多巴胺D1受体基因型检测芯片及其检测多巴胺D1受体的方法
技术领域t
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种多巴胺D1受体基因型检测芯片及其检测多巴胺D1受体的方法。t
背景技术t
多巴胺受体在中枢神经系统中表达,控制运动功能、情绪、内分泌生理系统。多巴胺受体与某些神经精神病(如药物依赖、帕金森病、精神分裂症、狂躁、抑郁症等)、肾病、心血管疾病有关。t
多巴胺作为中枢神经系统的重要神经递质,主要参与运动、情感以及神经内分泌的调节。目前已分离出五种多巴胺受体(DA2R),根据它们的生物化学和药理学性质,分为D1类受体和D2类受体两大家族。D1类受体则包括D1受体和D5受体(在大鼠中分别称为D1A受体和D1B受体)两种,它们激活后会升高细胞内cAMP水平。D2类受体则包括D2受体、D3受体以及D4受体三种,它们激活后则会降低细胞内cAMP水平。t
两类受体的C端含有磷酸化和棕榈酰化位点,涉及激动剂依赖性受体的去敏感化过程和第四胞内环的形成多巴胺的配体化合物很容易将D1类受体和D2类受体两大家族区分开来,但大多数化合物不能区分同一家族的受体亚型(比如D1受体和D5受体)。t
20世纪90年代以来分子生物学以及基因遗传学迅速发展,推动了脑内多巴胺受体(dopamine receptor,DR)的分子克隆、DR亚型结构与功能的关系研究。随着对多巴胺受体亚型研究的不断深入,人们发现多巴胺D1受体的遗传多态性与神经性精神病直接相关。具体来说,多巴胺D1受体在人群中存在不同的基因型(即基因多态性),而基因型不同的多巴胺D1受体对不同的精神药物作用明显不同,最终导致基因型不同的精神病患者对同一精神药物的药效存在差异。因此检测多巴胺D1受体的基因型方法的研究是学界研究热点。t
但目前测定多巴胺D1受体的基因型的方法主要是采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)、手工或自动顺序、序列特异性引物PCR等方法,这些方法不仅操作繁琐,检测周期长,而且影响检测结果的因素多,不易控制,难以满足实际应用的要求,使科研单位和临床上至今还无法广泛开展有关多巴胺D1受体的基因型的检测。t
发明内容t
本发明的目的之一在于解决上述问题,提供一种操作简单、结果准确、检测周期短的多巴胺D1受体基因型检测芯片。t
本发明的另一目的在于提供上述多巴胺D1受体基因型检测芯片检测多巴胺D1受体的方法。t
实现本发明目的之一的技术方案是:一种多巴胺D1受体基因型检测芯片,包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针;所述寡核苷酸探针的核苷酸序列为以下序列或其互补序列中突变位点在内的14~20个碱基:DRD1_109G>A(rs10061709)、DRD1_262T>C(rs265981)、DRD1_371G>T(rs11742764)、DRD1_968G>A(rs5326)、DRD1_1014G>A(rs4532)、DRD1_1170A>C(rs5327)、DRD1_1171C>G(rs5328)、DRD1_1202C>G(rs5329)、DRD1_1211G>T(rs5330)、DRD1_1259G>A(rs1799914)、DRD1_1656T>G(rs5331)、DRD1_1746G>A(rs13306309)、DRD1_2105C>T(rs6272)、DRD1_2324A>G(rs155417)、DRD1_2413G>A(rs5332)、DRD1_2464C>T(rs686)、DRD1_2465T>C(rs1788861)、DRD1_3265A>G(rs4867798)。t
为了增强检测信号的强度,提高检测结果的准确率,所述突变位点位于14~20个碱基的中部。t
所述寡核苷酸探针的5’端还具有一段氨基修饰的16聚脱氧胸苷酸。t
所述固相载体包括但不限于尼龙膜、未修饰的或经活性基团修饰的玻璃片、塑料片、硅片。t
所述活性基团包括但不限于醛基、氨基、异硫酸基,优选醛基。t
上述基因型检测芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。t
例如,如果固相载体采用的是经修饰的载玻片或者硅片,探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串,则可将寡核苷酸探针配置成溶液,然后用点样仪将其点在经修饰的载玻片或者硅片上,排列成预定的阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的基因型检测芯片。t
又如,如果寡核苷酸探针不含氨基修饰的聚dT串,则可参照:王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》或者马立人,蒋中华主编的《生物芯片》。t
实现本发明另一目的的技术方案是:一种多巴胺D1受体基因型检测芯片检测多巴胺D1受体的方法,具有以下步骤:t
①制备染色体DNA;t
②用聚合酶链反应方法扩增所制得的染色体DNA的基因片段;t
③将扩增产物与多巴胺D1受体基因型检测芯片进行杂交;t
④检测多巴胺D1受体基因型检测芯片上的杂交信号。t
上述步骤①制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法有很多,可以从全血中制备、也可以从发根中制备,还可以从口腔黏膜的脱落物中制备。t
上述步骤②用PCR方法扩增染色体DNA的基因片段的方法采用常规技术,其中的关键在于扩增引物的设计。t
上述步骤③的杂交可按照本领域的经典方法进行,可以先将基因型检测芯片与预杂交液进行预杂交,再与扩增产物在杂交缓冲液中进行杂交。t
本发明具有的积极效果:(1)本发明的多巴胺D1受体基因型检测芯片检测操作简单,检测灵敏度率大于96%,检测特异度率大于98%。(2)本发明的基因型检测芯片通过将能反映样本中大量基因信息的寡核苷酸探针有序固定在固相支持物上形成阵列,通过与实际样本或者扩增产物进行杂交反应,只需一次实验,即可高通量获得所有待检基因的信息,具有广阔的推广应用前景。t
附图说明t
图1为制备实施例1的多巴胺D1受体基因型检测芯片的点样阵列。t
图2为应用例中检测到的多巴胺D1受体基因型检测芯片上的杂交信号。t
具体实施方式t
(实施例1)t
本实施例的多巴胺D1受体基因型检测芯片包括固相载体和有序固定在固相载体上的寡核苷酸探针。t
本实施例采用的固相载体为醛基修饰的载玻片(产品编号:BSM03011,上海百傲科技有限公司)。t
寡核苷酸探针经人工合成得到(上海生工生物工程技术服务有限公司),其核苷酸序列如SEQ ID No.73~SEQ ID No.108所示。t
该基因型检测芯片的制备方法为:将寡核苷酸探针用水溶解至浓度为100 mM,然后用2×点样缓冲液(产品编号:BST02010,上海百傲科技有限公司)等比例混合,接着用Affmetrix公司的GMS417点样仪按照图1所示阵列点制,最后室温(15℃~25℃,下同)放置过夜,即得。t
(应用例)t
本应用例为采用实施例1的多巴胺D1受体基因型检测芯片(非诊断目的)检测多巴胺D1受体的方法,具有以下步骤:t
①制备染色体DNA。t
用一次性无菌注射针头抽取待检者全血500mL,收集于含50mL浓度为2wt%的EDTA溶液的无菌的1.5mL离心管中,将管盖盖上,上下颠倒数次,混合均匀。t
向另一支无菌的1.5mL的离心管中加入均匀的待检全血100mL和纯水300 mL,充分混合均匀,室温静置8min;将离心管置离心机中,10,000g离心1min;取出离心管,倾去上清液,离心管底部可见少量白色沉淀;向离心管中加入抽提液(产品编号:BST01010,上海百傲科技有限公司)60 mL,充分振荡使沉淀溶解;沸水浴中15min;取出离心管,置离心机中,12,000g离心15min。t
离心后的上清液(即为染色体DNA)可直接用于PCR扩增。t
②用聚合酶链反应(PCR)方法扩增所制得的染色体DNA的基因片段。t
所述的染色体DNA的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1~SEQ ID No.36所示。t
扩增过程如下:t
