肽和抗体文库及其应用
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年3月31日申请的PCT申请号PCT/CN2012/000430的优先权，其全文引入本文。
发明领域
本发明一般性涉及抗体、抗体文库、多肽、多肽文库及其应用，包括产生抗体文库的方法、鉴别靶的抗体的方法及鉴别与病症相关的靶的方法。在具体的实施方案中，本发明涉及包含至少10000个不同成员的抗体文库，其可用于筛选对于靶如感兴趣的蛋白质具有高亲和性的抗体。
发明背景
在医学、生物学、药学等领域中，不同抗体及抗体文库的需求快速增加。目前，获得抗体的常用方法包括杂交瘤技术、重组抗体技术、多种分子展示技术，以及组合上述技术与高通量方法的那些技术等等。
在常规的抗体制备技术中，通常必需使用天然或重组蛋白质或其片段免疫动物，以使得该动物产生可以特异性识别并结合所述蛋白质的抗体。所述抗体然后可根据不同的要求通过不同的技术方式得自所述动物的细胞。
抗体的获得可包括杂交瘤技术。在这种方法中，在免疫动物之后，需要获取动物细胞及随后进行细胞融合，以获得产生抗体的杂交瘤；然后将杂交瘤克隆并建立株系以产生抗体，随后纯化并鉴别抗体。根据需要，也可以确定抗原的表位。这种杂交瘤技术的详细步骤可见于各种教科书和手册(例如Bazin,Rat hybridomas and rat monoclonal antibodies,CRC Press,1990；Goding,Monoclonal antibodies:principles and practice,3rd edition,Academic Press,1996；Shepherd and Dean Monoclonal antibodies,OxfordUniversity Press,2000等)。目前这些方法仍广泛用于抗体制备，但是它们有许多缺点，如较长的制备周期、非常复杂的制备技术及高成本。此外，这些方法不能用于所有蛋白质，例如对于具有不佳溶解性、低免疫原性或毒性的一些抗原，这些方法是不适用的(Sinclair NR et al.,2004B cell/antibodytolerance to our own antigens.Front Biosci 9:3019–3028)。
此外，为了获得具有特异性的单克隆抗体，常用的方式是将化学合成的肽片段与载体蛋白质偶联，然后使用其免疫小鼠。这种方法可产生针对相同蛋白质的单一表位的抗体。然而，由于不同肽片段的免疫原性的不同，这种方案的整体成功率不够好，特别是对于示出与宿主具有高同源性的蛋白质，其肽具有非常差的免疫原性，且在小鼠中难以刺激有效的免疫反应。另一常规策略是使用全长蛋白质或其片段作为免疫原，这个策略部分解决了上述问题，但是仍存在一些其它缺陷，如在蛋白质表达中低整体成功率(对于正常表达和纯化系统为30-70％)(Thorsten Kohl,Christian Schmidt,Stefan Wiemann,Annemarie Poustka and Ulrike Korf.Drew,2003)。对于使用的与宿主动物具有高同源性的蛋白质片段，其在动物中的免疫应答通常较弱，且制备单克隆抗体的成功率相对较低(Sinclair NR et al,2004,Automatedproduction of recombinant human proteins as resource for proteome research,Proteome Science 2008,6:4；Sinclair NR(2004)B cell/antibody tolerance to ourown antigens.Front Biosci 9:3019–3028)。
重组抗体技术可以与各种分子展示技术组合，以产生多个抗原的抗体(与靶具有高亲和性)，抗原的表位可以同时确定，因此这个策略常用于药物开发(Christine Rothe,Stefanie Urlinger,Makiko Yamashita et al.The HumanCombinatorial Antibody Library HuCAL GOLD Combines Diversification ofAll Six CDRs According to the Natural Immune System with a Novel DisplayMethod for Efficient Selection of High-Affinity Antibodies.J.Mol.Biol.(2008)376,1182–1200,2007)。但是重组抗体技术的操作是复杂的、高成本的，且其产率相对较低，经常存在非特异性结合，由此这些技术不能广泛使用(Levitan,B.Stochastic modeling and optimization of phage display.J.Mol.Biol.277,893–916(1998).Bradbury et al,2004)。
如此，现有技术领域中所有常规的抗体制备方法均典型包括复杂的操作方法，如免疫动物、制备杂交瘤细胞等。因此，它们均具有较长的制备周期、复杂的制备技术及高成本等缺点。
基于噬菌体抗体的抗体文库技术是近年来开发的一种新的抗体制备技术。将在体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体中，然后表达；随后，使用抗原针对表达的抗体文库进行筛选，从而获得具有特异性的单克隆噬菌体抗体。然而，噬菌体抗体文库技术需要文库中极大量抗体以获得具有高亲和性的抗体，这种抗体产生方法仍相对复杂。
为了解决上述问题，需要一种制备或筛选抗体的新方法，以省略复杂的、耗时的及高成本的步骤，因此可以快速及有效地制备或筛选具有高亲和性的抗体。本发明解决了上述及本领域涉及的其它相关问题。
发明概述
一方面，本发明涉及鉴别靶的抗体的方法，所述方法包括：a)提供得自对象如哺乳动物的抗体文库，其中所述抗体文库包含少于107个不同种类的抗体；b)将所述靶与所述抗体文库在适于所述靶与所述抗体文库中的抗体结合的条件下接触，如果这种抗体存在与所述抗体文库中；及c)评估所述靶与所述抗体之间的结合以鉴别所述抗体是所述靶的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库得自免疫系统尚未受外来靶刺激的对象或哺乳动物。另一方面，本发明涉及特异性结合靶的抗体，其中所述抗体是通过上述方法鉴别的。
再一方面，本发明涉及鉴别靶的抗体的抗体文库，所述抗体文库得自对象或哺乳动物，所述抗体文库包含少于107个不同种类的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库得自免疫系统尚未被外来靶刺激的对象或哺乳动物。
另一方面，本发明涉及多肽文库，该多肽文库包含多个分离的包含不同的随机氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸，所述多肽不包含Cys，不包含3个或更多个相同的连续氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同氨基酸。再一方面，本发明涉及产生抗体文库的方法，该方法包括：a)用上述多肽文库免疫对象；及b)从所述对象中回收抗体。再一方面，本发明涉及通过上述方法产生的抗体文库。
再一方面，本发明涉及在序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的分离的多肽。在一些实施方案中，本发明涉及序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9个分离的多肽。
再一方面，本发明涉及多肽文库，该多肽文库包含序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离的多肽。再一方面，本发明涉及产生抗体文库的方法，所述方法包括：a)用上述多肽文库免疫对象；及b)从所述对象中回收抗体。再一方面，本发明涉及通过上述方法产生的抗体文库。
再一方面，本发明涉及特异性结合序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的多肽的分离的抗体。在一些实施方案中，本发明涉及特异性结合序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9个分离的多肽的分离的抗体。
再一方面，本发明涉及抗体文库，该抗体文库包含特异性结合序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有多肽的抗体。
再一方面，本发明涉及鉴别靶抗体的肽抗原性序列的方法，所述方法包括：a)将靶抗体与包含序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离多肽的多肽文库在适于所述靶抗体与所述多肽文库中的多肽结合的条件下接触，如果这种肽存在于所述多肽文库中；及c)评估所述靶抗体与所述多肽之间的结合以鉴别所述靶抗体的肽抗原性序列。
再一方面，本发明涉及特异性结合Akt的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合包含于氨基酸序列QDGGQKAVKD中的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合ERK2的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合包含于氨基酸序列HPLGSPGSAS中的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合Desmin的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合包含于氨基酸序列REIRRYQKST中的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合CBL4的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合包含于氨基酸序列RSRARKQAYT中的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合霍乱毒素的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合包含于氨基酸序列FEEREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合VEGF的分离的抗体，该分离的抗体特异性结合包含于氨基酸序列VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中的表位。
再一方面，本发明涉及鉴别与某种病症相关的靶的方法，所述方法包括：a)将得自患有某种病症的来源的样品与抗体文库接触，并评估所述样品中的物质与所述抗体文库中抗体之间的结合或者缺乏结合，其中所述抗体文库得自免疫系统尚未被外来靶刺激的对象或哺乳动物及所述抗体文库包含少于107个不同种类的抗体，或者所述抗体文库是通过用多肽文库免疫对象或哺乳动物而获得的，所述多肽文库包含具有不同的随机氨基酸序列的多个分离的多肽，其中所述多肽包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸，所述多肽不包含Cys，不包含3个或更多个相同的连续氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同氨基酸，或者所述抗体文库是通过用多肽文库免疫对象或哺乳动物而获得的，所述多肽文库包含序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离的多肽；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与上述抗体文库接触，并评估所述样品中的物质与所述抗体文库中抗体之间的结合或缺乏结合；及c)当在步骤a)和b)中所述物质与所述抗体之间的结合或缺乏结合存在差别时，则鉴别该物质为与所述病症相关的靶。
再一方面，本发明涉及鉴别与病症相关的靶的方法，所述方法包括：a)将得自患有病症的来源的样品与多肽文库接触，所述多肽文库包含具有不同的随机氨基酸序列的多个分离的多肽，其中所述多肽包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、或10-100个氨基酸，所述多肽不包含Cys，不包含3个或更多个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸，或者多肽文库包含序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离的多肽，并评估所述样品中的物质与所述多肽文库中的多肽之间的结合或缺乏结合；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与上述多肽文库接触，并评估所述样品中的物质与所述多肽文库中多肽之间的结合或缺乏结合；及c)当步骤a)和b)中所述物质与所述多肽之间的结合或缺乏结合存在差别时，则鉴别该物质为与所述病症相关的靶。
