改善的细菌膜蛋白分泌
本申请是2010年11月15日提交的题为“改善的细菌膜蛋白分泌”的ttPCT/US2010/056680号发明专利申请的分案申请，原申请进入中国国家阶tt段获得的国家申请号为201080052575.8。tt
背景技术tt
优先权申请
本申请要求于2009年11月17日提交的美国申请No.61/261,768的优tt先权，将该专利以引用的方式全文并入本文。tt
技术领域t
本发明涉及使蛋白质分泌穿过细菌质膜的改良方法，该方法包括将丝tt状噬菌体外壳蛋白用于展示外源蛋白质包括可以为单体的、二聚体的或异tt型二聚体的或多聚体的蛋白质(包括完整抗体或抗体片段，或其他二硫键tt链接的多聚体构建体)的变体的文库，该方法通过将突变型pelB或突变型ttompA分泌信号与所述外源蛋白(exoprotein)构建体连接来实现。tt
关于本领域的讨论
丝状噬菌体展示是一种广泛使用的基于亲和力选择蛋白质的技术，因tt为在选择过程中每个噬菌体颗粒将编码多肽的核酸与其外壳蛋白的N端融tt合连接在一起。M13噬菌体编码五种外壳蛋白，在噬菌体的一端具有大概tt五个拷贝的次要外壳蛋白pIII和pVI，在噬菌体的另一端具有相同数目的ttpVII和pIX。噬菌体DNA由大概3000个拷贝的主要外壳蛋白pVIII包tt封。尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而pIII和ttpVIII仍是目前最常用的融合伙伴。使用该技术，已构建了肽、Fab、scFvtt和其他蛋白结合物(protein binder)的文库并且可用于各种应用，具有极大商tt业价值。tt
由于pIII外壳蛋白的长度和构象其较于其他蛋白质更受欢迎。pIII次tt要外壳蛋白是负责噬菌体感染进大肠杆菌中的402个氨基酸、42kD的蛋白tt质，其包括由柔性铰链连接的两个结构域。与pIII N端融合可系住离开噬tt菌体颗粒的所展示的蛋白质，从而减少了其干扰所需的pIII功能的能力并tt且进一步使配体能足够接近进行结合。相比之下，pVII和pIX是分别为33tt个和32个氨基酸的短螺旋蛋白质，在噬菌体表面紧密包装。然而，有报道tttttt描述了scFv文库在pIX上的展示(Gao,C.等人，Proc Natl Acad Sci U S A tt99,12612-12616,2002)和通过利用使不同多肽与pVII和紧密相邻的pIXtt二者融合的能力对Fv或Fab文库进行异型二聚体展示(Gao等人，1999ttProc Nat Acad Sci 96:6025-6030和Janda US7078166)。展示pVII融合物tt的噬菌体也已有报道(Kwasnikowski等人，2005.J Immunol Methodstt307:135)。使用杂交噬菌体载体或噬菌粒载体，可在噬菌体上展示与pIXtt外壳蛋白融合的肽、Fab和其他蛋白质(WO2009/085462、ttWO2009/085464和WO2009/085468)。也已描述了一种备选的方法，在该tt方法中由噬菌体或噬菌粒载体编码的外源蛋白(exoprotein)不与外壳蛋白融tt合，而是通过二硫键键合共价连接至重新工程改造的外壳蛋白pIII和pIXtt(US6753136)。tt
大肠杆菌为最广泛用于产生重组蛋白质的宿主之一。然而，在回收正tt确折叠的蛋白质的大部分产量方面往往存在问题。解决这些问题的一种方tt法是使重组蛋白质分泌进周质空间或培养基中。分泌制备重组蛋白质具有tt若干优点，如简化纯化、避免蛋白酶攻击和N端Met延长，以及蛋白质正tt确折叠的几率更好。tt
在噬菌体蛋白质的DNA复制和表达后，M13和其他丝状噬菌体在宿tt主细胞膜处装配。噬菌体结构蛋白转运进膜内中是噬菌体装配的关键步tt骤。在噬菌体展示的实践中，已将细菌信号肽广泛用于构建体中来帮助融tt合蛋白转运穿过膜，并且已经是实现某些类型的融合蛋白的展示所关键tt的。来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erswinia carotovora)的果胶裂解酶B(pelB)tt的信号肽已广泛用于增强使用细菌细胞产生蛋白质以及增强在噬菌体展示tt中产生蛋白质二者。tt
利用细菌宿主细胞以及以重组文库形式，通过细菌培养或在噬菌体颗tt粒表面上展示更多样和复杂的蛋白质如二聚体蛋白质的能力在能够进行对tt经修饰的和重新工程改造的复杂蛋白质结构进行选择方面是有利的。一直tt需要推进现有技术来产生高度有效的蛋白质制备方法以及筛选复杂蛋白质tt的变体的高通量方法，所述复杂蛋白质的变体为例如人IgG的变体，人ttIgG为通过分子间的二硫键连接的重链和轻链对(异型二聚体)的同型二tt聚体。tt
发明内容tt
本发明提供了用于外源蛋白质在细菌质膜中(例如在于细菌宿主中装tt配的噬菌体颗粒上)表达、转运和装配的改良方法，该方法通过掺入与编tt码期望表达和/或展示的肽或多肽序列的氨基酸序列的核酸有效融合的编码tt突变型peIB信号序列的核酸来实现，该突变型pelB信号具有序列ttMKYLLSTAAAGLLLLAAQPAMA，为(SEQ ID NO:1)的P6S变体。在本tt发明的一个方面，编码突变型pelB信号的序列可以是其中位置16的碱基tt为胸腺嘧啶核苷的突变型SEQ ID NO:2。在本发明的另一个实施例中，所tt编码的分泌信号为具有序列MKKTAIAIAVPLAGFATVAQA的突变型ttompA，其为野生型序列的A11P变体(SEQ ID NO:3)。在一个方面，编码tt突变型ompA分泌信号的序列可以是其中位置31处的碱基为胞嘧啶核苷的tt突变型SEQ ID NO:4。在本发明的方法中，将SEQ ID NO:1的分泌信号ttP6S用于增强蛋白质在细菌细胞培养物中的转运。tt
