用于生物反应系统的包被的基底
相关申请的交叉引用tt
本申请要求2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612,005tt号、2012年3月16日递交的美国临时专利申请第61/612,087号、2012tt年11月7日递交的美国临时专利申请第61/723,759号、2012年3月16tt日递交的美国临时专利申请第61/612,008号、2012年11月7日递交的美tt国临时专利申请第61/723,658号和2012年11月7日递交的美国临时专tt利申请第61/723,738号的优先权，所有以上申请还均通过引用整体并入tt本文。tt
发明背景tt
本公开涉及处理用于生物反应系统的基底表面的方法，且更具体地，tt涉及对用于生物反应系统的基底表面进行化学处理以防止生物分子粘附tt于该表面的方法。tt
聚合酶链式反应(PCR)是扩增靶DNA序列的方法。以前，PCR通常tt在96或384孔微板中进行。如果期望更高的产量，在微板中进行的常规ttPCR方法则不具成本效益或高效性。而且，在增加通量方面，降低PCRtt反应体积可降低试剂的消耗，并从反应体积的热质减少而使得扩增次数tt减少。该策略可以阵列形式(m x n)实施，产生大量的较小反应体积。此tt外，采用阵列允许进行具有增加的定量灵敏度、动态范围和特异性的可tt扩展高通量分析。tt
阵列也已经被用于进行数字聚合酶链式反应(dPCR)。来自dPCR的tt结果可用于检测和定量稀有等位基因的浓度，以提供核酸样品的绝对定tt量，并测量核酸浓度的低倍数变化。通常，增加重复的数量能增加dPCRtt结果的精确度和再现性。tt
大多数定量聚合酶链式反应(qPCR)平台中的阵列形式被设计用于基tt于样品的分析(sample-by-assay)的实验，其中PCR结果需为可寻址的以用tttttt于运行后分析。然而，对于dPCR，每个PCR结果的具体位置或小井可tt能是不重要的，且可仅分析阳性和阴性重复的数目。tt
dPCR的读数，也即，阳性反应数目和阴性反应数目与模板的浓度呈tt线性比例关系，而qPCR读数(信号相对于循环)与模板浓度的对数成比tt例。因而，对于dPCR，可取的是使样品体积最小化。tt
然而，持续降低反应体积会导致例如对涉及将样品体积加载至阵列tt并维持所述样品体积的物理分离的置信度的挑战。换句话说，将样品体tt积加载至尽可能多的小井或通孔并减少小井或通孔之间的交叉串扰非常tt重要。tt
发明概述tt
在一个示例性实施方案中，提供了用于生物反应的装置。所述装置tt包括基底和在所述基底中的多个反应位点。基底的表面被配置为具有第tt一亲水性，且所述多个反应位点的每个表面被配置为具有第二亲水性，tt以用样品体积加载相当数量的反应位点。每个加载的反应位点的样品体tt积基本上被限制于其各自的反应位点。所述样品体积被配置为在反应位tt点内经历生物反应。tt
附图说明tt
图1为根据本文教导的各种实施方案的示例性包被的基底；tt
图2显示了根据本文教导的各种实施方案的后退和前进接触角；tt
图3显示了根据本文教导的各种实施方案，通过样品加载器加载反tt应位点；tt
图4的流程图显示了根据本文教导的各种实施方案的示例性方法；tt
图5显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的基底表面的tt步骤；tt
图6显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的垂直面的步tt骤；tt
图7显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的基底表面的tt另一步骤；tt
图8显示了包被根据本文教导的各种实施方案的基底的垂直面的另tt一步骤；和tt
图9的方框图显示了可使用根据本文教导的各种实施方案包被的基tt底的示例性聚合酶链式反应仪。tt
发明详述tt
为了提供对本发明更充分的理解，以下描述列举了很多具体细节如tt具体结构、参数、实例等。然而，应认识到这样的描述并非旨在限制本tt发明的范围，而是旨在提供对示例性实施方案的更好描述。tt
