与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用

与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用

　　技术领域tt

　　本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯tt片、其制备方法和应用。tt

　　背景技术tt

　　获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）是tt因为感染人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）而导致免tt疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤等的综合征。它是一类流行较广，致死tt率高的疾病。在当前仍然缺少普适的治疗方法的情况下，尽早地发现人类免疫tt缺陷病毒，及时地诊断病症，阻断传播途径，对于减少其危害有着重要的意义。tt

　　HIV可以感染多种细胞，包括在表面表达CD4分子的T4淋巴细胞、单核tt巨噬细胞和树突状细胞等。CD4分子是HIV入侵细胞的受体，而糖蛋白gp41tt介导了HIV病毒与CD4细胞的融合，从而使HIV进入细胞内。以gp41分子为tt药物设计靶点，可能是实现对HIV有效检测与治疗获得性免疫缺陷综合征的一tt种途径。tt

　　基于gp41的分子结构，目前已经开发出了多种相关的抑制剂与单克隆抗体，tt并有些基于这些抗体的芯片产生。但是目前用于检测gp41蛋白的单克隆抗体芯tt片存在以下问题：tt

　　（1）使用的单克隆抗体与gp41蛋白的相互作用力较弱，造成对gp41蛋白tt的检出限较低，传统的gp41单克隆抗体制备的芯片检出限高于200nM；tt

　　（2）由于仅基于一种或少数几种gp41单克隆抗体的阳性结果进行判断，tt导致实验过程中较多假阳性结果的产生；tt

　　（3）gp41单克隆抗体芯片很容易因抗体的构象变化导致抗体失活，芯片失tt效；tt

　　（4）gp41单克隆抗体的成本较高，导致gp41单克隆抗体芯片的成本难以tt降低，大规模应用受到限制。tt

　　因此，针对gp41蛋白，开发出检出限低、特异性高、性能稳定及成本较低tt的芯片，对于HIV病毒的检测具有重要意义。tt

　　发明内容tt

　　本发明人经过大量实验和创造性劳动，得到了一组多肽，并发现这组多肽tt与gp41蛋白有很强的特异性结合能力，能够制备成多肽芯片或药物组合物等，tt应用于诊断或辅助性诊断HIV感染引起的疾病。tt

　　本发明提供以下技术方案：tt

　　在第一方面，本发明提供一种与gp41蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自ttSEQ ID NO：1～7所示的氨基酸序列：tt

　　（1）GGLDAIRAQQDL（SEQ ID NO：1）；tt

　　（2）GGSNDSLRQIWNDTTWMRWRDRI（SEQ ID NO：2）；tt

　　（3）GGIDSLIRRSQN（SEQ ID NO：3）；tt

　　（4）GGWRRLDSLCLFSYDDLDRLL（SEQ ID NO：4）；tt

　　（5）GGTDIVRLLGDDGWRALDY（SEQ ID NO：5）；tt

　　（6）GGSQRLDNS（SEQ ID NO：6）；和tt

　　（7）GGNNLLDAIRAQQDL（SEQ ID NO：7）。tt

　　所述多肽可以通过人工化学合成制得，其与gp41蛋白有很强的特异性结合tt能力。tt

　　在第二方面，本发明提供一种多肽芯片，其包括固定于固相载体上的、能tttttt够与gp41蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO：1～7所示的氨基酸tt序列。tt

　　所述多肽芯片上的多肽与gp41蛋白有很强的特异性结合能力，可以用于ttgp41蛋白的检测，并据此判断HIV病毒的感染情况。tt

　　在本发明一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～7所tt示，即包含上述七条多肽。tt

　　在第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的多肽芯片的制备方法，利tt用表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)原理，所述方法包括：tt

　　（1）对固相载体进行预处理，形成备用固相载体；tt

　　（2）将稀释好的所述多肽点样到所述备用固相载体上。tt

　　在本发明一个实施方案中，所述步骤（1）具体包括：tt

　　（1a）在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装tt层；tt

　　（1b）以乙醇清洗SPR芯片表面两次；tt

　　（1c）使用碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺活化SPR芯片表面，使醇分子自tt组装层上的羧基形成不稳定的琥珀酰亚胺酯；tt