本发明提供了用于蛋白质在噬菌体颗粒上多价展示的改良方法以及在tt噬菌体颗粒上展示与噬菌体外壳蛋白融合的二聚体或多聚体蛋白质的手tt段。在一个实施例中，多价展示为与噬菌体pVII或pIX次要外壳蛋白的Ntt端融合的外源蛋白的多价展示。本发明还涵盖两种不同的外源蛋白在噬菌tt体颗粒上的同时表达和展示，其中第一蛋白与pVII融合而第二蛋白与pIXtt融合，这通过将编码分泌信号pelB的P6S变体(SEQ ID NO:1)的序列与ttpIX或pVII融合蛋白(其为噬菌体或噬菌粒载体)的外源蛋白编码区融合tt来实现。在一个方面，与pVII或pIX融合的多肽可形成链间联合以在噬菌tt体上形成更高级结构，如二聚体或多聚体的pVII连接的蛋白质或者二聚体tt或多聚体的pIX连接的蛋白质，或者其中一个或多个外源蛋白与一个噬菌tt体外壳蛋白融合且相同或不同外源蛋白与不同的噬菌体外壳蛋白融合的二tt聚体或多聚体结构。多聚体蛋白质可在与噬菌体外壳蛋白融合的多肽链之tt间形成二硫键，或通过与独立编码和表达的外源蛋白联合而形成更复杂的tt结构。在二硫键键合的二聚体结构的一个例子中，所形成的蛋白质包含具tt有链间二硫键和链内二硫键键合的结构域的抗体Fc结构域，该抗体Fc结tt构域能与Fc受体、蛋白A或补体因子C1q结合。在一个方面，由与多肽tt链融合的外壳蛋白形成的蛋白质结构还与抗体轻链联合以形成全长IgG分tttttt子。在另一个实施例中，两条不同的多肽展示为pVII和pIX融合物，其中tt所述多肽可在丝状噬菌体上形成非共价或共价性质的链间联合(association)tt以形成二聚体或多聚体蛋白质结构。tt
本发明提供了表达与选自pIII、pVII、pVIII或pIX的外壳蛋白融合的tt外源蛋白的噬菌体在培养物中增加的生长，这通过掺入与所述外源蛋白编tt码区融合的选自SEQ ID NO:2和4的分泌信号编码区或编码SEQ ID NO:1tt或3的肽的序列来实现。tt
本发明提供了一种可复制载体，其编码至少一种融合蛋白，具有与编tt码选自pIII、pVII、pVIII或pIX的噬菌体外壳蛋白的序列融合的编码外源tt多肽的核酸序列，其中编码SEQ ID NO:1的P6S变体或SEQ ID NO:3的ttA10P变体的分泌信号编码序列与所述外源蛋白编码序列融合。在本发明tt的一个实施例中，编码所述蛋白噬菌体外壳蛋白融合物的载体包括在编码tt可被配体或抗体识别的蛋白质标签、蛋白酶裂解位点或带静电区或能够进tt行化学缀合的区域(如赖氨酸残基)的蛋白质之间插入的另外的序列。在tt一个方面，所述另外的序列为HA序列(SEQ ID NO:5)、Flag(SEQ ID NO:tt6)区或六组氨酸(His6,SEQ ID NO:7)。tt
在使用本发明的分泌信号的另一个方面，将分泌信号用于构建噬菌体tt或噬菌粒载体，其中在外源蛋白编码序列中具有多样化区(variegated ttregion)，以用于展示变体蛋白质的文库。在一个优选的实施例中，融合蛋tt白的外源蛋白部分为抗体或其片段，并且如此形成的文库为抗体或抗体片tt段(如scFv或Fab)文库。在本发明的一个方面，将变体分泌信号用于成tt同型二聚体的多肽链(如Fc融合蛋白)的构建体文库。在另一个实施例tt中，同型二聚体结构可进一步与异型多肽相连以形成更复杂的结构。在一tt个方面，抗体重链多肽和轻链多肽二者在单个噬菌体分子中的展示会导致tt功能性抗体分子在噬菌体颗粒表面装配，例如但不限于完整的IgG分子。tt包括在本发明中的是含有可复制载体和能够在其表面展示融合多肽为二硫tt键连接的二聚体蛋白质的噬菌体颗粒的宿主细胞。如此产生的文库可展示tt可用于组装、筛选以及诸如本领域实施用于抗体组合物的选择和改善之类tt的其他讯问性技术(interrogative technique)的从头文库。tt
附图说明tt
图1A-B为用于表达pVII融合蛋白的克隆盒的图示(A)和用于pVII和ttpIX融合蛋白的双表达的克隆盒的示意图(B)。tt
图2A-E示出了关于抗体与展示HA(A)、FLAG(B)、His-6(C)的噬菌tt体的特异性结合，以及关于可溶性二聚体EGFR-Ig构建体与展示PHPEPtt190(D)的噬菌体的特异性结合和链霉亲和素与展示PHPEP 97(E)的噬菌体tt的特异性结合的噬菌体ELISA的结果；其中M13KE噬菌体用作阴性对tt照。tt
图3示出了与用杂交载体(用于展示与pIX相连的HA)衍生的噬菌tt体上的展示相比较的在源自HA-pVII噬菌体载体(图1A)的噬菌体上的ttELISA的结果，其中抗HA抗体用于特异性检测，抗flag抗体用作实验的tt对照抗体。tt
图4示出了HA肽在源于具有pelB信号序列的pVII噬菌体载体(pelB-ttHa-pVII)或不具有pelB信号序列的pVII噬菌体载体(HA-pVII)的噬菌体上tt的展示。抗flag抗体在该实验中用作对照抗体。tt
图5示出了用于本研究的信号肽的序列，并且在后面具有正常噬菌斑tt大小和高生长滴度的世代中的重组噬菌体中确定了引起各表达的序列中的tt单氨基酸改变的突变的位置：pelB的位置6上Pro突变为Ser(A)以及ttompA的位置11上的Ala突变为Pro(B)。tt
图6A–B为从在LB中培养的细菌培养物分泌的碱性磷酸酶(AP)的活tt性(A)或保留在细菌沉淀中的碱性磷酸酶(AP)的活性(B)的测定法，其中四tt条序列中的一者被与编码序列融合：野生型信号序列pelB(p3915)、ompAtt(p3913)，和M13基因III(p3912)以及突变的pelB(p3916)和ompAtt(p3914)。用AP底物测量了LB培养基中分泌的AP和细胞溶解物中表达的tt总AP并用细胞密度进行了归一化。tt
图7示出评估HA和FLAG肽在同一噬菌体颗粒的pVII和pIX上的双tt展示的噬菌体ELISA结果：用抗FLAG抗体和抗HA抗体测试了六个ttFLAG-pVII-HA-pIX噬菌体克隆的结合密度，HA-pVII、FLAG-pVII和ttM13KE噬菌体用作对照。tt
图8示出了六个时间点处的滴度，指示在连续的多轮传代过程中(G0tt–G10代)单个克隆生长速率的改善，其中发现了突变型ompA信号。tt
图9示出了构建用于表达全长人IgG的噬菌粒载体的示意图，该载体tt将与重链连接的P6S pelB变体用作分泌信号，并且其中重链C端通过接头tt与pIX外壳蛋白融合，与ompA分泌信号融合的轻链作为游离多肽表达。tt
