tt

　　(6)取上清液放入新的离心管中，加入上清液1/10体积的醋酸钠，再加入管液2～tt2.5倍体积的冰冻无水乙醇，沉淀DNA；tt

　　(7)10000r/min 4℃离心10min，倒掉上清液，用70％酒精(体积百分数)洗DNA 2～tt3次，37℃干燥至无酒精味，加入150μL的Elution buffer溶解DNA，即为标记的DNAtt扩增产物，放入-20℃冰箱中保存待用。tt

　　进一步地，所述步骤(一)中，特异性引物为ITS1/ITS4(真菌通用引物，用于扩增核tt糖体内部转录间隔区ITS1-5.8S-ITS2序列)和EF1-728F/EF1-986R(用于扩增延伸因子ttEF-1α)，其序列见表3，反向引物5’端添加生物素标记。tt

　　PCR扩增条件如下：反应体积50μL，反应组分为：5μL 10×Ex Taq buffer(Mg2+)，tt4μL dNTP Mixture(各2.5mM)，0.25μL Taq酶(5U/μL)(TaKaRa)，2μL各正反向引tt物(10μM)，2μL DNA模板，灭菌水补足50μL；参考Fujita(2001)反应程序修改为：tt94℃预变性4min，94℃变性30s，55.6℃退火30s，72℃延伸1min，31个循环，最tt后72℃延伸4min。tt

　　进一步地，所述步骤(二)、(三)具体步骤如下：tt

　　(1)提前预热热混仪到55℃，加入10μL标记的DNA扩增产物，再加入90μL的C1，混tt匀，得杂交混合液；tt

　　(2)取出管芯，加入200μL去离子水，用枪头混匀，不要碰到管芯底部；tt

　　(3)弃去步骤(2)中的去离子水，加入100μL的C1，55℃，550rpm羽化2min；tt

　　(4)弃去步骤(3)中的C1，将步骤(1)中的100μL杂交混合液转移到管芯中，避免tt泡沫，盖上盖子，55℃，550rpm，1h；tt

　　(5)从恒温振荡器中取出管芯，将恒温振荡器调到30℃用于HRP-连接；tt

　　(6)小心打开孔盖，尽可能完全的弃去杂交液，加入200μL的C2，小心混匀，弃去清tt洗液，重复两次；tt

　　(7)加入100μL的C3-C4混合液(C3:C4＝1:100，体积比)30℃，550rpm，10min；tt

　　(8)弃去C3-C4混合液，加入200μL的C5，清洗，弃去C5；再加入200μL的C5，清tt洗，弃去C5；tt

　　(9)加入100μL的D1，室温放置5min，勿搅动，弃去D1，ArrayTube 03设相分析(不tt能超过20min)；tt

　　(10)利用ICONOCLUST软件进行分析数据分析技术。tt

　　所述C1、C2、C3、C4、C5、D1的含义如下：tt

　　C1：杂交缓冲液，组成为：1％BSA或1×SSPE，10mmol/L NaHPO4，0.18mol/L NaCl，1mmol/LttEDTA，余量为水，pH7.4；其中，1×SSPE的组成为：150mM NaCl，10mM sodium phosphate(磷tt酸钠)，1mM EDTA，余量为水；tt

　　C2：冲洗液I，组成为：2×SSC，0.2％(重量百分数)十二烷基硫酸钠(SDS)或0.01％tt(重量百分数)Trition x-100，余量为水；其中，1×SSC的组成为：0.15M NaCl，0.0015Mtt柠檬酸钠，余量为水，pH7.0。tt

　　C3：HRP连接液100(HRP 100pg/μl)；tt

　　C4：连接缓冲液，组成为：6×SSPE，0.05％(体积百分数)Trition x-100，余量为水；tt其中，6×SSPE的组成为：60mM磷酸钠，1.08M NaCl，6mM EDTA，余量为水，pH7.4；tt