同时进行几个生物反应可能需要具有多个反应位点的基底，各反应tt位点具有加载的样品。应认识到，反应位点可为但不限于，例如通孔、tt凹口或小井。而且，为增加每个实验的反应数目，可增加基底上的反应tt位点密度，同时也降低样品区大小。例如，在15mmx15mm的基底上可tt包含10,000个反应位点。然而，如果在15mmx15mm的基底包含30,000tt个反应位点，样品区可随着基底上的反应位点密度不断增大而变得更小。tt
根据本文描述的各种实施方案，提供了可用样品体积充分加载的装tt置。基底特定区域的表面特性如疏水性和/或亲水性可有助于将液体样品tt加载至反应位点。如上所述，疏水性/亲水性的水平可基于影响加载基底tt的多个反应位点的便利性和效率的各种因素。tt
例如，影响反应位点加载的一个因素为反应位点的物理几何形状，tt并且/或者基底可能有助于加载所述样品。例如基于反应位点深度(芯片厚tt度)和反应位点直径的反应位点之间的纵横比，可为确定充分加载所述反tt应位点所需特性的因素。反应位点深度(芯片厚度)与直径的比率被称为纵tt横比。例如，如果反应位点深度等于反应位点直径，则纵横比为1。在另tt一实例中，当反应位点深度为反应位点直径的10倍时，纵横比为10。反tt应位点的直径影响毛细管力，其使得能够/有助于用液体反应媒介加载反tt应位点。在一些实施方案中，直径越小，毛细管力越大，且更利于/便于tt加载反应位点。tt
根据各种实施方案，影响用样品体积加载反应位点的另一因素为期tt望的加载效率和/或一致性。期望的效率是大于或等于90％的反应位点被tttttt加载。在其他实施方案中，期望的效率可为90％的反应位点被加载，且tt反应位点之间的差异最多为10％。tt
根据各种实施方案，影响用样品体积加载反应位点的另一因素为在tt反应位点内材料与期望的反应的相容性。在一些实施方案中，所述期望tt的反应可为扩增反应。更具体地，所述扩增反应可为聚合酶链式反应tt(PCR)。根据各种实施方案，装置接触例如参与反应的样品体积、酶或试tt剂的部分，不应该与样品体积、酶或试剂发生化学相互作用。例如，接tt触反应的材料不应该将可能干扰反应的离子泄露到所述反应位点。tt
根据各种实施方案，影响加载反应位点的又一因素为被加载至反应tt位点后所需的样品体积的限制。换句话说，需要有足够的力来防止从每tt个反应位点泄漏样品体积，以防止从一个反应位点溢出至另一反应位tt点，并防止样品体积在反应位点外的任何积聚。tt
考虑到上述因素，能满足这些目标的装置可被设计和用于在包含小tt体积的多个反应位点中进行反应。tt
为使表面产生足够的疏水/亲水特性，可将该表面包被另一种材料。tt根据本文教导的各种实施方案，基底表面的部分的涂层具有亲水特性，tt且反应位点表面的部分的涂层具有亲水特性。尽管两种表面均具有亲水tt特性，所述反应位点可通过例如毛细管作用来加载。根据各种实施方案，tt所述亲水涂层可为相同的涂层。根据各种实施方案，所述涂层可通过气tt相沉积来包被。tt
另一方面，根据本文教导的各种实施方案，基底表面的部分的涂层tt具有疏水特性，且反应位点表面的部分的涂层具有疏水特性。尽管两种tt表面均具有疏水特性，所述反应位点可通过例如毛细管作用来加载。根tt据各种实施方案，所述疏水涂层可为相同的涂层。根据各种实施方案，tt所述涂层可通过气相沉积来包被。tt
而且，根据本文描述的其他实施方案，基底的包被方法包括包被基tt底表面的部分以具有疏水特性，并包被基底表面的部分以具有亲水特性，tt这可能会有助益。而且，根据一些实施方案，包被样品区表面以具有亲tt水性，并包被基底的其他表面以具有疏水性。以这种方式，所述疏水性/tttttt亲水性有助于将液体样品加载至反应位点。所述反应位点可通过例如毛tt细管作用来加载。tt
此外，根据各种实施方案，具有疏水/亲水表面可减少反应位点之间tt液体样品的交叉污染。所述疏水区可有助于将每个液体样品保持在反应tt位点内其各自的样品区。根据各种实施方案，连续或完全的涂层也可防tt止或减少从基底泄漏可能会干扰反应的离子。tt
根据各种实施方案，涂层相比其他涂层具有增加的物理和化学稳定tt性且为生物相容的。其可防止或减少吸附以及随后用于生物反应的活性tt生物化学物质和材料的抑制作用。这些可包括例如酶、探针和DNA。尤tt其是对于数字PCR应用，重要的是使反应化学物质和组分被吸附至不期tt望的表面减至最小。tt