图10A-D为示出了ELISA方法中产生的关于使用多种对噬菌体上表tt达的抗体结构域、表达的EMP-1-Fc构建体或噬菌体本身具有特异性的配tt体，从所指明的制备物捕集的噬菌体的信号的柱状图：(A)抗Fd(CH1)抗tt体捕集；(B)抗k抗体；(C)抗CH2抗体；和(D)抗CH3抗体。将噬菌体上tt的6-2Fab pIX和噬菌体上的非免疫球蛋白包括在内作为阴性对照。tt
图11为柱状图，示出了使用商购的抗IL 13抗体以及在存在或不存在tt竞争性可溶性抗IL 13单克隆抗体(与抗IL13IgG pIX具有相同的特异tt性)的条件下(方格状柱条)，ELISA方法中产生的关于从所指明的制备tt物捕集的噬菌体的信号。EMP-1-Fc构建体为不结合IL13的阴性对照，将tt噬菌体上IL13特异性的6-2Fab pIX包括在内作为阳性对照。tt
图12A-B为示出了ELISA方法中产生的关于板中由商购抗IL 13抗体tt捕集的噬菌体的信号的柱状图，其中在添加IL 13抗体后添加渐增量的噬tt菌体上的竞争性抗IL13抗体(6-2全长IgG)或对IL13无特异性的对照抗tt体(抗EMMPRIN)(A)以及板中由商购抗IL13抗体捕集的IL13的信号的tt柱状图，其中在添加商购的抗IL13抗体后，添加噬菌体上的6-2Fab。添tt加了渐增量的抗IL13单克隆抗体或抗EMMPRIN单克隆抗体(B)。tt
图13示出了在将生物素化IL13或IL17A抗原用于捕集展示IL13或ttIL17A的全长IgG构建体后以及在存在或不存在竞争性可溶性抗IL13单克tt隆抗体或抗IL17A单克隆抗体的情况下，来自由结构域特异性抗体抗Fd、tt抗k、抗CH2和抗CH3任一者捕集的噬菌体的信号。用抗M13抗体(ytt轴)检测噬菌体。tt
序列表简述tt
具体实施方式tt
缩写
ADCC＝抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADMC＝抗体依赖性单核细tt胞介导的细胞毒性，c1q＝补体因子1q，EPO＝重组促红细胞生成素，FcRtt＝Fc受体；Ig＝免疫球蛋白；Hc＝重链；Lc＝轻链；IPTG＝异丙基硫代-β-tt半乳糖苷；ompA＝编码大肠杆菌外膜蛋白A的基因；pelB＝编码胡萝卜软tt腐欧文氏菌的果胶裂解酶基因的基因tt
定义
如本文所用，除非另外指明或根据上下文显而易见，否则抗体结构tt域、区域和片段与本领域众所周知的标准定义一致。本发明的蛋白质源自tt一种或多种免疫球蛋白类型的抗体的部分或包含一种或多种免疫球蛋白类tt型的抗体的部分。免疫球蛋白类型包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种tt型，在IgG和IgA的情形中，包括它们的亚型，如IgG1、IgG2、IgG3和ttIgG4。tt
所谓“顺反子”其意指DNA分子中编码氨基酸序列的核苷酸序列并tt且包括上游和下游DNA表达控制元件。tt
所谓“外源多肽”或“外源蛋白质”或“外源蛋白”其意指不是由野tt生型丝状噬菌体基因组正常编码的蛋白质，而是对正常噬菌体蛋白质来说tt是外来的。典型的外源多肽是所关注的任何多肽，包括抗体免疫球蛋白重tt链(Hc)结构域或免疫球蛋白轻链(Lc)结构域、免疫球蛋白重链可变结构域tt(VH)、免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)、天然的或合成的多肽、单链抗体tt(scFv)或免疫球蛋白结构域的序列或组合，例如它们特别是作为可包括ttCH3、CH2、铰链区域和/或CH1结构域或它们的片段的Fc结构域天然出tt现。tt
所谓“Fc”(给予木瓜蛋白酶消化的IgG的可结晶裂解片段的标签)tt其意指抗体的功能性片段，该片段包含源自抗体恒定结构域的多肽链且具tt有链间的二硫键的二聚体结构。在人IgG1中，木瓜蛋白酶产生C端至ttCys226(用如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，tt第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.tt(1991)所述的EU索引进行编号，将该文献以引用的方式明确地并入本文)tt的片段。“如Kabat中所述的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。tt尽管Fc的N端残基的定义可能会不同，但其通常理解为包括Kabat编号系tt统中的至少残基223，其为第一个链间键合的半胱氨酸N端的第三个残基tt(Kabat系统中的C226)。该分子的Fc部分不直接涉及抗体与其特异性靶tt抗原接触，但介导效应物功能。这些功能具有两种类型：(1)要求抗体与抗tt原结合的功能，如C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性或IgG的ttFc受体γ型结合、IgE的Fc受体ε结合、IgA的Fc受体α结合后的ADCCtt和ADMC；以及(2)不依赖于抗原结合的功能，如通过结合FCRn和胞转穿tt过细胞和组织屏障(如肠)的能力保持在循环中。特别是通过Fc的融合显tt著增加抗体分子或其他分子的血清半衰期的能力是高度有利的。存活更长tt的分子可减少临床治疗中所需的量，从而减少施用的频率。tt
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。FcRtt包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类，包括这些受体的等位基因变体以及这tt些受体的选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)tt和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有主要在它们的胞质结构域不同tt的相似氨基酸序列。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有免疫受体tt酪氨酸活化基序(FAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有免疫tt受体酪氨酸抑制基序(参见Annu.Rev.Immunol.,1997,15:203-234tt中的综述；Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,1991,9:457-92；Capel等tt人，Immunomethods,1994,4:25-34；以及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.,tt1995,126:330-41中对FcRs进行了综述，将上述每一篇文献以引用的方式tt并入本文)。tt