　　（1d）以乙醇清洗SPR芯片表面两次。tt

　　在本发明一个实施方案中，所述步骤（2）还包括对所述多肽进行预处理，tt及点样后的处理；具体地，所述步骤（2）包括：tt

　　（2a）将链霉亲和素与N端修饰生物素的多肽分子按摩尔比为1：1的比例tt混合，且混合后链霉亲和素的质量浓度为1mg/mL，形成链霉亲和素-多肽混合tt液；tt

　　（2b）将0.2μL链霉亲和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gp41的单tttttt克隆抗体作为阳性对照，取0.2μL滴在SPR芯片表面；tt

　　（2c）以乙醇胺封闭表面未参与反应的琥珀酰亚胺酯与双硫醇上的羧基；tt

　　（2d）以乙醇清洗SPR芯片表面两次；tt

　　（2e）将SPR芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中；tt

　　（2f）以0.5%(体积比)磷酸与1×PBS（磷酸盐缓冲液）反复交替清洗SPRtt芯片表面，直到SPR芯片表面的固定相SPR信号保持平稳为止；tt

　　（2g）以1×PBS作为解离相，以0.5%(体积比)磷酸作为重生液，测试SPRtt芯片对gp41的1×PBS溶液的响应。tt

　　本发明还提供一种多参数检测样品中gp41蛋白的方法，包括如下步骤：tt

　　（1）同时记录所述多肽芯片上所设计的多肽在通过样品时的SPR信号；tt

　　（2）当七条多肽（SEQ ID NO：1～7）都能产生吸附峰信号时，证明样品tt中存在gp41。tt

　　本发明提供的与gp41蛋白有强相互作用的多肽序列，其一级结构序列中同tt源性较低，可能对应于gp41蛋白表面不同的结合位点。只有当七条多肽分子均tt与目标发生结合时，才判断gp41蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程tt中假阳性结果的产生。tt

　　在第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方tt面所述的多肽，还可以包括任选的可药用载体。tt

　　在第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽、如第二方面所述的tt多肽芯片或如第四方面所述的药物组合物在制备用于诊断或辅助性诊断HIV感tt染引起的疾病的药物中的应用。tt

　　本发明的有益效果为：tt

　　（1）本发明提供的多肽与gp41蛋白的亲和力强，实现了对gp41蛋白在低tttttt浓度时的检测，基于所述多肽制备的多肽芯片可以检出50nM的gp41蛋白，而tt传统的gp41单克隆抗体制备的芯片检出限高于200nM，本发明多肽芯片可辅助tt临床准确诊断HIV相关疾病；tt

　　（2）本发明提供的多肽芯片只有当七条多肽分子均与目标发生结合时，才tt判断gp41蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程中假阳性结果的产生；tt

　　（3）本发明提供的多肽相比gp41单克隆抗体的稳定性高，不会发生由于tt构象变化导致的失活，芯片的效期更长；tt

　　（4）本发明提供的多肽相比gp41单克隆抗体成本更低，可以大规模应用；tt

　　（5）本发明提供的多肽对于gp41相关疾病的多肽类先导化合物的发现和tt预测，提供药物母核的设计模型，并为已有的药物结构改造提供参考依据与标tt准；tt

　　（6）本发明提供的靶向gp41分子的多肽序列可以被应用于通过酶联免疫tt吸附方法、表面等离激元共振技术、石英振动微天平技术分析、飞行时间质谱tt及等温滴定微量热检测gp41；此外，本发明提供的靶向gp41分子的多肽可以经tt过量子点修饰、荧光素基团修饰及辣根过氧化物酶修饰等用于酶联免疫吸附、tt荧光发射光谱及紫外吸收光谱等分析方法中检测gp41分子。tt