基底
根据本文描述的各种实施方案，基底材料可为例如硅、氧化硅、玻tt璃、金属、陶瓷或塑料。玻璃可为光敏玻璃。然而，本领域技术人员应tt认识到，根据本文教导的各种实施方案，可包被生物相容且不干扰荧光tt检测的任何材料。tt
如以上所述，减少反应体积可允许更高密度的反应体积，从而可在tt给定的区域内进行更多的反应。例如，基底上由300μm直径的通孔组成tt的阵列可含有约30nL的反应体积。例如，通过将阵列中每个通孔的大小tt降低至直径60-70μm，每个反应体积可为100pL。根据本文描述的各种tt实施方案，反应体积的范围可为约1pL至30nL。在一些实施方案中，tt反应位点阵列可由各种不同体积的反应区域组成以增加动态范围。tt
图1显示了根据本文描述的各种实施方案的芯片100，其包含具有反tt应位点104的阵列的基底100。芯片100可称为例如物件、装置、消耗品、tt阵列、滑片(slide)或压板。tt
芯片100包括基底100。基底102可为各种材料，包括但不限于，例tt如金属、玻璃、陶硅和氧化硅。tt
芯片100还包括多个反应位点104。所述多个反应位点104可为例如tt小井、空腔或通孔。每个样品区也可具有多种横截面几何形状，例如圆tttttt形、三角形或六边形。具有其他几何形状可允许更紧密地装填反应位点，tt以进一步增加在给定区域中的反应数目。而且，反应位点的几何形状也tt可有助于将液体样品加载至反应位点。tt
图1中芯片100的横截面图显示了多个通孔104。每个通孔104从基tt底102第一表面的开口延伸至基底102第二表面的开口，每个通孔104tt被配置为通过毛细管作用提供足够的表面张力以容纳待处理或检测的各tt个含有生物样品的液体样品。芯片100可具有如以下任一申请中所公开tt的通用形式或结构：美国专利第6,306,578、7,332,271、7,604,983、tt7,682,565、6,387,331或6,893,877号，其通过引用整体并入本文，如同其tt在本文被充分地陈述。tt
根据各种实施方案，通孔104可具有约1.3纳升的容积。可选择地，tt例如，通过减小通孔104的直径和/或基底102的厚度，每个通孔的容积tt可小于1.3纳升。例如，每个通孔104具有的容积可为小于或等于1纳升、tt小于或等于100皮升、小于或等于30皮升，或小于或等于10皮升。在tt其他实施方案中，一些或所有通孔104的容积范围可为1-20纳升。tt
在某些实施方案中，通孔104的密度可为至少50个通孔/平方毫米。tt在其他实施方案中，通孔的密度可能更高。例如，芯片100内通孔104tt的密度可大于或等于150个通孔/平方毫米、大于或等于200个通孔/平方tt毫米、大于或等于500个通孔/平方毫米、大于或等于1,000个通孔/平方tt毫米、大于或等于10,000个通孔/平方毫米。tt
芯片100的其他实施方案还描述于以下文献中：2012年3月16日递tt交的第61/612,087号临时申请(案件编号LT00655 PRO)和2012年11月7tt日递交的第61/723,759号临时申请(案件编号LT00655 PRO 2)，为所有目tt的将其并入本文。tt
如上所述，减少样品区域的大小可导致与将液体样品加载至每个样tt品区有关的挑战。根据本文描述的各种实施方案，施用至基底表面的涂tt层可有助于将液体样品加载至反应位点，以及使反应位点之间的串扰减tt至最小。tt
根据本文描述的实施方案，在包被之前，可清洁和水化所述基底以tt使其准备用于随后的化学反应。清洁以去除在运输和储藏期间可能发生tt的任何可能的污染，例如，从而确保包被过程的一致性。tt
应认识到，本文件描述的方法和方案为根据本文描述的各种实施方tt案的实例。可修改所述方案以用于高纵横比芯片和/或低纵横比芯片。在tt一些实施方案中，当水接触角为60-100度时，可产生充分的加载。在其tt他实施方案中，当水接触角为75-90度时，可产生充分的加载。tt
而且，如各种实施方案所描述，双涂层和单涂层均可实现包被。而tt且，根据各种实施方案的包被方法可包括例如液体包被方法以及气相沉tt积方法。tt