所谓“融合多肽”或“融合蛋白”其意指包含分别由第一和第二核酸tt序列编码的第一和第二多肽的融合多肽(蛋白质)，这两条多肽是有效连tttttt接(融合)的。如本文所示例的，噬菌体颗粒上展示的融合蛋白为外源蛋tt白(对噬菌体蛋白组而言非天然的蛋白质)和噬菌体外壳蛋白的融合物。tt
术语“文库”表示所编码的蛋白质的集合，这些编码的蛋白质是变tt体，也就是说，其中某些区域相同或相似，而其他区域可有差别。变异区tt域可以是通过定向变异或随机变异(随机或非随机的改变)。文库或变体tt可就不同变体的数目或文库的“大小”来描述。可用的从头抗体文库具有tt高的多样性(>1010)，可进行改变，易于组建，并且具有低的不期望序列的tt背景。结合如下方法可加速文库组建并且可导致低的背景：(a)基于Kunkeltt的单链诱变；(b)具有限制性位点的回文环；以及(c)使用巨引物方法。tt
本文所使用的“二聚体蛋白质”或“多聚体蛋白质”指不止一条独立tt的多肽或蛋白质链，它们在体外或体内相互联合而形成单个球形蛋白质。tt该多聚体蛋白质可由不止一条相同类型的多肽组成以形成“同型二聚体”tt或“同型多聚体”。或者，该多聚体蛋白质也可由不止一条具有独特序列tt的多肽构成以形成“异型二聚体”或“异型多聚体”。因而，“异型多聚tt体”为包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其述第二多肽在氨基酸序列tt上与第一多肽有至少一个氨基酸残基的差别。异型多聚体可包含由第一和tt第二多肽形成的“异型二聚体”或者可形成其中存在超过两条多肽的更高tt级的四级结构。异型多聚体的示例性结构包括包括异型二聚体(如Fab、ttFc片段和双价抗体)、三聚体G蛋白、异型四聚体(如F(ab')2片段和ttIgG)以及还有寡聚体结构。tt
“噬菌粒”或“噬菌体载体”是含有源自噬菌体染色体和外源DNAtt(如来自质粒的那些)二者的组分的复制型克隆载体。因为噬菌粒含有噬tt菌体基因组的一部分，在用辅助噬菌体同时感染宿主时，其可包装成噬菌tt体颗粒。本发明的噬菌粒可包装成噬菌体M13颗粒。tt
术语“噬菌体颗粒的表面”指噬菌体颗粒的与该噬菌体颗粒包含于其tt中的介质接触的部分。噬菌体颗粒的表面由外壳蛋白装配来确定(噬菌体tt颗粒的蛋白质外壳的装配的成员)，外壳蛋白装配的内表面与含有噬菌体tt的核酸的区域交界，其中所述核酸在噬菌体制造过程中在合适的宿主细胞tt中复制。tt
所谓“噬菌体外壳蛋白”其意指形成天然存在的噬菌体的噬菌体外壳tt的那些蛋白质。在丝状噬菌体中，如f1、fd和M13，外壳蛋白为基因IIItt蛋白(pIII)、基因VI蛋白(pVI)、基因VII蛋白(pVII)、基因VIII蛋白(pVIII)tt和基因IX蛋白(pIX)。M13的外壳蛋白的序列以及丝状噬菌体的密切相关tt的成员之间的差异是本领域技术人员所熟知的(参见例如Kay,B.K.,ttWinter,J.&McCafferty,J.编辑，(1996).Phage display of peptides and proteins:tta laboratory manual.Academic Press,Inc.,San Diego)。tt
概述
在产生与噬菌体外壳蛋白形成的融合蛋白时，相对于噬菌体外壳蛋白tt外源蛋白分子可较大或具有不同的化学特性，对于pIX或pVII特别是如tt此，可能会干扰重组噬菌体颗粒的装配。为了避免装配干扰，往往使用噬tt菌粒系统，其中噬菌体颗粒在存在辅助噬菌体的情况下装配并因而既含有tt所表达的野生型蛋白又含有外源蛋白-外壳蛋白融合物。因为需要额外的步tt骤噬菌粒系统较为繁琐，并会导致展示外源蛋白的外壳蛋白的完全互补性tt低很多(如果有的话)。因为后一问题之故，噬菌粒展示系统通常视为是tt单价的。另一方面，将噬菌体载体系统用于实现多价展示往往会引起低滴tt度的噬菌体生长。tt
本发明是基于这样的发现：来自胡萝卜软腐欧文氏菌的果胶裂解酶Btt分泌信号(pelB)的编码序列中的单核苷酸突变即该序列的第六个残基的密tt码子的第一个碱基由C突变为T，导致所编码的信号(SEQ ID NO:1)中脯tt氨酸向丝氨酸改变，会引起若干蛋白(包括在M13噬菌体外壳蛋白上展示tt的蛋白质)从细菌宿主膜分泌的改善，据推测是通过改善肽和蛋白质向周tt质区的分泌来实现。其次，ompA分泌信号的突变(SEQ ID NO:3的A11Ptt变体)已显示可增强展示肽-外壳蛋白融合物的噬菌体的滴度。tt
使用P6S pelB变体分泌信号，申请人已经证实，利用噬菌粒系统，包tt括带大量正电荷的、带大量负电荷的或二硫键约束的肽在内的肽可成功地tt在pIX和pVII噬菌体外壳蛋白上展示，并且抗体片段以及更近些时候，二tt聚体抗体结构，包括全长IgG可成功地展示为pIX外壳蛋白的融合蛋白。tt此外，如本文所示例的，利用P6S pelB和ompA，使用本文所述的噬菌体tt载体各种不同的肽和小蛋白质结构域可多价展示为与pVII形成的融合物。tttttt使用本文描述的突变型pelB分泌信号(SEQ ID NO:1)进行了大的以及多聚tt体的蛋白质在pIX上的成功且有效的展示。本文所述的蛋白质在pVII和ttpIX上的同时多价展示采用了突变型的pelB分泌信号(SEQ ID NO:1)和ttompA分泌信号(SEQ ID NO:3)，然而，可将该pelB分泌信号或该ompA分tt泌信号与待多价展示的蛋白质以及噬菌体外壳蛋白融合物二者结合使用。tt