再一方面，本发明提供了抗体文库，其包含：(1)针对具有10-20个氨基酸的随机肽的抗体，(2)IgG抗体，由从初次用于实验的
在一个实施方案中，所述抗体文库包含至少10000个不同成员，当所述抗体文库用于筛选针对靶或感兴趣的蛋白质的抗体时，其成功率为至少85％。
在一个实施方案中，本发明的抗体文库是杂交瘤细胞文库的形式。
在一个实施方案中，本发明的随机肽：1)不含有半胱氨酸，2)不含有3个或更多个连续的相同氨基酸，3)不含有5个或更多个相同氨基酸。
在一个实施方案中，每个随机肽的初始分值设定为任何值，通过如下步骤选择随机肽：1)对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1点，2)每个氨基酸K或R残基从所述分值中减去4点；基于上述分值，从上至下选择具有最高分值的希望数量的肽。
在一个实施方案中，例如从上至下选择具有最高分值的10000个肽。在另一实施方案中，例如从上至下选择具有最高分值的15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000个肽。在一个实施方案中，选择的随机肽是化学合成的。
在一个实施方案中，初次用于实验的哺乳动物选自小鼠、大鼠和兔。
在一个实施方案中，所述完整生物体选自拟南芥、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果蝇、斑马鱼、蛲虫、水稻或者玉米等。
在一个实施方案中，所述组织选自血液组织、拟南芥花萼、不同发育阶段的蛲虫组织，或者小鼠脑组织。
在一个实施方案中，所述一或多种细胞选自脾细胞、肿瘤细胞或细胞系，如人肿瘤细胞系。
在一个实施方案中，对抗体文库中的抗体进行亲和性成熟。在特定实施方案中，本发明的抗体文库可用于基于相对少量文库成员获得具有高亲和性的抗体。
再一方面，本发明提供了包含本发明的抗体文库的组合。
另一方面，本发明提供了生物芯片，其包含本发明的抗体文库。
另一方面，本发明提供了筛选针对感兴趣的蛋白质的抗体的方法，包括使用本发明的抗体文库、本发明的组合或者本发明的生物芯片筛选针对所述感兴趣的蛋白质的一或多种抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，(b)选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，(b)选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，(c)将所述感兴趣的蛋白质与在步骤(b)中选择的抗体或抗体组的抗体亚组混合，(d)选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体亚组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括使用在步骤(d)中选择的抗体亚组重复步骤(c)和(d)，直至选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体。
在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括(a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，(b)选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，(c)将所述几个感兴趣的蛋白质的每个蛋白质单独与在步骤(b)中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别选择能结合各个感兴趣的蛋白质每一个的抗体或抗体组。
在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括：(a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，(b)选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，(c)将所述几个感兴趣的蛋白质的每个蛋白质单独与在步骤(b)中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体组，(d)将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与在步骤(c)中选择的能结合各个所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组的抗体亚组混合，(e)分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体亚组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括使用在步骤(e)中选择的抗体亚组重复步骤(d)和(e)，直至分别选择了能结合所述几个感兴趣蛋白质的每一个的抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法可以使用高通量筛选装置进行。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者lab-on-a-chip(LOC)。
另一方面，本发明还涉及本发明的抗体文库在制备筛选感兴趣的蛋白质的抗体的装置或试剂盒中的应用。在一个实施方案中，所述装置是高通量筛选装置。在另一实施方案中，所述高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者lab-on-a-chip(LOC)。
在一个实施方案中，所述感兴趣的蛋白质是翻译后修饰的蛋白质或多肽，或者毒性蛋白质或多肽。
附图简述
图1示出AKT蛋白质SER473磷酸化的测定。
图2示出ERK2蛋白质Western印迹核实。
图3示出VEGF蛋白质Western印迹核实。
图4示出CBL4蛋白质Western印迹核实。
图5示出质粒pHG。
图6示出质粒pHLDis-VL。
发明详述
为了清晰说明本发明而无限制之意，本发明的详细描述分成如下部分。
A.定义
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有专利、申请、公开的申请及其它出版物均以其全部内容并入本文作参考。如果这个章节中的定义与并入本文作参考的专利、申请、公开的申请及其它出版物中的定义相反或者不一致，则以这个章节中的定义而非并入本文作参考的文献中的定义为主。
如本文所用，“一个”是指“至少一个”或者“一或多个”。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸例如至少5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000或更多个氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸，及其可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或者任何其它操纵或修饰，如与标记成分缀合。该定义还包含例如含有一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。
“抗体”是通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点而能特异性结合靶如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子，且可以是任何类别的免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgY，是在禽类物种如鸡中的主要抗体类型，也包含在该定义中。如本文所用，该术语涵盖了不仅完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包括其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、天然发生的变体、包含具有需要的特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体，及包含需要的特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰的构型。
如本文所用，术语“特异性结合”是指抗体的特异性，由此其优先结合靶抗原，如多肽抗原。在存在其它潜在干扰物质条件下抗体对特定靶的识别是这种结合的一个特性。优选地，特异于或特异性结合靶抗原的抗体或抗体片段与靶抗原的结合亲和性高于结合其它非靶物质的亲和性。也优选地，特异于或特异性结合靶抗原的抗体或抗体片段避免结合较高百分比的非靶物质如检测样品中存在的非靶物质。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段避免结合高于大约90％的非靶物质，尽管显然考虑并优选更高的百分比。例如，本发明的抗体或抗体片段避免结合大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％及大约99％或更多的非靶物质。在其它实施方案中，本发明的抗体或抗体片段避免结合高于大约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％、或者高于大约75％、或者高于大约80％、或者高于大约85％的非靶物质。
如本文所用，术语“特异性结合”也是指多肽的特异性，由此其优先结合靶抗体，如检测样品中的靶抗体。在存在其它抗体或物质的条件下多肽对特定靶抗体的识别是这种结合的一个特性。优选地，特异于或特异性结合抗体的多肽与靶抗体的结合亲和性高于与其它非靶抗体或物质的结合亲和性。也优选地，特异于或特异性结合靶抗体的多肽避免结合较高百分比的非靶抗体或物质，例如检测样品中存在的非靶抗体。在一些实施方案中，本发明的多肽避免结合高于大约90％的非靶抗体或物质，尽管显然考虑并优选就更高百分比。例如，本发明的多肽避免结合大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％及大约99％或更多的非靶抗体或物质。在其它实施方案中，本发明的多肽避免结合高于大约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％、或者高于大约75％、或者高于大约80％、或者高于大约85％的非靶抗体或物质。
如本文所用，术语“抗原”是指由抗体通过其抗原识别位点特异性结合的靶分子。所述抗原可以是单价或多价的，即其可以具有由一或多个抗体识别的一或多个表位。可以由抗体识别的抗原的种类例如包括多肽、寡糖、糖蛋白、多核苷酸、脂质等。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸例如至少8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000或更多个核苷酸的聚合形式，及可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物、或者其混合物。该术语仅是指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链及单链脱氧核糖核酸(DNA)，以及三链、双链和单链核糖核酸(RNA)。其还包括所述多核苷酸的修饰的及未修饰的形式，所述修饰如通过烷化和/或通过加帽修饰。更特别地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，无论是剪接或是非剪接的，是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，及含有normucleotidic主链的其它聚合物，例如聚酰胺(如肽核酸(PNA))及polymorpholino(可商购自Anti-Virals,Inc.,Corvallis,OR.,Neugene)聚合物，及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物在构型中含有核碱基，使得可以碱基配对和碱基堆积，如在DNA和RNA中发现的。因此，这些术语包括例如3'-脱氧-2',5'-DNA，寡脱氧核糖核苷酸N3'-P5'氨基磷酸酯，2'-O-烷基-取代的RNA，DNA与RNA之间或者PNA与DNA或RNA之间的杂交体，也包括已知类型的修饰，例如标记、烷化、“加帽”、用类似物取代一或多个核苷酸，核苷酸间修饰如具有无电荷键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、具有负电荷键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)及具有正电荷键(氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)的那些，含有悬垂(pendant)部分的那些，例如蛋白质(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)，具有嵌合剂的那些(例如吖啶、补骨脂素等)，含有螯合物的那些(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等的螯合物)，含有烷化剂的那些，具有修饰的键的那些(例如α异头核酸等)，以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。