亲水性方法tt
如以上所述，根据本文教导的各种实施方案，可使用基底表面以及tt反应位点表面的亲水涂层以便制备用于生物反应的反应位点阵列。同tt样，如以上所述，基底可称为芯片，而反应位点可为，但不限于，例如tt通孔、凹口或小井。根据各种实施方案，基底表面和反应位点的涂层可tt为相同的材料。在其他实施方案中，基底表面和反应位点的涂层可为不tt同的材料。基底表面和反应位点表面可通过气相沉积方法来包被。tt
尽管根据各种实施方案，基底表面和反应位点表面均可能具有亲水tt特性，可基于毛细管作用来加载液体样品。换句话说，液体样品和反应tt位点壁之间的粘附力将把所述液体样品拉入反应位点。从以下等式中可tt知，可被拉入每个反应位点的液体样品的量，取决于反应位点的半径。tt
液柱的高度h通过下式给出：tt
其中γ为液体-空气表面张力(力/单位长度)，θ为水接触角，ρ为液体tt密度(质量/体积)，g为当地重力场强度(力/单位质量)，且r为反应位点的tt半径(长度)。tt
根据各种实施方案，基底表面和反应位点的疏水/亲水特性可取决于tt组成基底和反应位点的材料和/或那些表面涂层的材料。加载反应位点的tt效率取决于液体样品与基底表面和反应位点表面的水接触角。tt
从样品加载器进行液体样品散布取决于液体样品的水接触角。所述tt水接触角源自样品加载器的材料特性和液体样品特性之间的关系。当水tt接触角小于90度时，液体样品和基底表面的关系为亲水的，且样品展现tt出与基底表面紧密结合的相互作用，其对于毛细管作用将样品拉至通孔tt中是必需的。过于亲水的基底，例如水接触角小于50度，可导致例如增tt加过量液体样品在基底表面的积聚或低效的反应位点加载。而且，低接tt触角可导致液体样品过快移动至一些反应位点，引起液体样品在所述多tt个反应位点中分配不均。tt
相反，当水接触角大于90度时，基底表面和液体样品的关系为疏水tt的，且液体样品不会移动至反应位点，因为毛细管作用力为负的tt(negative)。这种情况也会导致液体样品在基底表面的积聚，并阻止将液tt体样品加载至一些反应位点。如此，基底和反应位点的表面被设计为平tt衡基底和反应位点表面针对液体样品的疏水性和亲水性。tt
根据各种实施方案，考虑到这些特性，通过将样品加载器配置为使tt得与液体样品的前进接触角类似于与液体样品的后退接触角，可实现有tt效的加载。参照图2，所示为前进和后退接触角。显示了基底200上的水tt滴202。如果基底倾斜，水滴202将具有前进接触角206和后退接触角tt204。tt
根据本文描述的各种实施方案，70-85度的前进接触角可提供将液体tt样品充分地加载至反应位点。tt
前进和后退接触角之间的差异被称为滞后。在各种实施方案中，可tt设计表面特性以便滞后为零度。在其他实施方案中，可设计表面特性以tt便滞后小于或等于30度。在其他实施方案中，可设计表面特性以便滞后tt小于或等于20度。在其他实施方案中，可设计表面特性以便滞后为0-15tt度。具有高滞后的芯片在加载至通孔的体积中会表现出变化，且可能倾tt向于在外表面上聚集样品。tt
参照图3，显示了根据本文描述的各种实施方案，通过样品加载器加tt载反应位点。待加载至反应位点104的液体样品304在样品加载器302tt内。样品加载器302横向移动跨越表面106。当其移动时，通过毛细管作tt用将液体样品304加载至反应位点104。tt
如以上所述，根据各种实施方案的涂层可通过气相沉积方法来沉tt积。该过程的一个实例如下：tt
1.超声下将芯片在2-异丙醇中浸泡30秒tt
2.在v:v为5:1:1的水:氢氧化铵:过氧化氢溶液(源自过氧化氢和氢氧tt化铵的30％储备液)中于60℃超声处理10min。tt
3.在v:v为4:1的水:硝酸溶液(源自硝酸的70％储备液)中于60℃超tt声处理10min。tt
4.干燥tt
5.六甲基二硅氮烷(HMDS)的气相沉积tt
应认识到，根据本文描述的各种实施方案的其他合适的涂层为：烷tt基-三甲氧基硅烷、烷基-三乙氧基硅烷、烷基-二甲氧基单甲基硅烷、烷tt基-二乙氧基单甲基硅烷、烷基-单甲氧基二甲基硅烷或烷基-单乙氧基二tt甲基硅烷或者其他硅烷、硅氧烷、硅氮烷或在升高的温度于真空下为挥tt发性的膦酸酯。tt