　　附图说明tt

　　图1为基于本发明开发的多肽41-1～41-7、24-5及gp41单克隆抗体与gp41tt的结合解离过程的SPR曲线。其中：图1a为gp41单克隆抗体与gp41结合解离tt过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图1b为24-5、tt链霉亲和素（SA）共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线；图1c为41-1、ttSA共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41tt的SPR信号；图1d为41-2、SA共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线，tttttt已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图1e为41-3、SA共混合体系与gp41tt结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图1ftt为41-4、SA共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5tt对gp41的SPR信号；图1g为41-5、SA共混合体系与gp41结合解离过程的SPRtt曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图1h为41-6、SA共混合体tt系与gp41结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；tt图1i为41-7、SA共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对tt照24-5对gp41的SPR信号。其中，表示gp41浓度为12.9nM对应的曲线；tt表示gp41浓度为25.4nM对应的曲线；表示gp41浓度为50.7nM对tt应的曲线；表示gp41浓度为101nM对应的曲线；表示gp41浓度为tt203nM对应的曲线。tt

　　图2为基于本发明开发的多肽41-1～41-7及gp41单克隆抗体与4.2μg/mL的ttgp41和p24解离过程中的平衡态下吸附量的SPR相应值，其中，表示tt4.2μg/mL p24对应的柱状图；表示4.2μg/mL gp41对应的柱状图。tt

　　具体实施方式tt

　　下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将tt会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实tt施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，tt或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过tt市购获得的常规产品。tt

　　实施例1：检测溶液中的gp41与芯片表面多肽的结合解离动力学过程

　　1、按照表1所示的序列合成多肽，实验中按照需要稀释成合适的浓度。tt

　　表1  合成的多肽tt

　　

　　其中，多肽序列N端的生物素（Biotin）的作用是与链霉亲和素（SA）结tt合，属于多肽芯片制备中的常规技术手段。多肽41-1～47-7的氨基酸序列对应发tt明内容部分的SEQ ID NO：1～7。多肽24-5是与gp41无关的多肽，在实验中用tt于考察SA对gp41吸附能力的阴性对照，其氨基酸序列的序列编号为SEQ ID ttNO：8。tt

　　2、制备芯片：tt

　　1)在Plexera公司KxV5型SPR标配玻璃基底上，使用离子源辅助热蒸镀，tt沉积1.5-5.0nm厚Cr，50nm厚Au。使用等离子体溅射5分钟。在SPR芯片表tt面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层。具体是，将5mL的羧tt基双硫醇分子(dithiosole-COOH，1μM)与羟基双硫醇分子(dithiosole-OH，10μM)tt混合乙醇溶液，滴在SPR芯片表面，吸附15分钟，然后吸走剩余液体。tt

　　2)以乙醇（如95%乙醇）清洗芯片表面两次，用高纯氮气吹干。tt

　　3)使用碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化表面。具体是，将tt75mg/mL的EDC与11.5mg/mL的NHS等体积混合，取5mL置于双硫醇修饰后tt的SPR芯片表面，反应20分钟，再将剩余液体移走。tt

　　4)以乙醇（如95%乙醇）清洗芯片表面两次，用高纯氮气吹干。tt

　　5)将SA与N端修饰生物素的多肽分子(41-1、41-2、41-3、41-4、41-5、41-6、tt41-7和24-5)按摩尔比为1：1的比例混合，混合物中SA的质量浓度为1mg/mL，tt将二者的溶液或悬浊液混合10分钟之后待用。这里24-5与SA的共混组，作为tt与gp41无关，考察SA对gp41吸附能力的阴性对照。tt

　　6)将0.2μLSA-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gp41的单克隆抗体作为阳tt性对照，取0.2μL滴在SPR芯片表面，以经高温处理失活的gp41单克隆抗体作tt为背景非特异性吸附的阴性对照，取0.2μL滴在SPR芯片表面，反应时间为2tt小时或大于2小时。反应过程中，使用加湿器使芯片表面保持潮湿环境。tt

　　7)以乙醇胺封闭表面未参与反应的活性位点。具体是，将5mL乙醇胺滴在tt芯片表面，反应20分钟之后，将剩余液体吸走。tt

　　8)以乙醇（如95%乙醇）清洗芯片表面两次，用高纯氮气吹干。tt

　　9)将芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中。tt

　　10)以0.5%(体积比)磷酸与1×PBS反复交替清洗芯片表面。具体是，1×PBStt（其配制为0.4gNaCl、0.01gKCl、182mgNa2HPO4·12H2O、12mgKH2PO4、tt0.01gNaN3用50ml二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤），固定流动相流速为tt1μL/s，利用SPR仪器的微流控管道清洗芯片表面，每次更换流动相的周期为tt240s，持续清洗芯片表面，直至所用固定相的SPR信号曲线不再下降为止，即tt此时表面上的固定相(SA与多肽)为特异吸附在芯片表面。tt