如本文所用，意识到术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基的那些部分，而且还含有已经修饰的其它杂环碱基。这种修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶，酰化的嘌呤或嘧啶，或者其它杂环。修饰的核苷或核苷酸也可以包含在糖部分的修饰，例如其中一或多个羟基极端用卤素、脂肪族基团置换，或者功能化为醚、胺等等。术语“核苷酸单位”是指涵盖核苷与核苷酸。
如本文所用，“生物学样品”是指得自活体或病毒来源或者其它大分子和生物分子来源的任何样品，包括对象的任何细胞类型或组织，从中可获得核酸或蛋白质或其它大分子。所述生物学样品可以是直接得自生物学来源的样品或被加工的样品。例如，扩增的分离核酸构成生物学样品。生物学样品包括但不限于动物和植物的体液，如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品及从中衍生的加工的样品。生物学样品还包括土壤和水样品及其它环境样品，病毒，细菌，真菌，藻类，原生动物及其成分。
如本文所用，术语“评估”是指包括在获得关于样品中存在的分析物的量或浓度的绝对值的意义上及在获得指数、比率、百分比、目测值或表示样品中分析物水平的其它值的意义上的定量和定性确定。评估可以是直接或间接评估，实际检测的化学物质不必当然是分析物自身，可例如是其衍生物或者一些进一步的物质。
如本文所用，“血清”是指在除去纤维蛋白凝块和血液细胞之后获得的血液的液体部分，与循环血中血浆区别。
如本文所用，“血浆”是指血液的液体的无细胞部分，与凝血后获得的血清区别。
如本文所用，“通过重组方式产生”是指使用重组核酸方法的产生方法，所述方法依赖于熟知的表达由克隆的核酸编码的蛋白质的分子生物学方法。
如本文所用，“液体”是指可以流动的任何组合物。因此，液体涵盖了半固体、糊状、溶液、水性混合物、凝胶、乳液、乳霜等形式的组合物及其它这类组合物。
如本文所用，“样品”是指可含有分析物的任何东西，对其希望进行分析物测定。样品可以是生物学样品，如生物学体液或生物学组织。生物学液体例如包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、大便、痰液、脑脊液、泪液、粘液、羊水等。生物学组织是细胞聚集体，通常是特定种类与其细胞间物质一起形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物学组织的实例还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个体细胞。
如本文所用，“疾病或失调”是指生物体中得自例如感染或遗传缺陷的病理学状况，特征在于可鉴别的症状。
如本文所用，“芯片”是指固体基材，具有多个一维、二维或三维显微结构(micro structure)或者小尺度结构(micro-scale structure)，在其上可以进行某些过程，如物理、化学、生物学、生物物理学或生物化学过程等。显微结构或小尺度结构如通道和孔、电极元件、电磁元件掺入于、建造于或者另外附着于所述基材上，以促进在该芯片上的物理学、生物物理学、生物学、生物化学、化学反应或过程。所述芯片在一维可以是薄的，在其它维度可具有不同形状，例如矩形、圆形、椭圆形或者其它不规则形状。本发明的芯片的主要表面的大小可以大幅度变化，例如从大约1mm2至大约0.25m2。优选地，芯片的大小是大约4mm2至大约25cm2，特征性尺寸为大约1mm至大约5cm。芯片表面可以是平或不平的。具有不平表面的芯片在其表面上可包含构造的通道或孔。
应理解本文描述的本发明的方面和实施方案包括由方面和实施方案“组成”和/或“基本上组成”。
在这个发明公开中，本发明的各个方面均以范围形式呈现。应理解范围形式的描述只是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应被认为是具有特别揭示的所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，1-6范围的描述应理解为具有特别揭示的子范围，如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何均如此适用。
本发明的其它目的、优势和特征通过如下说明书结合附图将显而易见。
B.鉴别靶的抗体的方法
一方面，本发明涉及鉴别靶的抗体的方法，所述方法包括：a)提供得自对象如哺乳动物的抗体文库，其中所述抗体文库包含少于107个不同种类抗体；b)将所述靶与所述抗体文库在适于所述靶与所述抗体文库中的抗体之间结合的条件下接触，如果这种抗体存在于所述抗体文库中；及c)评估所述靶与所述抗体之间的结合，以鉴别所述抗体为所述靶的抗体。
任何合适的抗体文库均可用于本发明方法中。在一些实施方案中，抗体文库得自免疫系统尚未被外来靶刺激的对象或哺乳动物。典型地，所述对象或哺乳动物尚未用分离及纯化形式的靶免疫，或者至少未主动免疫。在一些实例中，所述对象或哺乳动物尚未用含有所述靶的组合物免疫，或者至少未主动免疫。在其它实例中，所述对象或哺乳动物尚未用其中所述靶组成其主要部分或百分比的组合物免疫，或者至少未主动免疫。例如，如果所述靶是特定的多肽，则所述对象或哺乳动物可以用含有所述靶多肽的细胞、组织或生物体免疫。然而，由于所述细胞、组织或生物体不含有有意义量的靶多肽，或者靶多肽不组成所述细胞、组织或生物体的主要部分或百分比，则所述对象或哺乳动物仍被认为是未受外来靶多肽刺激。
在一些实施方案中，所述抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。例如，抗体文库中的抗体可通过适当的免疫得自宿主，抗体的氨基酸序列仍未知。在其它实例中，抗体文库中的抗体通过适当的免疫而可以最初得自宿主。一旦获得抗体，则抗体的氨基酸序列可以通过任何合适的方法确定，例如蛋白质测序方法。在这种情况中，抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的，因为所述抗体不是从头合成的，而是用靶文库免疫产生的。相反，Mao et al.,Nature,28(11):1195-1178(2010)描述了抗体文库的重新合成，其抗体文库中抗体的氨基酸序列先前已知。
在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整(或完全)抗体分子。例如，如果抗体文库中的抗体得自哺乳动物，则抗体文库中的抗体可包含完整(或完全)结构的IgG、IgM、IgA、IgD和/或IgE分子。如果抗体文库中的抗体得自禽类物种如鸡，则抗体文库中的抗体可包含完整(或完全)结构的IgY分子。
抗体文库可以使用任何合适的免疫原通过任何合适的方法产生。在一些实施方案中，抗体文库是通过用多个多肽免疫哺乳动物产生的，所述多肽包含不同的随机的氨基酸序列。所述多肽可包含任何合适数目的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸。所述多肽可包含任何合适类型氨基酸和/或氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽不包含Cys，不包含3个或更多个相同的连续氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸。
用于产生抗体文库的多肽可以通过任何合适的标准或方法选择。在一些实施方案中，所述多肽通过如下标准选择：a)为所有候选多肽指定初始的相同分值；b)候选多肽中每个潜在的糖基化位点则从初始分值中减去1点；c)候选多肽中每个Lys或Arg残基则从初始分值中减去4点；及d)根据免疫哺乳动物希望的多肽数目选择具有最高可能分值的候选多肽。
任何合适数目的多肽均可用于免疫哺乳动物以产生抗体文库。在一些实施方案中，至少10000个多肽用于免疫哺乳动物以产生抗体文库。在一些实施方案中，至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000个不同多肽用于免疫哺乳动物以产生抗体文库。典型地，一个哺乳动物用较少数目的多肽免疫，多个哺乳动物的免疫覆盖指定数目的免疫。在一些实施方案中，一个哺乳动物可以用大约1、2、3、4、5、10、15、20或25个不同多肽免疫。例如，如果一个哺乳动物用10个不同多肽免疫，及100000个不同多肽指定使用，则可以免疫10000个哺乳动物覆盖指定使用的100000个不同多肽。
所述多肽可包含任何合适数目的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽可包含5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽可包含大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。所述多肽可包含任何合适类型的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽可包含天然和/或非天然氨基酸。所述多肽可以通过任何合适方法产生。在一些实施方案中，所述多肽是通过化学合成和/或重组产生方法产生的。
在一些实施方案中，所述多肽通过如下标准从候选多肽中选择：a)每个候选多肽包含大约10个氨基酸，不包括Cys；b)每个候选多肽不包含3个或更多个相同的连续氨基酸；c)每个候选多肽不包含5个或更多个相同氨基酸；d)每个候选多肽指定初始分值为10；e)候选多肽中每个潜在的糖基化位点则从初始分值中减去1点；f)候选多肽中每个Lys或Arg残基则从初始分值中减去4点；及g)选择具有最高分值的至少10000个候选多肽。
任何合适的对象或哺乳动物均可用于产生抗体文库。在一些实施方案中，抗体文库是由免疫系统尚未被有意刺激以产生指定靶的抗体的对象或哺乳动物产生。在一些实施方案中，所述哺乳动物是小鼠，大鼠，兔，山羊，牛科动物如公牛、奶牛或水牛，犬科动物如狗，猪科动物如猪，或者马。在一些实施方案中，所述哺乳动物可以是人。其它非哺乳动物对象如禽类动物如鸡(Gallus)也可用于产生抗体文库。其它举例的禽类动物包括鹌鹑(Coturnix)、火鸡(Meleagris gallopavo)、鸭、鹅和日本鹌鹑(Coturnixjaponica)。
在一些实施方案中，抗体文库可以通过用完整的生物体、组织、细胞或者所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫对象或哺乳动物而产生，其中所述完整生物体、组织、细胞与所述靶是免疫学不同的。例如，所述靶可以不或者可以不期望包含于用作免疫原的所述完整生物体、组织、细胞或者所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物中。在另一实例中，所述靶可以包含于用作免疫原的所述完整生物体、组织、细胞或者所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物中，但是仅组成所述完整生物体、组织、细胞或者所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物的一小部分或无意义部分。
任何合适的完整生物体均可以使用。在一些实施方案中，可以使用拟南芥、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、果蝇、斑马鱼、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、水稻或玉米。