还应认识到，根据本文描述的各种实施方案，也可采用使基底表面tt和反应位点表面产生轻微疏水性的包被材料以加载反应位点。根据各种tt实施方案，90-100度的水前进接触角和水后退接触角也足以加载反应位tt点。tt
亲水性/疏水性方法
根据本文描述的各种实施方案，以下为用于获得充分加载所需的特tt性的包被方法的实例。示例性方法如图4所示。tt
芯片的基底表面第一步骤：疏水性硅烷(C1)
方法包括：在基底表面106(图1)上产生疏水层的步骤402。参照图tt5，步骤402显示了通过使水化的基底表面与反应性三烷氧基硅烷进行反tt应，将碳氢化合物层添加至基底表面106。通过选择合适的烃链作为反应tt性三烷氧基硅烷的第四官能团，可以微调106表面特性。tt
基底表面106的表面特性对于将样品加载至反应位点104的一致tt性，以及对于在加载至反应位点104后防止样品在基底表面106上聚集/tttttt残留很关键。样品的聚集可导致在生物反应循环期间邻近反应位点之间tt的串扰，也可导致随后的假阳性结果。根据各种实施方案，例如可通过tt烃链长度、硅烷的第四官能团来改变表面特性以微调表面特性。tt
在一个实施方案中，如图5所示，基底的基底表面106被暴露于溶tt解于非极性溶剂如庚烷中的三烷氧基硅烷(所述烃链可为C4-C20)反应且tt与之反应。然后，在将基底浸没于硅烷溶液之前，向反应位点中加注稀tt释的酸水溶液，其保护各自的表面免于与溶解在和水不混溶的庚烷中的tt硅烷反应。烷氧基硅烷和水化表面之间的反应持续进行给定时间。通过tt在酸性溶液和空气中水解来完成这些反应。根据各种实施方案，在反应tt完成后，通过用各种溶剂如乙腈、异丙醇和庚烷洗涤以去除水，并准备tt所述表面以用于所述方法的下一步骤。tt
反应位点表面第一步骤：功能化的硅烷(C2)
如图5所示，在使基底表面具有疏水性(图4的步骤402)后，步骤404tt包括用基本上连续的膜包被反应位点的垂直表面使其具有亲水性的方tt法。以这种方式，包含生物化学物质的所述样品体积可更容易地被加载tt至每个期望的反应位点。tt
在该实例中，S1表示溶剂1(疏水性的)且S2表示溶剂2(亲水性的)。tt此处，S1和S2为不相混溶的溶剂，其中S1不接触被S2湿润的区域。ttC1表示溶解于S1中的烷氧基硅烷。C1可与存在于基底表面106上的-OHtt基团反应。如图5所示的反应使得基底表面106具有疏水性。S2的存在tt能防止S1和烷氧基硅烷接触反应位点104的垂直表面，维持其亲水性。tt
可通过纵横比和施用于芯片表面的涂层类型来控制和强化反应期间tt反应位点内的加载和保留样品。此外，一些芯片基底可能会泄漏离子或tt具有与(生物)化学样品的物理相互作用，可能需要基本上连续的涂层。基tt本上连续的涂层是不允许离子泄漏至试剂媒介中的涂层。tt
在一个实例中，基本上连续的涂层可采用双功能化的硅烷(烷氧基和tt环氧基)来实现，其烷氧基结合至水化的基底，而环氧基可使得其随后能tt与亲水性聚合物反应。tt
该步骤的一个实施方案如图6中所示。如在图5中完成的，所述基tt底的基底表面已经覆盖了C4-C20功能化硅烷。(烷氧基)3-Si-环氧丙基或tt氨基功能化的硅烷也可能与基底表面106上未反应的-OH基反应。tt
更具体地，在图6所示的实例中，C2表示溶解于S1中的氨基功能tt化硅烷的(烷氧基)3环氧丙基，且可与反应位点104表面上存在的-OH基tt反应。换句话说，所述反应位点水化的壁可能与溶解于庚烷中的用环氧tt丙基功能化的三烷氧基硅烷溶液反应。tt
反应位点104表面的反应使得反应位点104表面具有一些亲水性，tt并为所述方法的接下来的步骤提供功能基团，以便用保护性的连续层覆tt盖水平壁。换句话说，通过连接至水化表面的硅烷，所述环氧丙基可附tt着至反应位点壁，并可允许进行进一步的化学过程来微调反应位点的涂tt层，以使得能够进行应用，例如dPCR。tt
反应位点表面第二步骤：功能化聚合物的附着(C3)
步骤404后，进行步骤406，如图7所示，通过亲水性聚合物的附着tt以产生反应位点表面的亲水涂层。tt