A、设计并合成扩增引物(委托上海生工生物技术服务有限公司合成),扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37~SEQ ID No.72所示。t
B、用水将扩增引物溶解并稀释至10mM。t
C、将市售的10×缓冲液(产品编号:Lot00083585,Fermentas)、dNTP(产品编号:Lot00083613,Fermentas)、Taq酶(产品编号:Lot00085632,Fermentas)、上述扩增引物、纯水以及染色体DNA制备过程中获得的PCR扩增模板按表1的配方配制PCR扩增体系。t
表1t
D、用PCR扩增仪(美国ABI公司GeneAmp 9700型)按以下程序进行扩增反应,得到扩增产物:94℃,5min;然后94℃,30s;60℃,30s;72℃,1min;执行35个循环;最后保持72℃,7min。t
③将扩增产物与多巴胺D1受体基因型检测芯片进行杂交。t
采用上海百傲科技有限公司的芯片杂交试剂盒与芯片显色试剂盒进行此杂交试验。t
其中,芯片杂交试剂盒(产品编号:BSTO05010,上海百傲科技有限公司)包含:预杂交液、杂交缓冲液、洗液A、反应舱。芯片显色试剂盒(产品编号:BST06010,上海百傲科技有限公司)包含:抗体液、洗液B、洗液C、显色液。t
杂交过程如下:t
a、将实施例1制得的多巴胺D1受体基因型检测芯片用预杂交液在39℃的温度下预杂交5min,然后除去预杂交液。t
b、将步骤②得到的扩增产物在98℃变性5 min,然后取其中10 mL加至190 mL杂交缓冲液中混匀,与预杂交后的基因型检测芯片在39℃的温度下进行杂交反应30min。t
c、将杂交后的基因型检测芯片先用已预热至杂交温度(39℃)的洗液A洗涤2次,每次10min,再用洗液B在室温下洗涤2min。t
d、将基因型检测芯片与抗体液室温反应20min,然后将基因型检测芯片用洗液B在室温下洗涤5min,再重复此步骤一次。t
e、将基因型检测芯片用洗液C在室温下洗涤2min。t
f、在基因型检测芯片上加显色液200 mL,39℃放置40min。t
g、用水冲洗干净,晾干即可。t
④检测多巴胺D1受体基因型检测芯片上的杂交信号。t
将杂交并洗涤完毕的基因型检测芯片置于Baio BE3.0生物芯片识读仪(产品编号:BSE01021,上海百傲科技有限公司)上扫描即得检测结果,见图2。t
结果表明,受检者的DRD1基因型为:DRD1_109G、DRD1_262T、DRD1_371T、DRD1_968G、DRD1_1014A、DRD1_1170C、DRD1_1171G、DRD1_1202C、DRD1_1211T、DRD1_1259G、DRD1_1656T、DRD1_1746A、DRD1_2105C、DRD1_2324G、DRD1_2413G、DRD1_2464C、DRD1_2465C、DRD1_3265A。 t
SEQUENCE LISTINGt
<110> 中国人民解放军第一〇二医院;江苏大学t
<120> 多巴胺D1受体基因型检测芯片及其检测多巴胺D1受体的方法t
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<170> PatentIn version 3.3t
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<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 55t
cacgtcaagc ccaacctaat 20t
<210> 56t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 56t
cacgtcaagc ccaacctaat 20t
<210> 57t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 57t
cacgtcaagc ccaacctaat 20t
<210> 58t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 58t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 59t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 59t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 60t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 60t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 61t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 61t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 62t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 62t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 63t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 63t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 64t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 64t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 65t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 65t
gtggtggtct ggcaattctt 20t
<210> 66t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 66t
gcaggacata tgccatctca 20t
<210> 67t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 67t
gtgtgttgga aagcagcaga 20t
<210> 68t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 68t
gtgtgttgga aagcagcaga 20t
<210> 69t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 69t
gtgtgttgga aagcagcaga 20t
<210> 70t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 70t
gtgtgttgga aagcagcaga 20t
<210> 71t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 71t
gtgtgttgga aagcagcaga 20t
<210> 72t
<211> 20t
<212> DNAt
<213> 引物序列t
<400> 72t
aaaagatgga gagggccaat 20t
<210> 73t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 73t
tttttttttt ttttttccag agccttggcg a 31t
<210> 74t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 74t
tttttttttt ttttttccag agctttggcg a 31t
<210> 75t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 75t
tttttttttt ttttttcggc ggcagcccac t 31t