任何合适的组织均可以使用。在一些实施方案中，可以使用血液、拟南芥芽、不同发育阶段的秀丽隐杆线虫组织或者小鼠脑组织。
任何合适的细胞均可以使用。在一些实施方案中，可以使用脾细胞、肿瘤细胞或细胞系，例如人肿瘤细胞系。
在一些实施方案中，抗体文库由用与所述靶免疫学不同的抗原免疫的哺乳动物产生。
在一些实施方案中，所述抗体文库：a)由用多个多肽免疫的哺乳动物产生，所述多肽包含不同的随机的氨基酸序列；b)由其免疫系统未被有意刺激的哺乳动物产生；c)由用完整生物体、组织、细胞或所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫的哺乳动物产生；d)由用与所述靶免疫学不同的抗原免疫的哺乳动物产生；或者e)上述a)-d)的任意组合。
所述抗体文库可包含任何合适类型的抗体。例如，所述抗体文库可包含多克隆抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。抗体文库中的抗体在其从所述对象或哺乳动物中获得后可以分离、纯化、处理和/或修饰。
在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。在免疫学中，亲和性成熟是在免疫应答期间B细胞产生对于抗原具有增加的亲和性的抗体的过程。重复暴露于相同抗原，宿主将产生持续更高亲和性的抗体。二次应答可引出与初次应答相比具有几个对数倍增高的亲和性的抗体。与天然原型一样，体外亲和性成熟基于突变和选择的原理。体外亲和性成熟已经成功用于优化抗体、抗体片段或其它肽分子如抗体模拟物。CDR内部的随机突变可以使用任何合适方法导入，例如放射、化学诱变或者易错PCR。此外，遗传多样性可以通过链改组而增加。使用展示方法如噬菌体展示方法的两或三轮突变和选择循环通常获得具有在低纳摩尔范围亲和性的抗体。见例如Roskos et al.,(2007).Stefan Dübel.ed.Handbook of TherapeuticAntibodies.Weinheim:Wiley-VCH.pp.145–169。
抗体文库可包含任何合适数目的不同抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000个不同抗体。
抗体文库中的抗体可以任何合适形式贮存、运输和/或使用。在一些实施方案中，至少一些抗体固定在固体表面上。在一些实施方案中，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者所有抗体均固定在固体表面上。可以使用任何合适的固体表面。例如，所述固体表面可以是管如试管的一部分、平板如微滴定平板上的孔、珠、或者生物芯片。
所述抗体文库可以任何合适方式或形式筛选。例如，可以获得杂交瘤细胞并从所述杂交瘤细胞克隆抗体基因。抗体分子可以从编码基因中表达。抗体分子可以置于合适的测定形式中，如ELISA平板，以进行筛选。在另一实例中，腹水或纯化的抗体可用于筛选。在再一个实例中，可以直接培养杂交瘤细胞，并可以将上清用于筛选中。
抗体文库可以在任何合适测定形式中筛选。在一些实施方案中，靶-抗体复合物可以通过如下方式评估：酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫印迹，免疫沉淀，放射性免疫测定(RIA)，免疫染色，胶乳凝集，间接血凝测定(IHA)，补体结合，间接免疫荧光测定(IFA)，浊度法，流式细胞计量术，等离子共振测定，化学发光测定，侧向流免疫测定法，u-捕获测定，抑制测定或者亲合力测定。在一些实施方案中，靶-抗体复合物可以在均质或异质测定形式中评估。
所述靶可以是任何合适的物质。举例的靶包括细胞、细胞器、病毒、颗粒、分子，或者其聚集体或复合物，或者分子的聚集体或复合物。举例的细胞可以是有机或无机分子。举例的有机分子可以是氨基酸，肽，蛋白质，如抗体或受体，核苷，核苷酸，寡核苷酸，核酸如DNA或RNA，维生素，单糖，寡糖，碳水化合物，脂质，或其复合物。在一些实施方案中，所述靶是多肽。举例的多肽包括线性多肽、可溶多肽、修饰的多肽、毒性多肽，或者导致对象中自身免疫的多肽。
所述靶可以任何合适的方式或顺序与抗体文库中的抗体接触。例如，所述靶可以一次或同时与抗体文库中所有抗体接触。或者，所述靶可以与抗体文库中的部分抗体平行或相继地接触。
在一些实施方案中，所述靶与抗体文库中抗体亚组接触以确定所述抗体亚组是否包含特异性结合所述靶的抗体。一旦确定所述抗体亚组包含特异性结合所述靶的抗体，则该方法可进一步包括步骤：a)将所述抗体亚组分成更小的抗体亚组；及b)与所述靶接触以确定所述更小的抗体亚组是否包含特异性结合所述靶的抗体。在一些实施方案中，可以重复步骤a)和b)直至鉴别出特异性结合所述靶的各个抗体。
本发明的方法可用于鉴别特异性结合任何合适数目靶的抗体。在一些实施方案中，本发明的方法可用于鉴别特异性结合单个靶的抗体。在一些实施方案中，本发明的方法可用于鉴别特异性结合多个靶如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个靶的抗体。
在一些实施方案中，将抗体文库与多个靶接触以鉴别特异性结合所述多个靶的抗体或抗体组。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括将多个靶的每一个与鉴别的抗体或抗体组接触以鉴别特异性结合多个靶的每一个的抗体或抗体组。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括：a)将鉴别的抗体或抗体组分成更小的抗体亚组；及b)将多个靶的每一个与更小的抗体亚组接触以确定所述更小的抗体亚组是否包含特异性结合多个靶的每一个的抗体。在一些实施方案中，可以重复步骤a)和b)，直至鉴别出特异性结合多个靶的每一个的各个抗体。
可以进行本发明的方法以获得鉴别特异性结合指定靶的抗体的任何合适的、预期的或希望的成功率。通常，所述成功率依赖于一或多种因素，如靶的类型、靶的数目、抗体文库的大小、抗体文库中抗体的类型和品质、产生抗体或抗体文库的过程以及筛选测定形式等。在一些实施方案中，鉴别特异性结合靶的抗体的成功率是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，所述抗体文库包含至少10000个不同抗体，鉴别特异性结合靶的抗体的成功率为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
尽管上文使用得自哺乳动物的抗体文库描述或说明鉴别靶的抗体的方法，但是本发明方法中也可以使用得自非哺乳动物对象如禽类动物如鸡的抗体文库。
另一方面，本发明涉及特异性结合靶的抗体，其中所述抗体是通过上述方法鉴别的。
C.抗体、抗体文库、多肽、多肽文库及其应用
再一方面，本发明涉及抗体文库以鉴别靶的抗体，所述抗体文库得自对象或哺乳动物及所述抗体文库包含少于107个不同种类抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库得自免疫系统未被靶外来刺激的对象或哺乳动物。
抗体文库可以通过任何合适方法产生。在一些实施方案中，抗体文库：a)是由用多个多肽免疫的哺乳动物产生的，所述多肽包含不同的随机的氨基酸序列；b)是由免疫系统未被有意刺激的哺乳动物产生的；c)是由用完整生物体、组织、细胞或者所述生物体、组织或细胞的全部蛋白质提取物免疫的哺乳动物产生的；d)是由用与所述靶免疫学不同的抗原免疫的哺乳动物产生的；或者e)上述a)-d)的任意组合。
抗体文库可包含任何合适数目的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、或100000个不同抗体。
抗体文库可包含任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整(或完全)抗体分子。
抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可以被分离、纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
再一方面，本发明涉及多肽文库，所述多肽文库包含多个分离的包含不同的随机氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含大约5-100个氨基酸，优选10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90或10-100个氨基酸，所述多肽不包含Cys、不包含3个或更多个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽可包含大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
所述多肽可以通过任何合适的标准或方法选择。在一些实施方案中，所述多肽通过如下标准选择：a)为所有候选多肽指定初始的相同的分值；b)候选多肽中每个潜在的糖基化位点则从初始分值中减去1点；c)候选多肽中每个Lys或Arg残基则从初始分值中减去4点；及d)根据希望的多肽数目选择具有最高可能分值的候选多肽。
所述多肽文库可包含任何合适数目的肽。在一些实施方案中，所述多肽文库包含至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、60000、70000、80000、90000、100000或更多个不同的多肽。在一些实施方案中，所述多肽文库包含至少10000个不同的多肽。
所述多肽可包含任何合适类型的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽可包含天然和/或非天然氨基酸。所述多肽可以通过任何合适方法产生。在一些实施方案中，所述多肽是通过化学合成和/或重组产生方法产生的。
多肽文库可用于任何合适的目的。例如，多肽文库可用于产生抗体文库。
再一方面，本发明涉及产生抗体文库的方法，所述方法包括：a)用上述多肽文库免疫对象；及b)从所述对象回收抗体。
抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可以被分离、纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。在一些实施方案中，本发明的方法可进一步包括使用上述多肽文库亲和性纯化从对象回收的抗体。
所述对象可以用文库中的多肽以任何合适的方式或顺序免疫。典型地，单个对象或哺乳动物用较少数目的多肽免疫，多个哺乳动物免疫覆盖指定数目的免疫。在一些实施方案中，单个对象或哺乳动物可以用大约1、2、3、4、5、10、15、20或25个不同的多肽免疫。例如，如果单个哺乳动物用10个不同的多肽免疫及计划使用100000个不同的多肽，则可以免疫10000个哺乳动物覆盖计划使用的100000个不同多肽。在一些实施方案中，一个对象或哺乳动物用文库中一组大约5-20个多肽免疫例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个不同多肽免疫，多个对象用文库中多组大约5-20个多肽免疫，大约5-20个多肽的多个组涵盖文库中所有多肽。
再一方面，本发明涉及抗体文库，其是通过本发明方法产生的。
所述抗体文库可包含任何合适数目的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000个不同抗体。抗体文库可包含任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整(或完全)抗体分子。
抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可以被分离、纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
再一方面，本发明涉及序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的分离的多肽。在一些实施方案中，本发明涉及序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9个分离的多肽。所述分离的多肽可以是组合物、组合、复合物、试剂盒或者产品的任何合适形式。所述分离的多肽可以通过任何合适方法产生，例如化学合成、重组产生或者其组合。
再一方面，本发明涉及多肽文库，所述多肽文库包含序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离的多肽。
所述多肽文库可用于任何合适目的。例如，多肽文库可用于产生抗体文库。
再一方面，本发明涉及产生抗体文库的方法，所述方法包括：a)用上述多肽文库免疫对象；及b)从所述对象中回收抗体。