当芯片以接近1的纵横比使用时，包被步骤406很重要，基底可能tt泄露离子或与生物样品/反应具有其他相互作用，可能导致样品的抑制作tt用、中毒以及结果误差或不准确。如以上所述，根据各种实施方案，包tt被芯片的目的是实现以基本上连续的疏水性膜覆盖基底表面106，这将允tt许反应期间的更好的样品加载和保留以及反应中的非干扰。在一些实施tt方案中，可在热循环期间反应。在一些实施方案中，接着，可将在此前tt步骤中使得可接近的所述环氧丙基与具有或没有反应后交联的各种分子tt量的聚乙二醇、聚乙烯醇或聚丙烯醇反应。tt
图7显示了一个实施方案。在图6中的环氧丙基加至反应位点表面tt以后，所述环氧丙基被进一步修饰。根据各种实施方案，存在两种可能tt途径。tt
在第一种可能的途径中，在作为催化剂的碱存在下，环氧丙基与各tt种分子量的聚乙二醇反应。将表示为C3的各种分子量的双-环氧丙基功tt能化的聚环氧乙烷和/或聚环氧丙烷(PEO或PPO)溶解于溶剂S3中。因tttttt此，所述环氧丙基环打开并与聚乙二醇-OH反应。接下来，添加并与双-tt环氧丙基功能化的聚乙二醇和/或聚丙二醇反应，且随后在多胺存在下交tt联而产生具有可调节的亲水性的连续膜。tt
在第二种可能的途径中，所述环氧丙基被水解。然后，-OH与双-环tt氧丙基功能化的聚乙二醇和/或聚丙二醇反应。此后为随后在多胺存在下tt的交联。在一个实施方案中，通过在空气和烘箱中于给定温度(室温至tt120℃)固化给定的时长来完成该反应。tt
基底表面第二步骤：疏水性硅烷(C1)
如以上所述，在图4的步骤402中用疏水层覆盖基底表面106。然而，tt可能的是可能存在表面的未包被/未反应部分，其可能在图4随后的包被tt步骤404和406中反应。这可导致基底表面106的涂层的疏水性变化，tt其转而可导致加载时样品在基底表面106上聚集。这会导致样品体积在tt反应位点之间桥连以及错误的结果。为纠正这一点，在一些实施方案中，tt可采用C4-C20烃功能化的三烷氧基硅烷重复包被基底表面的疏水性涂tt层(步骤402)，以便微调并使基底表面106的疏水性涂层均质化。tt
接下来在步骤408中，可微调基底的疏水性基底表面。在此前包被tt反应位点104的壁的步骤中，基底表面的涂层上可能发生了一些不期望tt的反应。如此，在这个步骤中，可调节基底表面上的疏水性涂层。tt
参照图8，S1表示溶剂1(疏水性的)，且S2表示溶剂2(亲水性的)。ttS1和S2为不相混溶的溶剂，其中S1不接触被S2湿润的区域。在步骤tt404中，参照图6，一些C2可能已经结合至基底表面106而降低所需/必tt需的疏水性。在一些实施方案中，可再次实施另外的步骤如步骤402以tt微调基底表面106的疏水性。这可能是获得精确的dPCR所必需的。反tt应位点104内存在的S2防止S1和烷氧基硅烷接触反应位点104的表面，tt维持其亲水性。tt
步骤408可有助于基底表面疏水性和垂直表面亲水性之间实现正确tt的平衡，以及与基底的物理几何形状考虑如反应位点间距和基底厚度的tt平衡。这在使得用待评估/研究的生物样品加载反应器保持均匀和一致上tt很重要。tt
以下为可用于实施本公开的实施方案的一系列化学制品：tt
·类型一：硅衍生物，其允许与具有“水化的”SiO2的任何基底形成tt化学键，且随后与类型二的化学品形成化学键tt
·类型二：各种(分子量和组成)环氧聚合物，以使得类型一的化学品tt能够交联或与类型一的化学品交联tt
·丁基、己基、辛基、癸基、十二烷基、十六烷基三甲氧基硅烷；同tt样的C4-C16烃三乙氧基硅烷；相同Cx的全氟化衍生物tt
·氨丙基三甲氧基和/或三乙氧基硅烷；其他氨基Cx三甲氧基和/或tt三乙氧基硅烷tt
·环氧丙基丙基二甲氧基甲基硅烷；环氧丙基丙基三甲氧基和/或三tt乙氧基硅烷；其他环氧丙基Cx三甲氧基和/或三乙氧基硅烷tt
·氢氧化钠溶液、盐酸溶液、次氯酸钠溶液tt
·疏水性和亲水性溶剂(戊烷、己烷、庚烷、乙腈、异丙醇、乙醇、tt甲醇、水、酮类等)tt
·双环氧丙基单体和/或聚合物(聚环氧乙烷(任何分子量)功能化的双tt环氧丙基、聚环氧丙烷(任何分子量)功能化的双环氧丙基、聚乙烯醇功能tt化的双环氧丙基、小分子量Cx烃功能化的双环氧丙基、二异氰酸酯化合tt物tt
·用作催化剂和交联剂的胺类、多胺类、醇类、多元醇类tt