这些结果表明，包含所发现的变型pelB信号序列并简化用于利用噬菌tt粒载体或噬菌体载体来在pIX或pVII外壳蛋白上展示外源蛋白的系统可用tt于展示生化多样性肽和蛋白质。此外，利用该系统还可展示包含球形支架tt(scaffold)如纤连蛋白、肌联蛋白等的纤连蛋白结构域、蛋白A的Z结构tt域、锚蛋白重复、PDZ结构域、Knottin、CTLA-4胞外结构域的其他蛋tt白。单体的、二聚体的或多聚体的受体蛋白质如与生长因子结合的那些tt(如促红细胞生成素受体和包括heregulin在内的ERBB家族的受体)、神tt经递质受体(如γ-氨基丁酸)和其他有机或无机小分子受体(如盐皮质激tt素、糖皮质激素)是可用编码选自SEQ ID NO:1和3的突变型分泌信号的tt载体展示的外源蛋白的例子，所述分泌信号与多肽链(包含野生型、突变tt型或截短型受体多肽链)的编码序列连接。优选的异型二聚体受体为核激tt素受体(Belshaw等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93(10):4604-tt4607)、erbB3和erbB2受体复合物，以及G蛋白偶联受体(包括但不限tt于阿片受体(Gomes等人，(2000)J Neuroscience 20(22):RC110)；Jordantt等人(1999)Nature 399:697-700)、毒蕈碱受体、多巴胺受体、血清素受tt体、腺苷受体和GABAB家族的受体)。另外，使用随机化和多样化的标tt准技术，用于上述单体、二聚体或多聚体蛋白质的展示载体的构建可用作tt构建在噬菌体上展示的变体分子的文库的基础。这种文库可以是用于根据tt这些基序和支架探索蛋白质的重塑和重新工程改造的有用工具。tt
本发明的申请人已出乎意料地成功地在丝状噬菌体的表面将本文所述tt的抗体组分展示为与pIX或pVII外壳蛋白形成的融合蛋白，其作为二硫键tt连接的同型二聚体蛋白，显示出天然抗体的Fc结构域的至少一种已知生物tt活性，如Fc受体结合，并且当为二价抗原结合蛋白的形式时，能够与靶抗tt原特异性结合。表达与噬菌体蛋白质连接的大的多结构域蛋白质的能力此tttttt前还未报到，并且该能力据信只是或部分是由于在外源蛋白构建体中使用tt突变型peIB分泌信号。tt
实施本发明的方法
在丝状噬菌体颗粒上展示的融合蛋白中，外源多肽与丝状噬菌体外壳tt蛋白(并且特别是pVII或pIX蛋白)之间的“融合”可以是通过酰胺键直tt接连接，或者可包含连接多肽(即“接头”)。可使用多种接头中的任何tt一者，所述接头通常为一段长度为约5至50个氨基酸的序列。尤其优选的tt接头可在接头处给融合蛋白提供高度的活动性。缺乏二级结构的接头，如tt主要由甘氨酸(G,Gly)残基构成的那些，如具有G4S(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)tt重复或G3S(Gly-Gly-Gly-Ser)的那些(其中重复的数目通常为1至12)可tt用于该目的。tt
第一多肽为外源蛋白质，第二多肽为丝状噬菌体外壳蛋白如pVII或ttpIX蛋白，其中该外源蛋白质融合至该丝状噬菌体蛋白的氨基末端。另tt外，当融合蛋白为未成熟形式时，即其中引导序列还未被加工(移除)，tt融合蛋白可含有氨基末端的如本文所述的pelB或ompA的原核分泌信号变tt体。tt
如果期望表达抗体(免疫球蛋白)分子，则编码该免疫球蛋白的多核tt苷酸分子将包含：(1)第一顺反子，包含与编码重链的多核苷酸序列有效融tt合的翻译起始区和分泌信号和(2)第二顺反子，包含与编码轻链的多核苷酸tt序列有效融合的翻译起始区和分泌信号，其中在原核生物宿主细胞中表达tt该轻和重多肽链时，该轻链和重链折叠并装配而形成生物活性免疫球蛋tt白。在期望在噬菌体的表面表达抗体或抗体的能够稳定联合而形成二聚体tt或异型二聚体结构的至少一部分时，所述顺反子中的一者或二者将编码融tt合蛋白，所述融合蛋白包含与免疫球蛋白结构域融合的选自SEQ ID NO:1tt和3的本发明的突变型分泌信号，并且其与噬菌体外壳蛋白融合。tt
在天然抗体中，轻链多肽链和重链多肽链独立地编码和表达。IgG类tt分子的典型异型二聚体结构依赖于该分子的四条多肽链(两条重链和两条tt轻链)之间的正确装配和二硫键形成。因而，在本发明中，抗体的二聚Fctt部分的装配和/或轻链的联合(在存在时)重现了抗体形成的天然过程，其tt中蛋白质的各结构域自我联合并在二者间形成二硫键。tt
在一个实施例中，要在丝状噬菌体颗粒的表面上展示的含Fc蛋白质tt是天然的抗体，并且构建了用于Fc构建体-pIX融合蛋白或Fc构建体-pVIItt融合蛋白以及将会自己联合的独立编码和表达的抗体Lc或抗原结合结构tt域的表达的双顺反子载体。本发明的抗原结合蛋白可具有任何表位、抗原tt位点或蛋白质的结合位点。优选的抗原结合蛋白可通过直接与受体结合或tt通过与它们的同源配体的结合和中和，来中和受体蛋白质活化。一般来tt讲，抗原结合结构域将由与包含Fc结构域的天然抗体Hc序列融合的抗体ttLc和抗体Hc可变结构域形成。在另一个实施例中，外壳蛋白-融合蛋白包tt括与Fc结构域连接的scFv。在本发明的另一个方面，构成scFv的重链和tt轻链的抗原结合位点可有变化以提供两种不同的结合特异性，从而使在噬tt菌体表面展示的自装配的二硫键连接的构建体蛋白质为双特异性的二价分tt子。例如，替代IgG分子的VL和VH结构域的是具有不同特异性的scFv结tt构域，使得所得的分子能够同时结合两种不同的表位。产生具有多个可变tt结构域对的双特异性抗体分子的其他方法在US20020103345A1中有教导，tt这些双特异性抗体分子可用本发明的方法在噬菌体颗粒上展示，将该文献tt以引用的方式并入本文。tt
在一个实施例中，抗原结合或受体结合结构域不是源于抗体结构域而tt是与Fc结构域融合的已知的或随机的肽序列。申请人共同待审的申请ttWO04/002417、WO04/002424、WO 05/081687和WO05/032460描述了在tt本文中称为MIMETIBODYTM结构的结构，将这些专利申请的每一者以引用tt的方式全文并入本文，将所述结构包括在内作为二硫键连接的二聚体结tt构，其可与pIX或pVII噬菌体外壳蛋白融合并在噬菌体颗粒的外表面展tt示。tt