抗体文库中的抗体在其从所述对象或哺乳动物中获得之后可以被分离、纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。在一些实施方案中，本发明的方法可进一步包括使用上述多肽文库对自所述对象中回收的抗体进行亲和性纯化。
再一方面，本发明涉及抗体文库，其是通过上述方法产生的。
抗体文库可包含任何合适数目的抗体。在一些实施方案中，所述抗体文库包含至少10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、或100000个不同抗体。
抗体文库可包含任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整(或完全)抗体分子。
抗体文库中的抗体在其从所述对象或哺乳动物中获得后可以被分离、纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
再一方面，本发明涉及分离的抗体，其特异性结合序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的多肽。在一些实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其特异性结合序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8或9个分离的多肽。所述分离的抗体可以是组合物、组合、复合物、试剂盒或产品的任何合适形式。分离的抗体可以通过任何合适方法产生，例如免疫宿主、各种展示技术如噬菌体展示技术、杂交瘤技术、重组产生或者其组合。
再一方面，本发明涉及抗体文库，所述抗体文库包含特异性结合序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有多肽的抗体。
抗体文库可包含任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，抗体文库包含多克隆抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。在一些实施方案中，抗体文库中抗体的氨基酸序列先前是未知的。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体包含完整(或完全)抗体分子。
抗体文库中的抗体在其得自所述对象或哺乳动物之后可以被分离、纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中，抗体文库中的抗体是亲和性成熟的。
D.鉴别靶抗体的肽抗原性序列的方法
再一方面，本发明涉及鉴别靶抗体的肽抗原性序列的方法，所述方法包括：a)将靶抗体与多肽文库在适于所述靶抗体与所述多肽文库中多肽之间结合的条件下接触，如果这种多肽存在于所述多肽文库中的话，所述多肽文库包含序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离的多肽；及c)评估所述靶抗体与所述多肽之间的结合，以鉴别所述靶抗体的肽抗原性序列。
所述靶抗体可以与多肽文库中的多肽以任何合适方式或顺序接触。例如，所述靶抗体与多肽文库中的所有多肽可以一次或同时接触。或者，靶抗体可以与多肽文库中的一部分多肽平行或相继接触。
在一些实施方案中，将靶抗体与多肽文库中的多肽亚组接触以确定所述多肽亚组是否包含特异性结合靶抗体的多肽。一旦确定了所述多肽亚组包含特异性结合靶抗体的多肽，则所述方法可进一步包括：a)将所述多肽亚组分成更小的多肽亚组；及b)将靶抗体与所述更小的多肽亚组接触以确定这个更小的多肽亚组是否包含特异性结合靶抗体的多肽。可以重复步骤a)和b)，直至鉴别出特异性结合靶抗体的各个多肽。
本发明的方法可用于鉴别单个靶抗体的肽抗原性序列。本发明的方法也可以用于鉴别多个靶抗体的肽抗原性序列。
一旦鉴别出靶抗体的肽抗原性序列，则本发明的方法可包括进一步的鉴别后步骤。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括分离特异性结合靶抗体的多肽。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括确定分离的多肽的氨基酸序列。
本发明的方法可用于任何合适的目的。在一些实施方案中，本发明的方法可用于鉴别靶抗体的肽抗原性序列，所述靶抗体是生物标记，例如诊断或预后生物标记。
E.特定靶的分离的抗体
再一方面，本发明涉及特异性结合Akt的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列QDGGQKAVKD中包含的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合ERK2的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列HPLGSPGSAS中包含的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合Desmin的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列REIRRYQKST中包含的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合CBL4的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列RSRARKQAYT中包含的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合霍乱毒素的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列FEEREQANTA、EYQQAQLEAE或DSSMSMADSE中包含的表位。
再一方面，本发明涉及特异性结合VEGF的分离的抗体，所述分离的抗体特异性结合氨基酸序列VLDFILSMGL、AKRKAGTSPR或RNSDFSAGSP中包含的表位。
上述抗体可以是任何合适类型的抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体和/或产生单克隆抗体的杂交瘤。
上述抗体可以通过任何合适方法产生，通过用靶多肽免疫宿主、通过噬菌体展示或者重组产生方法等。上述抗体可以进一步被纯化、处理和/或修饰。在一些实施方案中，上述抗体可以是亲和性成熟的。
F.鉴别与病症相关的靶的方法
再一方面，本发明涉及鉴别与病症相关的靶的方法，所述方法包括：a)将得自患有病症的来源的样品与抗体文库接触，并评估所述样品中的物质与所述抗体文库中的抗体之间的结合或缺乏结合情况，其中所述抗体文库得自对象或哺乳动物，优选免疫系统未被靶外来刺激，所述抗体文库包含少于107个不同种类的抗体，或者所述抗体文库是通过用多肽文库免疫对象或哺乳动物获得的，所述多肽文库包含多个分离的包含不同的随机的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含大约10-20个氨基酸，所述多肽不包含Cys、不包含3个或更多个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸，或者所述抗体文库是通过用多肽文库免疫对象获得的，所述多肽文库包含序列表(SEQ ID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或者所有分离的多肽；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与上述抗体文库接触，并评估所述样品中的物质与所述抗体文库中抗体之间的结合或缺乏结合情况；及c)当步骤a)和b)中所述物质与所述抗体之间的结合或缺乏结合存在差别时，鉴别物质为与所述病症相关的靶。
本发明的方法可用于任何合适目的。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别与对象中病症相关的靶。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别与疾病或失调相关的靶。
本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的靶。或者，本发明的方法可用于鉴别与病症相关的多个靶。再或者，本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的多个靶。再或者，本发明的方法可用于鉴别与多种病症相关的多个靶。
所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合中的差别可以通过任何合适方式评估。在一些实施方案中，步骤a)和b)中所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合中的差别是定性的。在一些实施方案中，步骤a)和b)中所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合的差别是定量的。在一些实施方案中，步骤a)中所述物质与抗体之间的结合及步骤b)中所述物质与抗体之间的缺乏结合鉴别出所述物质为与所述病症相关的靶。在一些实施方案中，步骤a)中所述物质与抗体的缺乏结合及步骤b)中所述物质与抗体的结合鉴别出所述物质是与所述病症相关的靶。
所述靶可以是任何合适的物质。举例的靶包括细胞、细胞器、病毒、颗粒、分子，或者其聚集体或复合物，或者分子的聚集体或复合物。举例的细胞可以是有机或无机分子。举例的有机分子可以是氨基酸，肽，蛋白质，例如抗体或受体，核苷，核苷酸，寡核苷酸，核酸，如DNA或RNA，维生素，单糖，寡糖，碳水化合物，脂质，或者其复合物。在一些实施方案中，所述靶是多肽。举例的肽包括线性多肽、可溶多肽、修饰的多肽、毒性多肽或者导致对象中自身免疫的多肽。
再一方面，本发明涉及鉴别与病症相关的靶的方法，所述方法包括：a)将得自患有病症的来源的样品与多肽文库接触，所述多肽文库包含多个分离的包含不同的随机氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含大约10-20个氨基酸，所述多肽不包含Cys、不包含3个或更多个相同的连续的氨基酸，和/或不包含5个或更多个相同的氨基酸，或者多肽文库包含序列表(SEQID NO:1-55471)中列出的至少10、100、1000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000个或所有分离的多肽，并评估所述样品中的物质与所述多肽文库中多肽之间的结合或缺乏结合；b)将得自不具有所述病症的来源的样品与上述多肽文库接触，并评估所述样品中的物质与所述多肽文库中多肽之间的结合或缺乏结合；及c)当步骤a)和b)中所述物质与所述多肽之间的结合或缺乏结合中存在差别时，则鉴别物质为与所述病症相关的靶。
本发明的方法可用于任何合适目的。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别与对象中病症相关的靶。在一些实施方案中，本发明的方法用于鉴别与疾病或失调相关的靶。
本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的靶。或者，本发明的方法可用于鉴别与病症相关的多个靶。再或者，本发明的方法可用于鉴别与一种病症相关的多个靶。再或者，本发明的方法可用于鉴别与多种病症相关的多个靶。
所述物质与抗体之间的结合或缺乏结合的差别可以任何合适方式评估。在一些实施方案中，在步骤a)和b)中所述物质与多肽之间的结合或缺乏结合中的差别是定性的。在一些实施方案中，步骤a)和b)中所述物质与多肽之间的结合或缺乏结合中的差别是定量的。在一些实施方案中，步骤a)中所述物质与多肽的结合及步骤b)中所述物质与多肽的缺乏结合鉴别出所述物质是与所述病症相关的靶。在一些实施方案中，步骤a)中所述物质与多肽之间的缺乏结合与步骤b)中所述物质与多肽之间的结合鉴别出所述物质是与所述病症相关的靶。
所述靶可以是任何合适的物质。举例的靶包括细胞、细胞器、病毒、颗粒、分子，或者其聚集体或复合物，或者分子的聚集体或复合物。举例的细胞可以是有机或无机分子。举例的有机分子可以是氨基酸，肽，蛋白质，例如抗体或受体，核苷，核苷酸，寡核苷酸，核酸，如DNA或RNA，维生素，单糖，寡糖，碳水化合物，脂质，或者其复合物。在一些实施方案中，所述靶是多肽。举例的多肽包括线性多肽，可溶多肽，修饰的多肽，毒性多肽或者导致对象中自身免疫的多肽。在一些实施方案中，所述靶包含抗体。
G.举例的实施方案