如以上所述，根据本文描述的各种实施方案，在包被所述芯片之前tt可对其进行清洁。可采用各种清洁方案。例如，示例性清洁方案如下：tt
1.在IPA中洗涤1x2min；lx220kHz；1x170kHztt
2.在ACN中洗涤1x2min；lx220kHz；1x170kHztt
3.在DIW中洗涤4xlmin；2x220kHz；2x170kHztt
4.在15％HNO3中30min，于220kHz下声处理15min并于170kHztt下声处理15mintt
5.在0.14％硝酸中1x2min，于170kHz下声处理lx并于220kHz下tt声处理lxtt
应认识到，包被步骤402可通过各种方案来实施。tt
例如，根据本公开的实施方案，给出了以下的清洁方案：tt
1.在庚烷中的1.5％正癸基三甲氧基硅烷(C10-硅烷)中45min(基底tt表面；封闭的垂直表面)tt
2.在0.14％硝酸中15mintt
3.于室温在空气中30mintt
4.在IPA中2x2min，于220kHz下声处理，100％功率tt
5.在庚烷中2x2min，于220kHz下声处理，100％功率tt
6.在庚烷中的2％的3环氧丙基氧丙基三甲氧基硅烷中30min(所有tt表面)；开始时于220kHz下声处理5mintt
7.在ACN中2x1min，于220kHz下声处理tt
应认识到，包被步骤404和406可通过各种方案来实施。然而，根tt据本公开的实施方案，作为实例给出了以下方案：tt
1.在ACN中的2％PEG 8k和0.1％TPA中90min，于220kHz下声tt处理5min，100％功率tt
2.室温于空气中30mintt
3.92℃于烘箱中90mintt
4.在DIW中1x2min，于170kHz下声处理，100％功率tt
5.在IPA中1x2min，于170kHz下声处理，100％功率tt
6.在庚烷中1x2min，于170kHz下声处理tt
7.在IPA中1x2min，于170kHz下声处理，100％功率tt
8.在乙腈(ACN)中1x2min，于170kHz下声处理，100％功率tt
9.在DIW中2x1min，于220kHz下声处理tt
10.在DIW中2x1min，于170kHz下声处理tt
11.在空气中15mintt
12.用空气吹干tt
13.92℃于烘箱中30mintt
14.在庚烷中的2％的3环氧丙基氧丙基三甲氧基硅烷中反应tt30min；开始时于220kHz声处理5mintt
15.在ACN中2x1min，于220kHz和170kHz下声处理lxtt
16.在ACN中的2％Jeff Amine 5k和0.1％TPA中反应90min,于tt220kHz下声处理5min，100％功率tt
17.室温于空气中干燥15mintt
18.92℃于烘箱中反应/干燥90mintt
19.在IPA中1x2min，于170kHz下声处理tt
20.在庚烷中1x2min，于170kHz下声处理tt
21.在IPA中1x2min，于170kHz下声处理tt
22.在乙腈(ACN)中1x2min，于170kHz下声处理，100％功率tt
23.在DIW中洗涤2xlmin，于170kHz声处理tt
24.0.5％漂白剂(5ml Clorox+95ml DIW)中lx2min；于170kHz下声tt处理tt
25.在DIW中4x1min，于170kHz下声处理2x，并于220kHz下声tt处理2xtt
26.在空气中15mintt
27.用空气吹干tt
28.92℃于烘箱中干燥30mintt
29.真空包装tt
根据本文描述的实施方案，进行包被的方案的另一实例描述于下tt文。以下方法可用于高纵横比芯片和低纵横比芯片。对于高纵横比芯片，tt毛细管力在加载过程中为更突出的因素。tt
1.清洁；Mikroglas阵列；tt
2.在IPA中洗涤2x2min；lx220kHz；1x170kHztt
3.在ACN中洗涤2x2min；lx220kHz；1x170kHztt
4.在DIW中洗涤4x2min；2x220kHz；2x170kHztt
5.在15％HNO3中30min，于220kHz下声处理15min，并于170kHztt下声处理15mintt
6.在0.14％硝酸中1x 2min，于170kHz下声处理lx，并于220kHztt下声处理lxtt