在一个实施例中，在噬菌体颗粒上展示的蛋白质包含一对生物活性tt肽-接头-铰链-CH2-CH3多肽，该对多肽通过缔合或共价键，特别是Cys-ttCys二硫键连接。生物活性肽可具有任何长度并且可以是源自任何物种的tt天然存在的序列或为人工序列。该肽通常将由噬菌粒载体编码并与用于在tt噬菌体颗粒上展示的构建体的Fc部分融合。具有类似结构的其他构建体可tt用掺入了本发明的突变型分泌信号的载体表达，其中所述肽具有未知生物tttttt活性但其表现出起到标记物、标签、抗原的作用，或提供报告基团、螯合tt基团等的缀合。tt
另外还可在转录水平上控制所分泌的蛋白质或外壳蛋白-融合蛋白的tt表达水平。融合蛋白处于Lac Z启动子/操纵子系统的诱导型控制之下(见tt图1)。其他诱导型启动子也可使用并且是本领域技术人员已知的。为了tt高水平表面表达，将抑制子文库(suppressor library)在Lac Z启动子的诱导tt剂如异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)中培养。诱导型控制是有利的，因为相tt当非功能性pIX融合蛋白的生物选择可通过在非表达条件下培养该文库来tt最少化。然后可仅在筛选时诱导表达以确保文库中整个抗体群体精确地呈tt现于噬菌体表面。tt
编码所分泌的蛋白质或外壳蛋白-融合蛋白的载体可在外源蛋白编码tt区和噬菌体外壳蛋白编码区的接合处包括翻译终止密码子。当在携带相应tt的转录终止抑制子的细菌细胞中表达时，该融合蛋白得以产生。当在不具tt有相应的抑制子的细菌细胞中表达时，游离的外源蛋白不会产生。tt
使用本发明的方法
当本发明的突变型分泌信号序列用于构建用于细菌宿主细胞(如大肠tt杆菌)中的蛋白质表达的载体时，多肽被分泌进宿主细胞的周质中并将其tt从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，一般通过诸如渗透压休克、tt超声处理或溶胞之类的手段来破坏。一旦细胞被破坏，即可通过离心或过tt滤移除细胞碎片或完整细胞。可对蛋白质进行进一步纯化，例如通过亲和tt树脂色谱法纯化。或者，可将蛋白质转运进培养基中并从其中分离蛋白tt质。可从培养物移除细胞，将培养物上清液过滤并浓缩用于对所产生的蛋tt白质进行进一步纯化。可用通常已知的方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)tt和蛋白质印记测定法对所表达的多肽进行进一步分离和鉴别。tt
当将本发明的突变型分泌信号用于构建用于融合蛋白(其为与噬菌体tt外壳蛋白融合的外源蛋白)的表达的噬菌体载体或噬菌粒载体时，所述蛋tt白质在所形成的噬菌体颗粒的表面装配并从宿主细胞膜(如大肠杆菌细tt胞)分泌。tt
将本文示例的噬菌体载体用作起点，可利用定点诱变在特定的离散残tt基位置或在诸如N-连接糖基化序列(通常称为NXT序列)之类的区域对tttttt蛋白质或外源蛋白-噬菌体外壳蛋白融合物进行多样化处理以产生分子文tt库。特别有用的是改良的Kunkel诱变方法，该方法可用于产生亿万个大肠tt杆菌菌落，每个菌落具有不同的外源蛋白序列。虽然有效，但当产生高度tt复杂的序列文库时，非诱变亲本DNA的百分比增加。此外，当用于制备tt在较远区域包含序列多样性的文库时，长寡核苷酸合成的技术限制可降低tt该方法的有效性。为了克服这些限制，可使用另外的产生超过350个碱基tt的寡核苷酸的技术。这些技术包括使用巨引物和在诱变模板中产生含有限tt制性酶识别位点的颈-环序列结合标准的Kunkel诱变方法(Kunkel等人，tt1987Methods Enzymol.154:367-382)，如US20050048617中所述。与其他tt文库技术如限制性酶切克隆(restriction cloning)(Marks等人，1991J.Mol.ttBiol.222:581-597；Griffiths等人，1994EMBO J.13,3245-3260；Hoet等tt人，2005Nature Biotechnol 23,344-348)、噬菌体重组(Gigapack,Invitrogen)tt和序列特异性重组相比较，该改良的基于Kunkel的方法在产生序列多样性tt文库(大于109)方面明显更有效并且更易于在靶DNA的任何位置引入序tt列多样性。tt
在期望针对所需的结合特性筛选大的这种分子群体时，含Fc蛋白质tt在丝状噬菌体上的展示特别有用。用允许携带融合基因的载体DNA优先tt包装成噬菌体颗粒的M13变体感染表达所需蛋白质或蛋白质融合物的细菌tt细胞。每一所得的噬菌体颗粒可展示一个或多个拷贝的融合蛋白并且含有tt编码该融合蛋白的载体。可通过淘选程序针对所需的结合特性富集这种噬tt菌体颗粒的群体。通常，将所需的颗粒固定于包被有所需噬菌体颗粒可与tt之结合的抗原的固体表面(如ELISA板)上。收集结合的颗粒并用于进一tt步感染细菌细胞。重复该淘选程序以针对所需的结合特性进一步进行富tt集。tt
筛选从噬菌体库回收的蛋白质(如抗体或含Fc的分子)的一种方法tt是移除连接到该蛋白质分子的用于展示的噬菌体外壳蛋白。为了便于移除tt噬菌体外壳蛋白，可在外源蛋白和外壳蛋白之间编码酶切位点并适当定位tt以包括或排除标签(如Flag或hexahis)序列。tt
噬菌体和其他抗体展示方法为操纵相对抗原或受体靶标的体外选择提tt供了机会。体外选择方法的一个特定的优点是能够操纵选择程序来获得与tttttt靶蛋白质上的多种位点结合的抗体。作为另一种选择，可将完整细胞用于tt选择结合物。tt
噬菌体文库简化了对与功能属性相关的遗传材料的检索，然而，需要tt多步骤的淘选策略来从文库分离最佳的候选物。结构域或表位引导的淘选tt已成为选择与靶蛋白质结合的抗体的常规方式。这种选择已主要通过利用tt分别称为选择性淘选(selective panning)、去除选择淘选(de-selective ttpanning)、配体捕集(ligand capture)、减法淘选(subtractive panning)或引导选tt择(pathfinder selection)的方法，采用对抗体的分步选择来实现。tt