除非特别指出，本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域已知的其通常的含义。除非特别指出，所有专利、专利申请、出版物、GenBank序列、网站及其它揭示的材料均并入本文作参考。
关于蛋白质的抗体，其通常仅识别蛋白质的几个氨基酸。当针对随机的氨基酸序列制备的不同抗体的数目是足够的时，这些抗体可构成抗体文库。使用这种文库，可以针对感兴趣的蛋白质进行筛选，以获得能识别所述蛋白质的抗体。
此外，关于特定的生物体，如小鼠，如果其某一组织的总蛋白质提取物用于免疫动物，然后可以制备相应的抗体文库，这种抗体文库也可以用于筛选对所述生物体某一蛋白质具有高亲和性的抗体。初次用于实验的哺乳动物可用于进行杂交瘤融合，以筛选能分泌IgG抗体的杂交瘤细胞，这些杂交瘤细胞也可以用于构建抗体文库以筛选抗体。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体文库以筛选抗体，及使用所述抗体文库筛选感兴趣的蛋白质的抗体的方法。特别地，本发明涉及具有至少10000个不同成员的抗体文库，其可用于筛选对感兴趣的蛋白质具有高亲和性的抗体。
一方面，本发明提供了抗体文库，其包含：(1)针对具有10-20个氨基酸的随机肽的抗体，(2)IgG抗体，由从初次用于实验的哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤细胞分泌，(3)IgG抗体，由从通过总蛋白质提取物免疫的哺乳动物的脾细胞产生的杂交瘤细胞分泌，所述蛋白质提取物来自完整生物体、其一或多种组织、和/或其一或多个细胞，(4)IgG抗体，由针对一或多个抗原建立的稳定杂交瘤株分泌；或者(1)-(4)的任意组合。
在一些实施方案中，术语“抗体文库”是指一系列抗体的集合，其可含有不同来源的抗体，如针对特定表位产生的抗体，或者针对感兴趣的蛋白质的随机肽产生的抗体。
本发明的抗体文库可以是具有单一来源的抗体的抗体文库；其也可以是不同来源的抗体的抗体文库混合物。
在一些实施方案中，术语“初次用于实验的哺乳动物”是指从未使用实验方式刺激或处理的动物。在一些实施方案中，其特别是指从未用外源抗原接种或免疫的动物，所述动物可以是小鼠、大鼠、兔等。
在一些实施方案中，术语“总蛋白质提取物”是指源自完整生物体、其组织或其细胞的所有蛋白质的集合。所述生物体可以是多种模型生物体，如拟南芥、小鼠、鼠、兔、牛、山羊、果蝇、斑马鱼、蛲虫、玉米或者水稻等。
在一些实施方案中，本文所用术语“随机肽”是指随机产生的氨基酸序列，其中所述氨基酸选自天然氨基酸或其类似物。在本发明中，随机肽的长度可以是例如10-20个氨基酸，例如10个氨基酸的随机肽。
在一个实施方案中，本发明的随机肽：1)不含有半胱氨酸，2)不含有3个或更多个连续相同的氨基酸，和/或3)不含有5个或更多个相同氨基酸。
在一个实施方案中，每个随机肽的初始分值设定为任何值，通过如下过程选择随机肽：1)对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1点，2)每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点；基于上述分值，从上至下选择具有最高分值的希望数目的肽。
在一个实施方案中，本发明的随机肽通过如下步骤选择：1)随机产生具有10-20个氨基酸的肽序列，其不含有半胱氨酸，2)每个随机肽的初始分值等于其中含有的氨基酸的数目；对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1点，3)具有10-20个氨基酸的所述肽序列不允许含有3个或更多个连续的相同氨基酸，4)具有10-20个氨基酸的所述肽序列不允许含有5个或更多个相同氨基酸，5)具有10-20个氨基酸的所述肽序列中每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点。基于上述评分原则，从上至下选择具有最高分值的肽。
在一个实施方案中，从上选择例如10000个具有最高分值的肽。在另一实施方案中，从上选择例如15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000个具有最高分值的肽。在一个实施方案中，选择的随机肽是化学合成的。
在一特定实施方案中，使用具有10个氨基酸的随机肽为实例，随机肽的选择可例如包括如下步骤：1)随机产生具有10个氨基酸的肽序列，其不含有半胱氨酸；2)肽序列的淘选原则：每个随机产生的肽的初始分值设定为10；对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在的糖基化位点从所述分值中减去1点；3)具有10个氨基酸的所述肽序列不允许含有3个或更多个连续的相同氨基酸；4)具有10个氨基酸的所述肽序列不允许含有5个或更多个相同氨基酸；及5)所述肽序列中每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点。
基于上述评分原则，可以从上至下选择具有最高分值的10000个肽，然后可以化学合成。
在本发明的一个实施方案中，所述随机肽可以通过多种方法获得，如化学合成、重组表达等。这种技术手段为本领域熟知。
动物的免疫可以使用本领域已知的任何方法进行。用于本发明中进行免疫的动物可以是本领域常用的动物，如小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、马、牛等。
在一个实施方案中，所述抗体文库包含至少10000个不同成员，所述抗体文库当用于筛选感兴趣的蛋白质的抗体时的成功率为至少85％。在另一实施方案中，本发明的抗体文库中的成员数目通过添加新抗体而可以进一步增加，如至少15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000个不同抗体及甚至更多。随着抗体文库中抗体量的增加，所述抗体文库筛选感兴趣的蛋白质的抗体的成功率也因此增加，如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％及甚至更高。随着文库内容的增加，所述成功率可接近100％。
在一个实施方案中，本发明的抗体文库是杂交瘤细胞文库形式。
关于杂交瘤技术的详细介绍可见于例如Bazin,Rat hybridomas and ratmonoclonal antibodies,CRC Press,1990；Goding,Monoclonal antibodies:principles and practice,3rd edition,Academic Press,1996；Shepherd and DeanMonoclonal Antibodies,Oxford University Press,2000等。
使用随机肽产生的本发明的抗体文库可含有抗体的不同集合，如单克隆抗体的集合，多克隆抗体的集合。在一个实施方案中，本发明的抗体文库含有针对一个物种所有蛋白质的抗体。在另一实施方案中，本发明的抗体文库含有针对感兴趣的一或多个蛋白质的所有表位的抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体文库存在于高通量筛选装置中。
在一个实施方案中，本发明中使用的高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者lab-on-a-chip(LOC)。
在一些实施方案中，术语“高通量筛选装置”是指可用于进行高通量筛选(HTS)的装置。高通量筛选是指使用分子水平或细胞水平的实验手段为基础，进行自动操作以在微平板形式的实验载体上进行实验过程，使用检测仪器收集实验数据，然后使用计算机分析并处理实验数据。高通量筛选装置和技术可用于同时检测大量不同样品，其可以与本发明的抗体文库组合以实现快速有效筛选抗体的目的。
常用的高通量筛选装置包括生物芯片。生物芯片是一种微阵列技术，可用于高通量筛选生物学样品。关于生物芯片，借助于显微处理和微电子技术，可以将具有已知序列的大量核酸或蛋白质片段有序地排列在微玻片的表面上。待检测样品的相应成分或活性可以通过与标记的核酸或蛋白质分子反应而分析。生物芯片典型可以分为三种不同类型，即基因芯片、蛋白质芯片和lab-on-a-chip(LOC)。
蛋白质芯片是分析蛋白质功能的一种高通量技术，其可用于分析蛋白质的表达谱、研究蛋白质之间的相互作用及研究DNA与蛋白质以及RNA与蛋白质之间的相互作用。
Lab-on-a-chip是使用芯片作为平台的一种显微分析系统，其可以在生物芯片上整合基本的操作单元如样品的制备和/或筛选及产物的分离和/或检测，以完成不同的生物学或化学反应过程，从而分析所述产物。使用lab-on-a-chip，本发明的抗体的筛选、检测和/或分离可以在一个芯片上快速有效进行。关于Lab-on-a-chip的详细描述可见于例如Herold,KE；Rasooly,A(eds):Lab-on-a-Chip Technology:Biomolecular Separation and Analysi,Caister Academic Press(2009)及Edwin Oosterbroek&A.van den Berg(eds.):Lab-on-a-Chip:Miniaturized systems for(bio)chemical analysis and synthesis,Elsevier Science,second edition(2003)等。
在一个实施方案中，对本发明抗体文库中的抗体进行亲和性成熟。在一特定实施方案中，本发明的抗体文库可用于基于相对小量文库成员获得具有高亲和性的抗体。
术语“亲和性成熟”的含义为本领域熟知，可见于例如Dong,Zhiwei etal.:Antibody Engineering,Beijing Medical University Publications(2002)。典型地，术语“亲和性成熟”是指在用特定抗原免疫动物之后，因此产生和分离的抗体是结构重排及重构的，以便所述蛋白质对于特定抗原的亲和性可以增加例如3-4个数量级。在一些实施方案中，进行亲和性成熟的抗体是所有IgG亚型抗体。因此，在对抗体文库中的抗体进行亲和性成熟的情况中，从这个抗体文库中筛选具有高亲和性的抗体的可能性将大大增加。
另一方面，本发明提供了包含本发明抗体文库的组合。
本发明的抗体文库可以是组合形式，例如所述抗体文库的抗体成员可以制备为一定浓度的抗体溶液(制备方法包括腹水及体外培养等)。制备的抗体溶液可以ELISA平板形式贮存(例如96或384孔平板)，或者以芯片形式贮存。
或者，编码所述抗体文库中抗体成员的基因也可以自细胞株系中克隆，然后所述基因可用于制备抗体。
另一方面，本发明提供了生物芯片，其包含本发明的抗体文库。
另一方面，本发明提供了筛选感兴趣的蛋白质的抗体的方法，包括使用本发明的抗体文库、本发明的组合或者本发明的生物芯片筛选针对所述感兴趣的蛋白质的一或多个抗体。
在一些实施方案中，术语“感兴趣的蛋白质”或者“感兴趣的多肽”或者“感兴趣的肽”在本文可以互换使用，其均是指任何天然蛋白质或其片段，或者通过可变剪接获得的天然蛋白质的同种型，或者天然蛋白质的突变体，或者上述蛋白质的任意组合。
在一些实施方案中，本文所用术语“可变剪接”是指从同一mRNA前体中通过不同的剪接模式(即通过不同的剪接位点组合外显子)产生不同的mRNA剪接同种型的过程。通过可变剪接获得的蛋白质产物彼此是同种型，其可以呈现出不同功能和结构性质，或者由于其在相同细胞中的不同表达水平而可以产生不同的表型。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，及(b)选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：(a)将所述感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，(b)选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，(c)将所述感兴趣的蛋白质与在步骤(b)中选择的抗体或抗体组的抗体亚组混合，及(d)选择能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体或抗体亚组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括使用在步骤(d)中选择的抗体亚组重复步骤(c)和(d)，直至选择出能结合所述感兴趣的蛋白质的抗体。
在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括：(a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，(b)选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，(c)将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与在步骤(b)中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体组。