　　3、利用该芯片计算各多肽与gp41分子结合解离的动力学常数：tt

　　1)以1×PBS配制12.9nM、25.4nM、50.7nM、101nM、203nM的gp41溶液。tt

　　2)以1μL/s的流速，依次将gp41溶液由低浓度向高浓度通过芯片表面，结tt合时间150s，解离时间150s，重生时间250s。以1×PBS作为解离溶液，以0.5%(体tt积比)磷酸作为重生液。记录各个多肽及单克隆抗体与gp41的结合解离SPR曲tt线。然后，以高温处理的失活gp41单克隆抗体作为芯片表面非特异性吸附的背tttttt景，统一将各个数据点的SPR扣除该背景。如图1所示，41-1至41-7各个设计tt的多肽探针分子均对gp41具有较强的结合能力。但gp41的单克隆抗体、24-5tt多肽与gp41的结合值在各个浓度下均很弱，采集不到有效信号(大于4倍噪音值tt为有效信号)。如图1a所示，gp41的单克隆抗体对gp41的检出限为流动相的最tt高浓度203nM，这高于其他多肽分子的检出限50nM(图1c-i)；如图1b所示，与ttgp41无关的多肽分子24-5，也只能在最高浓度203nM下检测到有效结合峰，即ttSA对gp41的结合贡献不大。tt

　　3)以指数方程拟合每个多肽与gp41的SPR曲线。经计算可以获得各个多肽tt分子与gp41之间的结合解离常数。如表2所示（E表示科学计数法，例如6.19E+04tt表示6.19×104，其余类似），41-1至41-7的平衡解离常数(KD)值(10-8～10-12M)；tt而gp41的单克隆抗体在所检测的浓度梯度下无法计算动力学结合解离常数。即tt所设计的多肽分子41-1至41-7与单克隆抗体相比，与gp41分子结合能力更强。tt

　　表2  结合解离常数tt

　　

　　

　　实施例2：评价溶液中的p24对芯片表面多肽分子检测的干扰效应

　　1、所使用多肽：同实施例1。tt

　　2、制备芯片：同实施例1。tt

　　3、利用该芯片评估各多肽与p24分子结合能力：tt

　　1)以1×PBS配制4.2μg/mL的p24溶液。tt

　　2)以1μL/s的流速，将p24溶液通过芯片表面，结合时间150s，解离时间tt150s，重生时间250s，以1×PBS作为解离溶液，以0.5%磷酸（体积比）作为重tt生液。tt

　　3)以高温处理失活的gp41单克隆抗体数据组作为芯片表面的背景非特异性tt吸附，使每个数据点扣除背景。tt

　　4)统计处于脱附稳定态的各个多肽分子及gp41单克隆抗体的SPR数值及标tt准方差。tt

　　4、对比设计的多肽分子与4.2μg/mL的gp41及p24结合能力tt

　　如图2所示，对于4.2μg/mL的gp41分子溶液（即101nM），41-1至41-7tt这七条设计的多肽分子均能得到大于4倍SPR噪音的有效结合信号，而对于gp41tt的单克隆抗体，采集不到有效信号。对于4.2μg/mL的p24分子溶液，41-1至41-7tt中只有41-1组为结合平均值大于4倍噪音。同时41-1至41-7对p24的SPR响tt应信号远小于gp41引起的信号，故p241分子不会对gp41分子的检测产生影响。tt而对于gp41的单克隆抗体，采集不到有效信号。tt

　　故可以通过使用该七条设计的多肽分子，作为多指标组合使用，实现对gp41tt分子的检测，受样品中其他蛋白干扰较小。tt

　　本领域技术人员将会理解：尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描tttttt述，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改tt变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等tt同物给出。tt