在减法淘选中，可将具有重叠的但不完全相同的位点的靶标用于去除tt对不期望的结合物的选择。已将该策略用于鉴别甚至未知的抗原的结合tt物，如使用正常细胞来去选择癌细胞的结合物的用法一样。作为另一种选tt择，将具有一些共同结构域或结构的天然存在的蛋白质用于顺序选择或竞tt争选择以获得与相关抗原中不同的或相同的位点结合的抗体。在一些情况tt下，可将天然存在的蛋白质如相关的趋化因子或蛋白质的突变形式用于减tt法淘选。tt
配体捕集引导的淘选与在如下方面与ELISA夹心测定法类似：将针对tt不相关的或不相邻的表位的固定化抗体用于捕集靶配体的优选的结合面并tt将其提供用于噬菌体淘选(US6376170)。有人已使用竞争性抗体来在非所需tt靶结构域处选择性地遮蔽抗原(Tsui,P.等人，2002.J.Immunol.Meth.tt263:123-132)。引导选择技术使用单克隆抗体和多克隆抗体，以及直接或tt间接与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的天然配体。在存在生物素酪胺的情况tt下，这些分子催化紧邻靶抗原结合的噬菌体的生物素化，从而使得能用链tt霉亲和素从总全体中特异性回收“带标签”的噬菌体。以该方式，与靶标tt本身结合，或紧邻靶标处结合的噬菌体得以选择性回收(Osborn,J.K.等tt人，1998.Immunotechnol.3:293-302)。可采用这些方法、这些方法的变tt型形式以及本领域技术人员已知的其他方法来查询用依赖于本发明的突变tt型分泌信号的表达方法产生的外源蛋白的文库。tt
在一个实施例中，将噬菌体文库用于针对与天然的或重组的Fc受tt体，如FcRγIII(CD16)、FcRγII(CD32)和FcRγI(CD64)的结合的增强、降tt低或改变，来筛选分子的Fc部分的变体。tt
虽然已概括地描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例tt中进一步公开，所述实例不应理解为对权利要求所保护的范围的限制。tt
实例1.在pVII上的多价肽展示
为了测试pVII是否可有效且稳定地展示多拷贝的不同肽和蛋白质，设tt计并构建了噬菌体基因组展示载体。pVII载体用噬菌体基因组M13KE来tt构建，M13KE为M13mp19(为单链、雄性特异性丝状DNA噬菌体M13tt的衍生物的载体，NCBI NC_003287，长大约7250bp)的衍生物。pVII和ttpIX编码序列在基因组中彼此相邻。在该载体中，将具有起始密码子和ttGSGGG接头的肽插入pVII的N端中(图1A)。将在pVII编码区之前的ttBsrGI限制性内切酶位点和在pIX编码区的末端的BspHI位点用于克隆。tt
将一系列生化多样性肽(包括线性肽(HA)、带大量负电荷的肽tt(Flag)、带正电的肽(6组氨酸标签)和二硫键约束的肽(PHPEP 190,ttPHPEP 97))克隆进该载体中并进行测试(表1)。通过重叠PCR产生编tt码信号序列、肽、GS接头、pVII和pIX的DNA片段及伸至BsrG I和ttBspH I识别位点的5'和3'端上的旁侧DNA序列。用BsrG I和BspH I限制tt性核酸内切酶消化经凝胶纯化的PCR产物，然后将其连接进用相同酶消化tt的双链M13KE噬菌体。将连接的重组噬菌体DNA转化进XL1-Blue大肠tt杆菌感受态细胞(Stratagene)中。tt
表1.pVII上展示的肽序列
然后将转化的细胞接种于XL1-Blue宿主细胞的菌苔上以分离单独的tt噬菌斑。将XL1-Blue大肠杆菌菌苔上的噬菌斑再悬浮于磷酸盐缓冲盐水tt(PBS)中以让噬菌体颗粒从顶层琼脂扩散出来。将扩散出来的噬菌体添加至ttXL1-Blue液体培养基并培养至O.D.0.5来感染大肠杆菌细胞。将培养物在tt37℃下震荡5小时。震荡后通过离心除去细菌。通过添加十分之一体积的tttttt冷0.5M氯化钠、4％PEG-800并将该混合物在4℃下温育3小时来沉淀上tt清液中的噬菌体颗粒。然后离心混合物并将噬菌体沉淀物再悬浮于PBStt中，标本抽样并在–20℃下保存。tt
测定完整噬菌体与微量滴定板上固定化的配体的结合(噬菌体ttELISA)、进行DNA测序以及对噬菌体滴度进行滴定，来表征噬菌体以及tt评价它们在噬菌体表面上的展示。将黑色Maxisorp ELISA板(NUNC)用tt100μL/孔浓度为5ug/mL(在碳酸盐包被缓冲液pH 9.5中)的识别所展示tt的肽的抗体或蛋白质包被过夜。用含有0.1％Tween-20的三羟甲基氨基甲tt烷缓冲盐水(TBST)将包被的板洗涤3次，用Chemiblocker(Chemicon ttInternational)在室温下封闭1小时。将在Chemiblocker中稀释的噬菌体样品tt添加至用于结合的板。室温下温育1小时后，再次洗涤该板以移除未结合tt的噬菌体。检测抗体(抗M13抗体/辣根过氧化物酶缀合物(GE tthealthcare))1:5,000稀释于TBST/10％Chemiblocker中并以100ul/孔添加至tt该板，室温下温育1小时。最终洗涤后，为了检测将POD化学发光底物tt(Roche)以100μl/孔添加至该板，立刻在Tecan读板仪上进行读板。tt
结果
图2A-E中示出了该噬菌体ELISA数据，证实尽管具有各不相同的结tt构和生物物理性质，全部五种肽均在噬菌体表面上成功展示，与pVII外壳tt蛋白相连。tt
图3中示出了噬菌体与噬菌粒展示的比较，其中将五价展示细菌体系tt统(全部五个拷贝的pVII均展示融合蛋白)与pIX上来自杂交展示系统tt(具有野生型的和融合的pIX编码序列二者的噬菌体载体，p99，如ttWO2009/085464和WO2009/085468中所述)的结果进行了比较，在该杂tt交展示系统中其中平均仅一个拷贝的肽被展示。ELISA结果证实，在源自ttpVII噬菌体载体的噬菌体上展示的HA肽与抗HA抗体的结合明显优于源tt自p99杂交系统的噬菌体，从而表明该载体系统产生了多价噬菌体展示。tt
实例2.分泌信号对肽展示的影响