　　C5：冲洗液II，组成为：2×SSC，0.01％(体积百分数)Trition x-100，余量为水。tt

　　D1：Horseradish Peroxidase substrate TMB(四甲基对联苯二胺)。tt

　　ArrayTube检测性寡聚核苷酸芯片平台和技术的成功组建和运用，能有效解决我国林业tt微生物种群、种类、个体及其生态功能鉴定、鉴别、检测、监测及量化缺乏有效手段的困境，tt可迅速地将目前依旧以低效不准确的基于可培养方法技术检测森林病原微生物及其多样性、tt森林微生物资源管理上鉴别和鉴定相关技术的局面，提升到现代技术水平上。本发明通过在tt森林有害微生物中应用形成的ArrayTube基因芯片检测鉴定分析技术，为帮助解决我国主要tt森林病害真菌性溃疡病原种群建立机制不清、灾害流行及发生机制的深入了解、病原致病性tt分化分布、病害早期诊断困难、病害生态互作研究及发展控制技术等方面的难题和困难提供tt了支撑平台；为解决其它重大森林病虫害诊断、鉴定、早期检测、有害生物检疫技术等相关tt技术平台问题的平行地发展和应用奠定了基础。tt

　　快速正确的早期诊断是树木病害有效防控的关键，病害的快速正确诊断依赖于病原的迅tt速和准确检测和鉴定。当前环境污染和天气变化从遗传属性上改变着病原菌致病能力、从而tt使病害诊断复杂化，需要从流行生态学的角度给予病原准确快速的确定，因此利用组学知识tt和生物芯片技术，发展快速准确的高通量病原菌检测和鉴定技术成为必然趋势。本发明引进tt经济、有效和简便的管芯片(ArrayTube)技术，建立了管芯片微生物检测鉴定分析平台，并tt针对杨树重要病害杨树溃疡病存在多种症状类型和病原的复杂情况，构建了多重PCR扩增环tt境样本的芯片通量检测诊断杨树溃疡病技术。该技术在北京地区杨树溃疡病病原的检测结果tt显示具有良好应用前景。tt

　　管芯片点阵为14×14，可满足多达50多个分类单元的微生物对象的检测需要，通量上tt可以满足大部分重要病害微生物种群鉴别的水平；该芯片杂交环境微小而封闭不易污染、杂tt交结果稳定；分析平台组建灵活，可与常规分子实验设备整合形成自身平台；耗时少，杂交tt过程至结果判读在2小时内完成。我们构建的杨树主要溃疡病(溃疡和腐烂)类型的病原菌tt及其相关种属检测管芯片涵盖5属16种，包括了引起杨树水泡溃疡病病原真菌ttBotryophaeria dothidea、烂皮病病原菌Valsa sordida、枝枯病病原菌leucostoma niveum tt以及炭团溃疡病原菌Entoleuca mammata等。芯片对来自属外的子囊菌、担子菌、接合菌和tt卵菌无作用。同时为解决样本处理和样品批量处理的问题，通过优化实验，我们建立了直接tt从杨树干部组织(环境样本)中扩增出最大数量的微生物种类靶标序列的多重PCR技术，成tt功地扩增了来自林地杨树感病和健康树皮组织中真菌的目的分子产物，满足了后续高通量生tt物芯片杂交的靶标核酸分子的要求。所建立的多重PCR扩增环境样本的芯片通量检测诊断杨tt树溃疡病技术在北京地区的杨树溃疡病的检测中得到初步应用。本项目建立的平台和技术可tt以应用于我国杨树溃疡病诊断服务，也能为建立其它有害生物的高通量检测技术、及相关生tt物多样性为基础的应用和研究服务。tt

　　附图说明tt

　　图1：探针在芯片上的布局示意图。tt

　　图2：普通PCR扩增电泳示意图，其中，1-B.dothidea,2-N.parvum,3-L.theobromae,tt4-V.sordida,5-P.cactorum,6-Ascochyta sp.,7-A.bisporus,8-C.bertholletiae,9-ttL.terebrantis,10-E.mammata,11-V.ambiens,12-Leucostoma sp.。tt

　　图3：不同引物的普通PCR扩增电泳示意图，其中，1-P.cactorum，2-L.terebrantis，tt3-A.bisporus，4-C.bertholletiae，5-水。tt

　　图4：B.dothidea芯片杂交结果，其中，A：ITS产物杂交ITS PCR product；B：多重PCR ttmultiplex PCR；C：EF-1α产物杂交EF-1αPCR。tt

　　图5A：N.parvum芯片杂交结果，其中，a：ITS产物杂交ITS PCR product；b：多重PCR ttmultiplex PCR；c：EF-1α产物交EF-1αPCR。tt

　　图5B：6,19号探针多重比对结果。tt

　　图6：V.sordida芯片杂交结果，其中，A：ITS产物杂交ITS PCR product；B：多重PCR ttmultiplex PCR；C：EF-1α产物杂交EF-1αPCR。tt