在另一实施方案中，本发明的方法包括针对几个感兴趣的蛋白质同时筛选，包括：(a)将所述几个感兴趣的蛋白质与所述抗体文库的抗体或抗体组混合，(b)选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组，(c)将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与在步骤(b)中选择的能结合所述几个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组混合，然后分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体组，(d)将所述几个感兴趣的蛋白质的每一个单独与在步骤(c)中选择的能结合各个感兴趣的蛋白质的抗体或抗体组的抗体亚组混合，及(e)分别选择能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体或抗体亚组。在另一实施方案中，本发明的方法进一步包括使用在步骤(e)中选择的抗体亚组重复步骤(d)和(e)，直至分别选择出能结合所述几个感兴趣的蛋白质的每一个的抗体。
在一些实施方案中，术语“抗体组”是指不同抗体的混合物，其可含有几个、几十个、几百个或者几千个不同的抗体。抗体组可以进一步分成含有不同抗体的几个抗体亚组。
在一特定实施方案中，本领域技术人员根据特定需求可以将抗体文库分成几个抗体组，如含有几个、几十个、几百个或几千个不同抗体的组。例如，含有10000个抗体的抗体文库可分成100个组，每组含有100个不同的抗体。将感兴趣的蛋白质单独与每组混合，然后选择可以结合所述感兴趣的蛋白质的组。这种组可用于进一步筛选。例如，上述选择的含有100个抗体的抗体组可以进一步分成10个亚组，每个亚组含有10个抗体。将感兴趣的蛋白质单独与每个亚组混合，然后选择可以结合所述感兴趣的蛋白质的亚组。根据这种策略，可以重复进行所述筛选，直至选择出可以结合所述感兴趣的蛋白质的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体可直接使用或者在稀释后使用，优选其以相同浓度使用。例如，可以将不同的抗体均稀释为100μg/ml，可以取等体积的抗体溶液及随后混合，以获得含有不同抗体的组。以此方式，几十至几千个抗体可以制备为抗体组组合。本领域技术人员可以选择适合所述抗体的稀释液体，如HEPES溶液，例如含有2mg/ml Proclin300、1％BSA、pH7.4的HEPES溶液。
本发明中使用的筛选方法可以是ELISA、斑点印迹或蛋白质芯片以及可证实蛋白质与抗体之间相互作用的其它检测方法。这些方法均是本领域熟知的技术手段。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选线性多肽的抗体。
术语“线性多肽”是指在蛋白质中连续的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选可溶多肽的抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选修饰的多肽的抗体。
术语“修饰的多肽”、“修饰的蛋白质”和“修饰的肽”在本文可互换使用，其均是指已经被修饰或翻译后修饰的蛋白质或多肽，如已经磷酸化、甲基化或乙酰化的蛋白质或多肽。
本发明的抗体文库可用于产生分别针对修饰的多肽和未修饰的前体多肽(也称作区别多肽，即未被翻译后修饰的多肽形式)的不同抗体。对于所述多肽是阳性的细胞株系可用于分别检测修饰的多肽和未修饰的多肽的效价。当这两个效价之间的差别达到某种程度时，如大于8[单位？]，则所述抗体被认为能区分这两种多肽。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于筛选毒性多肽的抗体。术语“毒性多肽”和“毒性蛋白质”在本文可互换使用，其均是指在动物或在细胞中可产生毒性的蛋白质或多肽。由于其毒性，常规的抗体制备方法不可用于产生对所述毒性多肽具有高亲和性的抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法可以使用高通量筛选装置进行。在一个实施方案中，本发明方法中使用的高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者lab-on-a-chip(LOC)。
另一方面，本发明还涉及本发明的抗体文库在制备筛选针对感兴趣的蛋白质的抗体的装置或试剂盒中的应用。在一个实施方案中，所述装置是高通量筛选装置。在另一实施方案中，所述高通量筛选装置是生物芯片，如蛋白质芯片，或者lab-on-a-chip(LOC)。
使用本发明的抗体文库，可以获得针对不同类型蛋白质(线性、可溶、未修饰的、修饰的)的抗体。使用本发明的抗体文库获得的50％以上的抗体的亲和性低于100nM。获得可用细胞株系的可能性在万分之几至几万分之一之间，这较常规的展示技术高得多。对于常规的噬菌体展示文库，尽管文库的含量达到106水平，但是从中筛选可用抗体的成功率几乎为0，这是由于获得的抗体的亲和性通常不能满足应用要求。
本发明的抗体文库基于相对特异性原理，所述抗体文库含有针对几万个抗原的抗体，从而可以在短时间内(如一周)获得对于靶抗原具有高亲和性的单克隆抗体。这个时间及其成本较常规单克隆技术低得多。对于正常的蛋白质抗原，由此获得的抗体的亲和性当与以常规方法获得的抗体相比时示出无实际差别。此外，本发明的抗体文库的含量持续增加，随着文库含量的增加，筛选抗体的成功率将由此迅速增加。
另外，本发明的筛选方法也可用于筛选针对抗原的抗体，所述抗原的抗体不能使用常规方法制备，如毒性抗原或者自身免疫性抗原。
本发明实现了以低成本及高通量方式制备具有高亲和性的抗体的技术方法，其可用于在短时间内制备抗体。本发明的抗体文库以及筛选方法也可以与高通量技术如蛋白质芯片组合。
D.实施例
本发明通过如下实施例进一步详细描述。提供这些实施例只是说明目的，不应理解为限制本发明的范围。具体地，本发明含有如下实施例：
实施例1描述了含有10000个抗体的抗体文库的构建，及证实筛选20个不同蛋白质的抗体的成功率为85％；
实施例2描述了含有50000个抗体的抗体文库的构建；
实施例3描述了筛选修饰的肽的抗体；
实施例4描述了筛选及检测ERK2蛋白质的抗体；
实施例5描述了筛选及检测可溶蛋白质Desmin的抗体；
实施例6描述了筛选毒性蛋白质霍乱毒素的抗体，及获得的抗体的亲和性成熟；
实施例7描述了筛选不溶蛋白质的抗体；及
实施例8描述了抗体生物芯片的制备，及使用所述生物芯片筛选人血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。
实施例1：抗体文库的构建
这个实施例描述了举例的抗体文库的构建。
A.使用随机肽产生抗体
随机肽的产生：
i.随机产生具有10个氨基酸的肽序列，其不含有半胱氨酸；
ii.所述肽序列的淘选原理：每个随机产生的肽的初始分值设定为10；对于具有潜在糖基化位点的氨基酸，每个潜在糖基化位点从所述分值中减去1点；
iii.具有10个氨基酸的所述肽序列不含有3个或更多个连续的相同氨基酸；
iv.具有10个氨基酸的所述肽序列不含有5个或更多个相同氨基酸；
v.所述肽序列中每个氨基酸K或R从所述分值中减去4点；及
vi.基于上述分值，从上至下选择具有最高分值的10000个肽，然后化学合成(合成方法可见于Chemistry of Peptide Synthesis,N.Leo Benoiton,2005)。
肽抗原的制备、免疫方法及单克隆抗体的制备均是本领域已知的常用技术，关于这些技术的描述可见于相关出版物和教材，例如Bazin,Rathybridomas and rat monoclonal antibodies,CRC Press,1990；Goding,Monoclonal antibodies:principles and practice,3rd edition,Academic Press,1996；Shepherd and Dean Monoclonal antibodies,Oxford University Press,2000等。
B.使用初次用于实验的小鼠的脾细胞产生抗体
制备单克隆抗体的方法可见于例如Bazin,Rat hybridomas and ratmonoclonal antibodies,CRC Press,1990；Goding,Monoclonal antibodies:principles and practice,3rd edition,Academic Press,1996；Shepherd and DeanMonoclonal antibodies,Oxford University Press,2000等。
从未进行免疫的小鼠脾中取淋巴细胞，然后通过细胞融合制备杂交瘤细胞；使用山羊抗小鼠IgG抗体(Abmart,20100815)检测可以分泌抗体的杂交瘤细胞。
特别地，将山羊抗小鼠IgG抗体使用0.01M Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH9.0)稀释为1μg/ml，然后加入具有高吸附容量的96孔ELISA平板(SYBIO,Hangzhou,China)中，在每孔中加入100μl，在4℃包被过夜，用PBST洗涤3次，每次加入250μl/孔洗涤溶液。在每个孔中加入250μl封闭溶液(含有1％BSA的PBST溶液)，在37℃封闭1小时，用PBST洗涤3次，每次加入250μl/孔洗涤溶液。从细胞融合平板的每个孔取20μl上清，补加80μl封闭溶液，在37℃保温1小时，除去平板中剩余的溶液，用PBST洗涤3次，每次加入250μl/孔洗涤溶液。将100μl HRP-标记的山羊抗小鼠抗体(Abmart,20110228)加入每个孔中，在37℃保温1小时，用PBST洗涤5次，每次加入250μl/孔洗涤溶液。加入辣根过氧化物酶底物TMB溶液(Sigma)，在37℃保温15分钟，在每个孔中加入50μl的2M H2SO4溶液以结束反应，在450nm读取吸收值。
C.通过用总蛋白质提取物免疫动物产生抗体
蛋白质制备：将HeLa细胞用含有蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1％Triton-X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS裂解溶液)裂解，并通过BCA(Biocolors,Shanghai,China)量化。
肽抗原的制备、免疫方法及单克隆抗体的制备均为本领域已知的常用技术，关于这些技术的描述可见于相关出版物和教材，例如Bazin,Rathybridomas and rat monoclonal antibodies,CRC Press,1990；Goding,Monoclonal antibodies:principles and practice,3rd edition,Academic Press,1996；Shepherd and Dean Monoclonal antibodies,Oxford University Press,2000等。
D.构建抗体文库
取在上述步骤A、B和C中获得的纯化的抗体并混合，以构成抗体文库。将抗体文库的每100个不同抗体混合以形成抗体亚文库，获得共100个亚文库。
E.使用含有10000个抗体的构建的抗体文库筛选蛋白质的抗体
将长度为100-600个氨基酸的20个可溶蛋白质用作靶蛋白质，以证实含有10000个抗体的抗体文库在筛选具有特殊构象的蛋白质的抗体的成功率。
所述靶蛋白质均购自Shanghai PrimeGene Bio-Tech LTD，所述特定的蛋白质可见于下表2。
表2：筛选重组蛋白质的特异性抗体
所述20个蛋白质作为抗原配制成溶液，浓度为0.2μg/ml，将其单独用于包被100个ELISA平板，每个孔中加入100μl所述溶液，在4℃包被过夜。采用ELISA方法筛选阳性抗体组合(具体方法可见实施例1的B步骤)。将抗体文库中的抗体以1:16000稀释(0.02M PH7.4磷酸盐缓冲液)，然后用于检测其是否识别所述抗原。ELISA OD值超过1.0被定义为阳性。获得的可识别单一蛋白质的抗体亚文库被认为是感兴趣的抗体亚文库。
对于可识别单一蛋白质的抗体亚文库，将各个蛋白质用作抗原以单独检测亚文库中的100个抗体，以获得可识别各个蛋白质的阳性细胞株系。具体的筛选结果可见表2。对于这20个蛋白质，获得至少1个特异性抗体的成功率为85％。