<210> 76t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 76t
tttttttttt ttttttcggc ggcggcccac t 31t
<210> 77t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 77t
tttttttttt ttttttagcg cgcctgagcc c 31t
<210> 78t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 78t
tttttttttt ttttttagcg cgcatgagcc c 31t
<210> 79t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 79t
tttttttttt tttttttccc caccaggcag c 31t
<210> 80t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 80t
tttttttttt tttttttccc cactaggcag c 31t
<210> 81t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 81t
tttttttttt ttttttagat ttccaggagt c 31t
<210> 82t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 82t
tttttttttt ttttttagat ttctaggagt c 31t
<210> 83t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 83t
tttttttttt ttttttagga gcgtggacag g 31t
<210> 84t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 84t
tttttttttt ttttttagga gcggggacag g 31t
<210> 85t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 85t
tttttttttt ttttttcagg agcgtggaca g 31t
<210> 86t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 86t
tttttttttt ttttttcagg agcctggaca g 31t
<210> 87t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 87t
tttttttttt tttttttgat aacggcagca c 31t
<210> 88t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 88t
tttttttttt tttttttgat aaccgcagca c 31t
<210> 89t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 89t
tttttttttt ttttttgtcg gaacctgata a 31t
<210> 90t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 90t
tttttttttt ttttttgtcg gaaactgata a 31t
<210> 91t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 91t
tttttttttt ttttttacac agccaaggag a 31t
<210> 92t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 92t
tttttttttt ttttttacac agctaaggag a 31t
<210> 93t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 93t
tttttttttt ttttttatta cagaggatga g 31t
<210> 94t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 94t
tttttttttt ttttttatta cagcggatga g 31t
<210> 95t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 95t
tttttttttt ttttttaagg ccgcaatgcg c 31t
<210> 96t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 96t
tttttttttt ttttttaagg ccgtaatgcg c 31t
<210> 97t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 97t
tttttttttt ttttttaaag tctgtagcat c 31t
<210> 98t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 98t
tttttttttt ttttttaaag tctatagcat c 31t
<210> 99t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 99t
tttttttttt ttttttatat gactgatagg g 31t
<210> 100t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 100t
tttttttttt ttttttatat gaccgatagg g 31t
<210> 101t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 101t
tttttttttt ttttttcagg attcatctgc g 31t
<210> 102t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 102t
tttttttttt ttttttcagg atttatctgc g 31t
<210> 103t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 103t
tttttttttt ttttttatag caagccccag a 31t
<210> 104t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 104t
tttttttttt ttttttatag caaaccccag a 31t
<210> 105t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 105t
tttttttttt ttttttaata gcaagcccca g 31t
<210> 106t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 106t
tttttttttt ttttttaata gcaggcccca g 31t
<210> 107t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 107t
tttttttttt ttttttatac ttttttaaat t 31t
<210> 108t
<211> 31t
<212> DNAt
<213> 探针序列t
<400> 108t
tttttttttt ttttttatac tttcttaaat t 31t
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