　　图7：Ascochyta sp.芯片杂交结果，其中，A：ITS产物杂交ITS PCR product；B：多tt重PCR multiplex PCR；C：EF-1。tt

　　图8A：V.ambiens芯片杂交结果，其中，a：ITS产物杂交ITS PCR product；b：多重PCR ttmultiplex PCR；c：EF-1α产物杂交EF-1αPCR。tt

　　图8B：V.ambiens系统发育比对。tt

　　图9A：Leucostoma sp.系统发育比对。tt

　　图9B：Leucostoma niveum芯片杂交结果，其中，a：ITS产物杂交ITS PCR product；b：tt多重PCR multiplex PCR；c：EF-1α产物杂交EF-1αPCR。tt

　　图10：Lasiodiplodia theromaea芯片杂交结果，其中，A：ITS产物杂交ITS PCR product；ttttttB：多重PCR multiplex PCR；C：EF-1α产物杂交EF-1αPCR。tt

　　图11：对照菌株芯片杂交结果，其中，左侧：ITS产物杂交ITS PCR product；中部：多重PCRttmultiplex PCR，右侧：EF-1α产物杂交EF-1αPCR。tt

　　图12：芯片灵敏度检测，其中，A：终浓度final Concentration 1ng/μL；B：0.1ng/μL；ttC：0.01ng/。tt

　　图13：普通PCR扩增电泳示意图，其中，1,5：B.dothidea；2,6：V.sordida；3,7:V.ttambiens；4,8:Leucostoma sp.；M:DNA marker II。tt

　　图14：环境样本总DNA琼脂糖凝胶电泳，注：MY：密云；PG：平谷；TZ：通州；CP：昌tt平；DX：大兴；FS：房山；MTG：门头沟；SY：顺义；YQ：延庆；HR：怀柔；HD：海淀；CY：tt朝阳。1：感病样本；2：无症状样本。tt

　　图15：环境样本中普通PCR和多重PCR，其中，1,2,3.无症状Asymptomatic Populus；4,5,6.tt菌B.dothidea 0.001g；7,8,9.菌B.dothidea 0.01g；10,11,12.菌B.dothidea 0.025g；tt13,14,15.菌B.dothidea 0.05g；16,17,18.菌B.dothidea 0.1g；19,20,21.纯菌ttB.dothidea；22,23,24.对照水negative control(sterile distilled water)；M.ttMarker II；1,4,7,10,13,16,19,22.ITS扩增amplification；2,5,8,11,14,17,20,23.tt多重PCR multiplex PCR；3,6,9,12,15,18,21,24.EF-1α扩增amplification。tt

　　图16：图3-9环境样本普通PCR和多重PCR扩增，其中，1,ITS扩增amplification；2,tt多重PCR multiplex PCR；3,EF-1α扩增amplification。tt

　　图17：环境样本多重PCR芯片杂交结果，注：A,感病样本infected samples；B,无症状tt样本Asymptomatic samples。tt

　　具体实施方式tt

　　下面结合实施例对本发明作进一步的说明。tt

　　实施例中所涉及的方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规方法。实施例中所tt涉及的仪器、试剂，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂。tt

　　实施例1构建基因芯片tt

　　一种检测杨树溃疡病病原真菌的基因芯片，包括载体，以及位于载体上的寡核苷酸探针、tt杂交过程阳性对照探针及空白的点涂层；所述寡核苷酸探针包括28条真菌探针，其序列如ttSEQ ID NO.2、3、8～33所示；所述杂交过程阳性对照为Biotin。tt

　　所述载体为1.5mlEppendort离心管，芯片点制在截面了的底部内面(为ArrayTube芯tt片)。tt

　　所述寡核苷酸探针、杂交过程阳性对照探针及空白的点涂层呈阵列式分布在载体上。tt

　　所述载体上的阵列式分布布局为如图1所示的布局【图中空白格和阴影格都示意为点阵tt的每个排布点，阴影区域的点阵用于指示芯片图像方位，该区域可以随探针数量的变化而活tt动(即另选区域)】，1平方毫米面积中点阵为14×14，图中a1-a14和b1-b14组合示表1中tt的芯片点阵行列，阿拉伯数字表示位于该点上的探针ID，比如矩阵中位置[a4，b14]、[a2,b9]、tt[a13,b6]的探针ID都是1，表明该三个位点上放置的都是名为BDO-1的探针，其杂交靶标tt物种是葡萄座腔菌。tt