此外，随着文库含量的增加，筛选成功率也进一步增加。
实施例2：构建具有50000个抗体的抗体文库
进一步增加抗体文库的含量。新的抗体文库含有在实施例1中构建的抗体文库的所有抗体、衍生自未免疫小鼠的抗体及衍生自用总蛋白质提取物免疫的小鼠的抗体，以及通过用更多的肽免疫小鼠获得的单克隆抗体。使用15000个肽(其序列在SEQ ID NO:1-15000中示出)免疫小鼠以制备抗体，针对每种肽选择具有最高效价的3个株系，除外不能成功用于制备抗体的那些肽(3000个)，使用另外的12000个肽(SEQ ID NO:1-12000)成功获得36000个株系。收集所有上述单克隆抗体以构建含有50000个抗体的抗体文库。不同抗体的来源在表3和4中示出。根据抗原设计原理，共54771个具有10个氨基酸的肽(SEQ ID NO:1-55471)收集在Abmart肽文库中。
含有50000个抗体的抗体文库分成500个抗体组，每组含有100个不同抗体。
表3：具有50000个成员的抗体文库中不同抗体的来源
表4：总蛋白质提取物
基于具有不同含量的抗体文库，不同计划的成功率在表5中概括。文库含量的增加可以显著增加针对不同抗原筛选的成功率。使用具有50000个成员为基础的抗体文库，每次在抗体文库中加入3000-5000个新的单克隆抗体(基于54771个肽)。更高水平的文库含量可进一步增加成功率。
表5：不同文库含量对成功率的影响
如下实施例3-8中使用的抗体文库是在实施例2中构建的具有大约50000个抗体的抗体文库。
实施例3：筛选修饰的肽的抗体
这个实施例描述了修饰的肽的抗体的筛选。获得的抗体可以区分修饰的肽与各自未修饰的肽。
修饰的肽和各自未修饰的肽是由Scilight-Peptide Inc.,Beijing,China合成的，所有合成的肽的纯度超过85％。
肽序列设计为：p-蛋白质名称-修饰位点。
表6：修饰的肽序列
A.肽抗原的偶联
将作为抗原的肽通过戊二醛方法与BAS偶联，关于所述方法的详细描述可见例如The Protein Protocols Handbook,Cytogen,Princeton,Humanapress。
B.筛选肽特异性抗体
筛选方法与在实施例1中步骤E相似。
特别地：首先，将16个修饰的肽用作抗原，以单独筛选识别各自抗原的阳性抗体亚文库。根据筛选结果，筛选的阳性抗体亚文库用作基础以进一步筛选单个修饰的肽的抗体。
基于筛选的阳性孔，将偶联的修饰的肽与偶联的未修饰的肽单独用作抗原以检测筛选的抗体是否能区分这两种类型的肽。在待检测的抗体可以结合修饰的肽并示出OD值大于各自未修饰的肽的相应OD值的3倍的情况中，认为所述抗体能区分这两种类型的肽，即所述抗体能特异性识别修饰的肽。
详细筛选结果可见于表7。
表7：针对修饰的肽的筛选结果
C.筛选的阳性抗体可识别磷酸化的Akt蛋白质
Western印迹方法如下：将经胰岛素处理的和未处理的293T细胞(ATCC，CRL-11268TM)用含有蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(50mMTris pH7.4，150mM NaCl，1％Triton-X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS裂解溶液)裂解，并通过BCA量化(Biocolors,Shanghai,China)，用5×加样缓冲液稀释，在100℃变性10分钟后，将20-30ng样品加样于每个泳道中，使用10％SDS-PAGE进行凝胶电泳，在PVDF膜转移之后用5％脱脂乳封闭，一抗是abmart-抗-Akt(Phospho-Ser473)，在以1:500稀释各个小鼠腹水之后，在室温保温1小时，用1×PBST洗涤3次，每次5分钟；二抗是abmart-抗-小鼠-HRP，在用5％脱脂乳的PBST溶液以1:5000稀释之后，置于保温盒中，在室温保温30分钟，用1×PBST洗涤3次，每次5分钟，使用ECLPlus(Amersham)进行检测。
Western检测结果示出筛选的抗体可以特异性识别胰岛素诱导的293T细胞中磷酸化的Akt蛋白质(见图1)。
实施例4：筛选ERK2蛋白质的抗体
这个实施例描述了ERK2蛋白质的抗体的筛选与检测。
A.筛选ERK2蛋白质的抗体
ERK2蛋白质购自Sino Biological Inc.,Beijing,China。筛选抗体的方法可见于上述实施例。从抗体文库中筛选共5个阳性抗体株系，其中2个的亲和性低于10nM。
B.Western印迹方法
用于Western印迹检测的细胞系是Hela细胞系(ATCC，CCL-2.2TM)，处理方法与实施例3相同。
Western检测结果示出筛选的抗体可以特异性识别Hela细胞中ERK2蛋白。抗体1937-1A5(Abmart,20100605)是单克隆抗体，已经证实其特异性识别ERK2蛋白(检测ERK2的商业化抗体)；抗体2540-3B9是从所述抗体文库中筛选的特异性抗体(见图2)，其也可以识别ERK2蛋白。
实施例5：筛选可溶蛋白Desmin的特异性抗体
这个实施例描述了可溶蛋白Desmin的抗体的筛选与检测。
A.筛选Desmin蛋白的抗体
Desmin蛋白购自ProSpec(USA)。筛选抗体的方法可见于上述实施例。从所述抗体文库中筛选共6个阳性抗体株系，其中1个的亲和性低于10nM。
B.Desmin蛋白的免疫组织化学证实
Desmin蛋白是在子宫颈癌组织中特异性高度表达的蛋白质，因此子宫颈癌组织切片用于证实抗Desmin蛋白的抗体的特异性和效力。子宫颈癌组织切片购自Fengfan Medical Science Development LTD.,Luohe,China，关于切片和检测的方法可见于例如(Immunohistochemisty ExperimentalTechniques and Applications,2006,Chemical Industry Publication,Beijing,China)。得自抗体文库筛选的抗体用于检测所述组织切片，所述抗体的克隆号是1956-1NB-2E7。将所述抗体(腹水)用含有5％脱脂乳的PBST溶液以1:500稀释，二抗为山羊抗小鼠标记的HRP(Abmart,1:5000)。
将所述组织切片固定，然后置于光学显微镜下观测。IHC结果示出抗体1956-1NB-2E7可特异性检测所述组织中的Desmin蛋白，即其具有良好的组织特异性。
实施例6：筛选霍乱毒素特异性抗体及其亲和性成熟
这个实施例描述了毒性蛋白质霍乱毒素的抗体的筛选，及获得的抗体的亲和性成熟。
对于细菌毒素如霍乱毒素和肉毒素，由于其高毒性，因此常规的免疫小鼠的方法不可用于制备其特异性抗体。为了证实所述抗体文库在筛选这种蛋白质的抗体中的独特优势，选择霍乱毒素作为抗原筛选其抗体。
霍乱毒素购自中国北京MACGENE TECH.。筛选抗体的方法与实施例1中的步骤E相同。从所述抗体文库中共筛选3个阳性抗体株系，其中1个的亲和性低于10nM。在竞争性ELISA方法中，这个抗体对于标准品可具有10ng/ml检测灵敏性。
霍乱毒素特异性抗体的亲和性成熟：进行亲和性成熟的方法是轻链改组方法，这个方法的原理可见于ANTIBODY ENGINEERING，Methods inMolecular Biology,2004,Volume 248,III,327-343。
1.获得小鼠轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。扩增方法：Rohatgi S,Ganju P,Sehgal D.Systematic design and testing of nested(RT-)PCR primersfor specific amplification of mouse rearranged/expressed immunoglobulinvariable region genes from small number of B cells.J Immunol Methods.2008；339(2):205-1。获得的可变区可见于下表8。
表8：获得的可变区
2.将VH基因通过SalI和NheI限制位点克隆进双载体展示系统的pHG载体中(Abmart，见图5)，所述载体含有重链CH1的恒定区，其可以用于展示Fab重链抗体。
3.将含有VH基因的pHG质粒及构建的人源化轻链抗体文库pHLDis-VL(Abmart，重新合成的，见图6)以1:1比率混合，然后将混合物电转化进TransMax感受态细胞(Takara,Dalian,China)中，收集所有转化的株系及形成亲和性成熟的抗体文库。
4.使用标准方法制备亲和性成熟的噬菌体抗体文库，及制备噬菌体抗体展示文库以进行筛选(所述方法可见于Amersham biosciences:ExpressionModule/Recombinant Phage Antibody System)。
5.使用筛选的噬菌体文库感染含有pHG质粒的TransMax株系，进行下一轮筛选，在2-3轮筛选后挑取单克隆进行检测，使用噬菌体ELISA检测及鉴别抗体的灵敏性(所述方法可见于Amersham biosciences:ExpressionModule/Recombinant Phage Antibody System)。
6.在检测霍乱毒素的噬菌体抗体的灵敏性之后，所述靶的单克隆1948-3B5-1C12的检测限达到1.2ng/ml。
7.在测序后，获得的具有高亲和性的抗体的κ链的序列在表9中示出，粗体字(及下划线)所示氨基酸表示与原始序列的差别。
表9
实施例7：筛选不可溶蛋白质的特异性抗体
这个实施例描述了不可溶蛋白质的抗体的筛选。
玉米家族的CBL4蛋白(24KD)，其全长形式具有211个氨基酸，是通过在大肠杆菌表达系统中重组表达获得的(Abmart，20100504)。这个蛋白质在8M尿素的变性溶液中可以溶解，但是在非变性溶液中是不可溶的。
筛选抗体的方法与实施例1中步骤E基本相同，不同的是使用PH 7.0的8M尿素溶液作为不可溶蛋白质的包被溶液，包被溶液的蛋白质浓度为0.2ug/ml。
从所述抗体文库中筛选出共5个阳性抗体株系，其中1个在该蛋白质过表达的证实细胞系中成功(靶蛋白质与GFP表达为融合蛋白-50KD)。以两种模式进行Western印迹实验，即分别针对所述阳性抗体(1233-6G5)及针对GFP(Abmart,1:1000)。这两种模式中示出的条带是相同的，其均是适当大小，表明在50000水平的抗体文库可用于筛选不可溶蛋白质的抗体(见图4)。
实施例8：制备抗体生物芯片及筛选蛋白特异性抗体
这个实施例描述了抗体生物芯片的制备，及使用所述生物芯片筛选人血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。
制备抗体生物芯片：将抗体文库样品等份加样于384孔细胞培养平板中，使用CapitalBio SmartArrayerTM48点样器和CapitalBio三维H-group玻片(CapitalBio,Beijing China)；封闭芯片：使用含有10mg/ml BSA的30mlPBS溶液封闭所述芯片，在室温摇动1小时；洗涤：用TBST溶液(30ml/次)洗涤芯片两次，每次间隔5分钟；取出芯片，除去表面上剩余的水分，将芯片保持不完全干燥，在-80℃贮存。
人血管内皮生长因子(VEGF)购自PeproTech，将样品用PBS透析，然后使用超滤管(10K)浓缩，测量蛋白质浓度(确定超过1mg/ml)；生物素标记：使用Pierce NHS激活的生物素，计算生物素的需要量(所述生物素保持为粉末，在使用之前新鲜配制)。将样品在室温保持1小时，然后加入1M Tris(pH7.2，Tris与生物素的摩尔比率为5:1)以结束反应。使用脱盐柱进行脱盐4-5次，然后将样品分成等份，冷冻贮存。
直接点滴1ml生物素标记的抗原(<2μg/ml,含有10mg/ml BSA的TBST溶液)或者借助于盖玻片加入100μl；在室温静置1小时；用TBST溶液洗涤5次，在每次洗涤期间彻底摇动；取出芯片并除去表面上剩余的水分，将芯片保持不完全干燥。直接点滴1ml荧光素标记的链霉抗生物素蛋白(1000倍稀释，10mg/ml TBST溶液)，在室温静置1小时；用TBST溶液洗涤4次，每次5分钟，彻底摇动，然后用蒸馏水漂洗3次，每次5分钟，冲洗30秒。最后，通过离心干燥芯片；扫描，读取数据。
从所述芯片中筛选出共10个阳性抗体株系(荧光强度大于200)，其中3个株系通过Western印迹核实，表明其可以特异性识别VEGF蛋白(VEGF核实数据)。
如图3示出，泳道3、4、5筛选特异性单克隆抗体，泳道9是先前成功核实的阳性抗体。从Western印迹结果可以看出，筛选的抗体可以特异性识别VEGF蛋白，与已知阳性抗体一样。
上述实施例只是说明目的，不意图限制本发明的范围。可以对上文的描述进行一些改变。由于对上文的描述的实例进行的修饰和改变对本领域技术人员是显而易见的，因此本发明仅通过所附权利要求书的范围限制。