7.在DIW中4x 1min，于170kHz下声处理2x，并于220kHz下声tt处理2xtt
8.在IPA中2x 2min，于220kHz下声处理，100％功率tt
9.在庚烷中2x 2min，于220kHz下声处理lx，并于170kHz下声处tt理lxtt
根据本文描述的各种实施方案的包被方法也可满足所需的处理要tt求。例如，如果用于生物反应的基底是被大量客户使用的那种，根据各tt种实施方案的包被方法是可重复的，其能满足成本需求并可扩展以满足tt对所述基底使用的要求。tt
如上所述，根据各种实施方案，可使用的仪器为，但不限于聚合酶tt链式反应(PCR)仪。图9的方框图显示了可用于实施本文教导的实施方案tt的PCR仪900。PCR仪900可包括加热的盖子910，其覆盖在容纳于样tt品支架装置(未示出)中的多个样品912上。在各种实施方案中，样品支架tt装置可为具有多个样品区的玻璃或塑料滑片，所述样品区在样品区和加tt热的盖子910之间具有盖。样品支架装置的一些实例可包括但不限于，tt多孔板如标准微量滴定的96孔、384孔板、如图1所示的芯片或缩微卡tt或基本上平面的支架如玻璃或塑料滑片。在样品支架装置的各种实施方tt案中所述样品区可包括凹陷、凹口、脊和它们的组合，在基底表面上形tt成规则或不规则阵列图案。PCR仪的各种实施方案包括样品区块914、tt用于加热和冷却的元件916、热交换器918、控制系统920和用户界面922。tt根据本文教导的热区块组件的各种实施方案包括图9的PCR仪900的部tt件914-918。tt
对于图9中的PCR仪900的实施方案，可使用控制系统920来控制tt检测系统、加热的盖子和热区块组件的功能。控制系统920可通过图9tt中的PCR仪900的用户界面922连接至终端用户。同样，如图1所示的tt计算机系统100可用于提供对图9中的PCR仪900的功能和用户界面功tt能的控制。此外，计算机系统可提供数据处理、显示和报告制作功能。tt所有这些仪器控制功能均可局部地专用于PCR仪，或者计算机系统可提tt供部分或所有的控制、分析和报告功能的远程控制。tt
为了说明和描述的目的，提供了本教导以下不同实施的描述。其为tt非穷举性的且并不将本教导限制在公开的具体形式。基于以上教导可进tt行修饰和改变，或者通过对本教导的实施可获得修饰和改变。此外，描tttttt述的实施包括软件，但本教导可结合硬件和软件实施或者仅在硬件中实tt施。本教导可以面向对象的和非面向对象的程序系统实施。tt
用于涉及本文件描述的各种实施方案的方法的示例性系统包括以下tt美国临时专利申请中所描述的那些：tt
·美国临时申请第61/612,087号，递交于2012年3月16日；和tt
·美国临时申请第61/723,759号，递交于2012年11月7日；和tt
·美国临时申请第61/612,005号，递交于2012年3月16日；和tt
·美国临时申请第61/612,008号，递交于2012年3月16日；和tt
·美国临时申请第61/723,658号，递交于2012年11月7日；和tt
·美国临时申请第61/723,738号，递交于2012年11月7日；和tt
·美国临时申请第61/659,029号，递交于2012年6月13日；和tt
·美国临时申请第61/723,710号，递交于2012年11月7日；和tt
·美国临时申请第61/774,499号，递交于2013年3月7日；和tt
·生命技术公司(Life Technologies)案件编号LT00655 PCT，递交于tt2013年3月15日；和tt
·生命技术公司案件编号LT00656 PCT，递交于2013年3月15日；tt和tt
·生命技术公司案件编号LT00657 PCT，递交于2013年3月15日；tt和tt
·生命技术公司案件编号LT00668 PCT，递交于2013年3月15日；tt和tt
·生命技术公司案件编号LT00699 PCT，递交于2013年3月15日。tt
所有这些申请也通过引用整体并入本文。tt
尽管针对某些示例性实施方案、实例和应用描述了各种实施方案，tt对本领域技术人员来说显而易见的是，可在不背离本文教导下进行各种tt修饰和改变。tt