　　本发明的寡核苷酸探针是针对杨树溃疡病病原真菌而设计的特异性探针，以ITS和ttEF1-a为靶标序列，共设计了28条真菌探针(ITS:14条，EF1-a：14条)，分别针对ttBotryosphaeria mamane、B.rhodina、B.sarmentorum、B.eucalyptrum、Leucostoma niveum、ttB.australis、B.sarmentorum、B.tsugae、B.corticis、B.australis、B.ribis、B.dothidea、ttFusicoccum viticlavatum、Entoleuca mammmte、Valsa sordida、V.ambiens等5属16个tt种。探针设计参数是：长度18～35bp，Tm控制在2℃变化内、GC％在30～80。tt

　　实施例2对基因芯片进行有效性评价tt

　　(一)评价研究的材料与方法tt

　　(1)材料：用于专化性供试菌株有靶标菌种及近缘的子囊菌Ascochyta sp.担子菌ttAgaricus bisporus、接合菌Cunninghamella bertholletiae、卵菌Phytophthora cactorum，tt详见表2。tt

　　表2供试菌株及来源tt

　　(2)仪器设备tt

　　全能台式高速冷冻离心机(Stratos)，PCR仪(Biometra)，超微核酸蛋白tt测定仪(Nanodrop ND-1000)，分子杂交恒温振荡仪(Eppendorf Thermomixer comfort)，HDLtt超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，凝胶成像系统(Alpha imager EP)，DYY-4型稳tt压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，Eppendorf移液器、微波炉，陶瓷研钵，1.5mL离心管，tt量筒，烧杯，玻璃棒，镊子，1000、200、10、2.5μL的Eppendorf移液器，手术tt剪刀，电子天平，旋涡混合器等。tt

　　(3)实验常规试剂及配制tt

　　液氮，β-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，异丙醇，无水乙醇，95％乙醇，Tris(三羟甲基氨tt基甲烷)，硼酸，EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，NaOH，CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)，NaCl，RNase ttA，电泳级琼脂糖，溴化乙锭，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；双蒸水PDA培养基：20g葡萄糖，17tt琼脂粉，200g土豆；1000ml水苯酚/氯仿抽提液：Tris饱和酚、三氯甲烷和异戊醇(25:24:1)tt比例混合；2×CTAB缓冲液、10％CTAB、5×TBE芯片杂交试剂。C1：杂交缓冲液；C2：冲tt洗液I；C3：HRP连接液；C4：连接缓冲液；C5：冲洗液II；D1：Horseradish Peroxidase ttsubstrate TMB(四甲基对联苯二胺)。tt

　　(二)方法tt

　　(1)供试菌株培养和菌丝体收集：将所选菌株接种到固体PDA培养基上活化，25℃黑tt暗培养3天，挑取菌丝转入至马铃薯葡萄糖液体培养基中，震荡培养5天，收集菌丝球，tt用无菌水洗涤3次，无菌滤纸吸干水分，-20℃保存备用。tt

　　(2)DNA提取见上述核酸提取技术。tt

　　(3)DNA电泳及浓度和吸收曲线的测定：取4μL样品，加入1/6体积的6×Loading ttBuffer，0.8％琼脂糖凝胶(含EB)电泳检测DNA，以MarkerIII(天根)为DNA分子标准，tt100V电压电泳40min，然后用凝胶成像仪观察。利用Thermo Nanodrop ND-1000微量测定tt仪测定DNA浓度及260nm吸收曲线。先用2μL双蒸水清洗加样孔处，然后在样品孔处滴加tt2μLDNA洗脱液做空白对照，最后取2μLDNA样品进行测定，取部分稀释成约50-100ng/μL，tt-20℃保存备用。tt

　　(4)普通PCR：tt

　　利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增核糖体内部转录间隔区ITS1-5.8S-ITS2序列；利用tt引物EF1-728F/EF1-986R扩增延伸因子EF-1α，反向引物5’端添加生物素标记。普通PCRtt扩增体系为50μL，反应组分为：5μL 10×Ex Taq buffer(Mg2+)，4μL dNTP Mixture(各tt2.5mM)，0.25μL Taq酶(5U/μL)(TaKaRa)，2μL各正反向引物(10μM)，2μL DNA模板，tt灭菌水补足50μL；参考Fujita(2001)反应程序修改为：94℃预变性4min，94℃变tt性30s，55.6℃退火30s，72℃延伸1min，31个循环，最后72℃延伸4min。其中EF-1ttα扩增，除了引物改变之外，其余条件都相同，操作在冰上进行。tt

　　取5μL PCR产物样品，加入2μL的6×Loading Buffer，以DNA MarkerII或Marker ttD2000(天根公司)为分子量标准，在2.2％琼脂糖凝胶(含EB)中120V，电泳40-60min，tt观察电泳结果。具体引物信息见表3。tt

　　表3引物及参数tt

　　选取菌株V.sordida进行灵敏度的验证，起始浓度为500ng/μL，反应体系中加入模板tt量为2μL，即V.sordida DNA模板加入量为1000ng，500ng，100ng，10ng，1ng，0.1ng，tt0.01ng，0.001ng八个梯度，进行多重PCR，无菌双蒸水作为阴性对照。tt

　　(5)测序及鉴定：将普通PCR和多重PCR扩增产物，切胶回收纯化，进行双向测序(华tt大基因公司)，测序引物和扩增引物相同。将所测序列在GenBank中进行Blast，进行同源tt性比较，通过Score和E-value值进行判定相似性大小。利用MEGA version 5.0对ITS基tt因苯酚序列进行多重比对，以为参照菌株，进行聚类分析，聚类分析方法为ttNeighbor-jioning，聚类的距离采用P距离，Bootsrap1000计算，结合培养学，形态学对tt实验菌株进行系统发育分析。tt

　　(三)结果与分析tt

　　(1)PCR扩增tt

　　对于普通PCR，首先进行温度梯度PCR，以便确定最佳退火温度。结果显示最适退火温tt度为58℃，能够同时单独扩增ITS，EF-1α。对于所有的菌株除L.terebrantis(经过重复tt扩增后，也得到目的条带)，利用ITS1/ITS4引物可以扩增目的条带，片段大tt小为500-700bp，而P.cactorum和L.terebrantis ITS扩增条带大于700bp；EF-1α片tt段约为300bp，菌株P.cactorum，L.terebrantis，A.bisporus，C.bertholletiae，Ascochyta ttsp.则没有扩增出目的条带，如图2。通过改变退火温度，引物浓度，以及模板浓度等都无法tt很好的扩增出这些菌的EF-1α条带。扩增体系和程序不变，将这四种菌株分别利用三种引物tt进行扩增，扩增结果如图3，从图上看出只有P.cactorum利用引物Elongf1/ElongR1扩tt增较好，而其余三种菌均未得到单一条带，扩增片段大小为700-900bp。L.terebrantis利tt用EF1F/EF2R，MEF1/MEF4均能扩增出目的条带，扩增片段分别为500-700bp，350bp，但tt后者稳定性不高，因此最终选择EF1F/EF2R。同样，C.bertholletiae利用EF1F/EF2R，ttMEF1/MEF4扩增片段为500-700bp。而A.bisporus利用以上三种引物都无法很好扩增，改tt变扩增条件仍然不能扩增，因此，选择引物EF1-983F/EF1-2218R(900-1200)。每一种菌株扩tt增后进行序列比对，相似性达97％以上。tt

　　(2)芯片专化性验证tt

　　在PCR成功扩增的基础上，分别利用不同的标准菌株对芯片上的探针进行验证。选择12tt种菌株，这些菌株通过形态观察和PCR测序后比对确定。通过PCR无需经过变性，直接进tt行芯片杂交。B.dothidea，V.sordida作为靶标菌株，而L.terebrantis，P.cactorum，A.ttbisporus,C.bertholletiae作为非靶标菌株进行对照，其中对照菌株L.terebrantis，ttP.cactorum，A.bisporus，C.bertholletiae的PCR扩增产物均没有产生阳性结果，只出tt现生物素标记探针(图11)，Ascochyta sp.杂交上探针1，2。B.dothidea，N.parvum，单tt一PCR和多重PCR杂交结果一致。B.dothidea ITS产物没杂交上任何探针，EF-1α扩增tt多重PCR产物只杂交到靶标探针1,2，杂交结果相同(图4)。tt

　　菌株MUCL8118通过测序比对，相似性较高的是N.parvum，通过EF-1α序列系统发育tt分析后，与B.ribis和B.parva较接近：而普通PCR和多重PCR杂交上B.tteucalyptorum ITS探针和B.ribis EF-1α2个探针，通过ITS序列与探针19比较后发tt现序列上只有第2个碱基和最后一个碱基与探针不同，而其余碱基都相同，而将N.parvum ttEF-1α序列进行6号探针查找，只有2个碱基差异。所以，在杂交过程中，杂交上的可能tttttt性很大，如图5A、B所示。tt

　　V.sordida ITS扩增和多重PCR只杂交到属探针50，没有杂交到种探针。而EF扩增tt产物杂交到1，2，10号探针。三个探针均可以在序列中找到，三个探针退火温度很相近，tt而GC含量不同，种探针和属探针位置不同，种探针位置于429-451bp处，而属探针位于tt45-63，64-93bp 5端位置(图6)。因此，当多个探针存在时，当进行杂交时，会出现一些tt优先杂交的现象。但是EF-1α产物杂交出现交叉杂交，经过探针比对后，只有几个碱基是tt相同的，比较分散，因此推断，而当两个靶标存在时，只杂交上了ITS探针，Ascochyta sp.ITStt扩增未出现非特异性杂交，而EF-1α产物和多重PCR产物杂交到1，2探针和10号探针。tt但是和B.dothidea杂交图谱相比，多杂交上一个10号探针。tt

　　Ascochytasp.ITS扩增未出现非特异性杂交，而EF-1α产物和多重PCR产物杂交到1，2tt探针和10号探针(图7)。但是和B.dothidea杂交图谱相比，多杂交上一个10号探针。tt

　　V.ambiens普通PCR和多重PCR杂交结果，ITS扩增产物只杂交上51号探针，为Vaslatt属探针，EF-1α扩增产物杂交只出现生物素标记。在ITS序列上，只能找到51号探针，而其tt余探针(22,23)无法找到；同样EF序列，也无法找到探针(1，2)，所以普通PCR杂交结果tt和分析的一致。多重PCR产物杂交上11号探针和1，2号探针，而没有杂交上靶标探针(图tt8A)。但是经过测序比对，系统发育分析之后，Cytosporarhodophita较接近，而与V.ambienstt关系较远，不在一个分支上(图8B)，因此该菌需要再鉴定。tt

　　Leucostomasp.ITS序列比对，系统发育树分析后和Leucostomaniveum(DQ243794.1)tt相似性较高，如图9A，由此判断该菌为Leucostomaniveum，而且可以找到24号探针(靶标tt探针)。Leucostomasp.ITS扩增和EF-1α扩增产物均没有杂交上任何探针，而多重PCR杂交tt上11号探针，如图9B。tt

　　CXY575以形态鉴定为B.rhodina，ITS测序后和Lasiodiplodia pesudotheromaeatt相似性较高，通过探针比对，可以找到探针11，12，该探针是根据设计的B.rhodina靶标tt探针；ITS扩增产物通过杂交，杂交上12号探针，而EF-1α产物杂交上探针1，2；多重ttPCR产物杂交上靶标探针11，12，同时也杂交上非靶标点1，2，10(图10)。而同样将ttCXY585(L.pesudotheromaea)和B.rhodina，L.theromaea比对后，都可以找到11，12号探tt针，而且L.pesudotheromaea，L.theromaea和B.rhodina ITS序列只有两个碱基的差别。tt所以该探针不能很明确的将B.rhodina区分。tt

　　(3)芯片灵敏度验证tt

　　能够检测到得起始材料的最小量或者调查微生物样本针对目标物的丰度，即为灵敏度。tt依据样本的特点，1-10ngDNA能够产生足够的PCR产物用于杂交。在本实验中，将V.sordidatt多重PCR产物稀释，进行稀释。终浓度为1×10-2ng/μL能够检测到靶标序列，当稀释10倍tt时，检测到靶标信号强度变弱，当终浓度为1×10-3ng/μL时，没有杂交到任何把标点(图tt12)。tt

　　(4)小结tt

　　针对树木溃疡病病原真菌，以内部转录间隔区ITS和转录延伸因子EF-1α两个区域设tt计探针，选择12种已知菌株进行芯片有效化验证，通过反向引物添加生物素修饰后，用于tt芯片杂交，这种方法是可行，初步试验证明多重PCR基因芯片能够用于溃疡病的病原检测tt中。通过调整普通PCR，确定同时扩增不同基因的条件，在成功扩增的基础上，对多重PCRtt退火温度、模板浓度和引物浓度进行优化。结果表明：退火温度为55.6℃，各引物浓度为tt0.2μM时，可以成功地扩增出目的条带，通过测序比较，多重PCR和普通PCR扩增条带相tt吻合。在此基础上进行芯片杂交，普通PCR和多重PCR杂交结果基本吻合，B.dothidea，ttV.sordida普通PCR和多重PCR只杂交到靶标探针，V.sordida只杂交到属探针，但是种tt探针没有杂交上。B.dothidea，V.sordida，N.parvum单一PCR和多重PCR杂交结果一致,tt其中对照菌株L.terebrantis，P.cactorum，A.bisporus，C.bertholletiae多重PCR和tttttt普通PCR扩增产物均没有产生阳性结果，只出现生物素标记探针，而部分菌株出现非特异性tt杂交。但总体来看，杂交专化性较强，多重基因组DNA检测的灵敏度最低可达1ng，而基因tt芯片的灵敏度比其高10倍。从而建立一套多重PCR-基因芯片技术快速，准确鉴定病原菌。tt

　　实施例3北京地区杨树溃疡病多重PCR基因芯片检测tt

　　(一)材料与方法tt

　　(1)材料tt

　　采集地点为北京地区杨树，根据不同的区域进行采样，主要包括海淀区，朝阳区，昌平tt区，延庆区，怀柔区，密云区，平谷区，顺义区，通州区，大兴区，房山区，门头沟区。在tt每个地区内选择3-8个点，进行样本采集。采集地区分布以及采集地点状况如图13。每个tt地区选择一个样点，感病和无症状样本，总共24个样本用于杂交。用于芯片杂交环境样本tt采集地点，寄主及生境情况如表4；tt

　　表4芯片杂交样本采集地点、寄主及生境tt

　　(2)方法tt

　　环境样本DNA提取：DNA提取之前，取感病和健康的杨树树皮进行表面消毒，用75％tt的酒精进行擦拭，然后用灭菌的刀子切割成3×3mm大小放入研钵中用液氮研磨成粉末。DNAtt提取方法参考上述CTAB法进行。tt

　　生物素标记多重PCR：将DNA模板进行100×稀释，然后进行多重PCR杂交，杂交引tt物为ITS1/ITS4，EF1-728F/EF1-986R(生物素标记)。多重PCR扩增，对于不同供试菌株tt选择不同的引物组合进行多重PCR扩增。扩增体系有两种，1)包括5μL 10×PCR buffer、tt引物(pm/μL)各1μL、4μL各10mM dNTP、35μL H2O、0.25μL 2.5U/μL Taq酶、DNA模tt板1-2μL，50μL。2)包括25μL 2×Taq plus MasterMix(天根公司)、引物(pm/μL)各1μL、ttDNA模板1-2μL，19μL ddH2O，牛血清白蛋白(BSA)，50μL。反应程序：94℃预变性4min，tt94℃变性30s，55.6℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环，最后72℃延伸4min。tt

　　取5μLPCR产物，加入1/6体积的Loadingbuffer，2.2％琼脂糖凝胶(含EB)电泳检测ttDNA，以MarkerII为DNA分子标准，100V电压电泳90min，用凝胶成像分析仪采集图像。tt

　　芯片杂交：将环境样本的多重PCR产物进行纯化，纯化之后将模板浓度稀释至5-10ngtt芯片杂交的方法同上述芯片杂交方法。tt

　　环境样本克隆：为了进一步验证芯片杂交结果，选择9个样本进行ITS扩增，然后进tt行克隆。将PCR产物经过纯化之后进行克隆，利用pGEM T-easy载体，转入Trans1-T1phage ttttttResistant感受态细胞中。克隆步骤；1)取纯化的PCR产物用于载体连接(1-4μL PCR产tt物+μL 1载体5μL)离心，25℃，8min。2)取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入2连tt接产物，轻轻混匀，冰浴30min。3)42℃水浴热激30s，然后快速转移到冰水混合物中，tt2min(离心管勿动)。4)向每个离心管中加入1ml LB(无AMP)，混匀置于37℃，200转/min，tt培养1h。5)离心，弃700μL上清液，然后取100μL，200μL均匀涂布到LB培养基上(含ttAMP)至液体被吸收，倒置，37℃过夜培养。6)用枪头挑取单克隆子，20-50个，挑入1mlLBtt液体培养基中，37℃摇晃7-9个小时，每一个菌液作为PCR模板，反应体系和先前一样，tt菌液模板加入1μL，反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，55.6℃退火30s，tt72℃延伸30s，24个循环，最后72℃延伸3min。PCR扩增后，选择不同大小片段的克tt隆子进行测序。测序引物为M13F，测序完毕之后，将测得序列弃去载体序列，在National ttCenter for Biotechnology Information(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)进行Blast。tt

　　2)结果与分析tt

　　(1)环境样本DNA提取通过CTAB法提取杨树韧皮部组织总DNA，通过电泳后，DNA条tt带很亮，无降解现象(图14)，进一步用核酸仪检测，无症状的组织OD260/280在1.8左右，tt但是感病组织测得OD260/280<1.8，说明在DNA溶液中可能含有蛋白质、多酚、糖类单宁，tt色素等物质存在，而且在DNA提取过程中，一些感病的植物样本褐化很严重，为了减少一些tt酚类、醌类及单宁类物质的影响，加入了PVP，但最终得到的DNA溶液也呈褐色。tt

　　(2)模拟环境样本普通PCR和多重PCR扩增将无症状北京杨枝条和纯菌(B.dothidea)tt研磨，然后将不同质量的菌加入到定量的环境样本中，直接进行普通PCR和多重PCR，都可tt以扩增出片段。其中图上19，20，21三个泳道为纯菌(B.dothidea)ITS，ITS/EF-1α，EF-1ttα扩增目的片段，而其余为混合模板(菌和环境样本)扩增结果(图15)。不同的菌量和环tt境样本混合物多重PCR扩增不一样的。相对于ITS扩增，环境样本的EF1-α扩增条带很弱，tt而且未加菌的样本多重PCR扩增只出现模糊的ITS条带。一方面环境样本中含菌量低得到真tt菌DNA少，另一方面，有可能是植物组织中含有一些物质，影响DNA的扩增。将其扩增片段tt和纯菌扩增片段大小比较后，结果显示混合模板和纯菌扩增条带大小一致。挑取混合模板多tt重PCR扩增条带，进行测序，将测得ITS序列和EF1-α序列分别同源性比较(结果未显示)，tt测序结果和加入菌(B.dothidea)一致。tt

　　(3)直接环境样本多重PCR扩增tt

　　以有症状和无症状杨树组织作为DNA模板，以ITS1/ITS4和EF1-728F/EF1-986R作为引tt物，进行多重PCR扩增，电泳结果如图。其中每一个样本ITS扩增能够扩增出目的条带，而tt且有几条带堆积在一起。而延伸因子的扩增条带出现“微笑型”并且伴有弥散现象(图16)。tt同样，多重PCR扩增条带较弱，而且也出现弥散现象。而且在PCR扩增过程中很有可能成为ttPCR的抑制剂，从而影响PCR扩增，而且提取的总DNA中含有植物DNA，为了减少DNA中抑制tt剂，将DNA模板进行不同倍数的稀释。利用直接对环境样本A.malaccensis进行PCR扩增，tt测序，分别褐色和白色木块进行DNA提取，白色木块中分离到的分离物序列要比褐色木块中tt相似性要高。可能由于在褐色木块中，有一些次生代谢产物的影响，会抑制PCR过程中酶的tt活性和测序过程。另外一个原因是在PCR产物中存在不同的序列，也会影响到测序，最好的tt办法就是进行克隆。tt

　　(4)环境样本芯片杂交tt

　　对采自北京地区杨树溃疡病树皮组织的直接提取DNA及多重PCR扩增靶标的24个样本进tt行芯片应用测试，其中12个感病样本，有6个样本中检测出含有树木溃疡病菌是ttBotryosphaeriadothidea，分别是延庆，平谷，大兴，房山，顺义和怀柔；朝阳地区样本检tt测出是Vasla属。而健康样本中，有3个样本检测出含有B.dothidea分别是房山，顺义和怀tt柔；此外，昌平，海淀，门头沟，密云，通州，没有杂交到任何靶标点，芯片杂交结果如图tt17。tt

　　(5)克隆tt

　　为了验证芯片杂交的结果，选择昌平区，延庆区，怀柔区，密云区，平谷区，顺义区，tt通州区，大兴区，房山区，门头沟区感病(杂交样本)通过ITS1/ITS4扩增后进行克隆，tt克隆结果显示如表5，门头沟，密云，通州三个地区的样本杂交，没有杂交上任何探针，同tt样克隆也没有得到该菌，而是其他Hyalodendriella sp.，coniothyrium fuckelii，ttPeyronellaea sp.；其他地区样本杂交到B.dothidea，通过克隆也得到该菌株和其他菌。结tt果表明杂交结果和克隆结果基本吻合。tt

　　表5tt