野生型pVII为天然合成的没有信号肽的蛋白质，尽管其在宿主细胞中tt为内膜蛋白。然而，在以前对pVII和pIX展示系统的研究中，使用了信号tt肽(Gao等人，1999,Proc Natl Acad Sci U S A 96:6025；Kwasnikowski等tttttt人，2005Journal of Immunological Methods 307:135-143)。为了检验细菌tt信号序列对pVII上的噬菌体展示是否必要，我们产生了其中在HA肽(其tt后为GSGGG接头和pVII)前面添加或不添加pelB的构建体。tt
图4显示在没有pelB的情况下HA可在噬菌体表面上展示。然而，如tt较弱的ELISA信号所指示的，HA以明显较低的效率在噬菌体表面上展tt示，即使所用的噬菌体颗粒的数目与具有pelB的噬菌体的数目相同(图tt4)。ELISA数据表明，信号序列pelB尽管不是必须的，但改善了肽展tt示，据推测是通过帮助将HA融合的pVII肽带入噬菌体进行装配的膜中来tt实现。对噬菌体生长的时程研究指示，源自具有pelB的噬菌体载体的噬菌tt体比源自不具有pelB的噬菌体载体的噬菌体生长更快，从而进一步提供证tt据表明细菌信号肽有助于HA在表面上展示的噬菌体的装配。tt
实例3：pelB突变
PHPEP 97(RECHPQNWTSCSN)为与链霉亲和素结合的由二硫键约束tt的13个氨基酸的肽，是测试pVII噬菌体展示的肽之一(实例1)。在噬tt菌体ELISA中，两个PEP97克隆(CL#7和CL#8)显示与链霉亲和素的tt结合能力增加(图2E)。对这两个克隆进行序列分析发现了这两个克隆的ttpelB序列中的单个氨基酸突变，第6个脯氨酸突变为丝氨酸(图5A)。tt
然后针对P6S pelB增强其他肽的展示的能力对其进行了测试，也观察tt到展示效率的改善(数据未示出)。为了测试该突变是否影响蛋白质分tt泌，将pelB或突变的pelB与碱性磷酸酶(AP)融合并检验了AP在DH10Btt细菌中的分泌。tt
检测了细胞培养物中所分泌的碱性磷酸酶活性。结果显示(图tt6A)，该突变的确显著改善了AP向细胞培养基(上清液级分)的分泌，tt但细胞内的AP浓度相同(图6B)。因而我们假定，通过该突变，突变的ttpelB改善了PHPEP97-pVII向噬菌体进行装配的质膜的转运。就我们所tt知，还未有别的关于可增加蛋白质分泌的peIB中的突变的报道。tt
实例4：肽在噬菌体pVII和pIX上的双多价展示
为了同时多价展示两种不同的肽，基于噬菌体基因组M13KE构建了tt噬菌体载体，其中突变型P6S细菌信号肽pelB(SEQ ID NO:2,C16T)、肽ttA和柔性GSGGG接头插入至pVII基因的N端；野生型细菌信号肽ompAtttttt(SEQ ID NO:4,G31)、肽B和柔性GSGGG接头插入至pIX的N端(图tt1B)。将在pVII编码区之前的BsrG I限制性内切酶位点和在pIX编码区tt的末端的BspH I位点用于克隆。通过重叠PCR产生产生信号序列、肽、ttGS接头、pVII、pIX基因及伸至BsrG I和BspH I识别位点的5'和3'端上的tt旁侧DNA序列。用BsrG I和BspH I限制性核酸内切酶消化经凝胶纯化的ttPCR产物，然后将其连接进用相同酶消化的双链M13KE噬菌体。如前所tt述将连接的重组噬菌体DNA转化进XL1-Blue大肠杆菌感受到细胞tt(Stratagene)中并将转化的细胞接种于XL1-Blue宿主细胞的菌苔上以分离单tt个噬菌斑。tt
通过噬菌体ELISA评价了FLAG和HA肽二者的展示(图7)，该ttELISA证实两种肽均在噬菌体颗粒上展示。对于PHPEP 97的展示也一tt样，然而，初始的噬菌斑尺寸非常小，噬菌体滴度低。tt
为了选择噬菌体中可改善生长速率的自发变，我们对来自来两个独立tt克隆的噬菌体进行连续传代。在五轮连续传代后，随着时间推移观察到一tt个克隆(#11)的噬菌体滴度显著增加(图8)。将从第5轮和第10轮的噬菌tt体纯化的全噬菌体基因组的序列进行比较，确定仅一个单氨基酸突变，位tt于信号肽ompA的位置11处，Ala突变为Pro(图5B)。从其他克隆tt(#9)的噬菌体也鉴定了相同的突变。然而，该突变没有像peIB中的突变tt一样显著影响碱性磷酸酶的分泌(图6A)。tt
实例5：全长IgG在噬菌体颗粒上的展示
A.载体设计。tt
从如WO2009/085462中所述的噬菌粒构建体(pCNTO Fab IX)开始构建tt了全长IgG展示噬菌粒(vDR47，图9)。添加了编码人IgG1铰链、CH2tt和CH3结构域的序列以及P6S pelB变体信号序列，该载体不具有lacI基tt因，但可通过lac启动子控制表达。tt
B.用于全长IgG展示的构建体的表征。tt
制备一系列测试构建体来评估全长IgG在pIX上的展示。选择针对ttIL13的抗体(命名为6-2和16-7)和抗细胞因子抗体9-4作为原型来构建tt新的全长IgG分子。为了确定不同密码子选择的效果，为抗IL13抗体中的tt每一者制备两个构建体，一个进行了人密码子优化，一个进行了大肠杆菌tttttt密码子优化。表1列出了五个全长IgG测试构建体的载体名称。如美国专tt利6,670,127和6,521,427所述合成优化的基因并组装成双链DNA。此外，tt将与pIX融合的EMP-1肽-Fc融合构建体(CNTO530，US7393662的SEQ ttID NO:88)包括在内作为对照，因为其含有人IgG铰链、CH2和CH3结tt构域但无轻链。tt
表2.用于全长IgG展示的测试构建体
C.噬菌体制备tt
根据标准规程将上面“小节B”中描述的全长IgG展示构建体转化进tt两个不同的F’大肠杆菌菌株TG-1和XL-1blue中。测试这两个菌株的原因tt是它们的生长速率不同，据推测这可影响全长IgG pIX融合蛋白的包装和tt展示。选取单独的转化株并在补充有羧苄青霉素(总是以100μg/ml使用)tt的2XYT培养基中培养过夜。然后将该过夜培养物(500μl)用于接种25mltt2XYT/羧苄青霉素，将培养物在37℃、250rpm下培养直至OD(600nm)达到tt0.5。在30分钟的温育期间(37℃，不振荡)用10^11pfu/ml的VCSM13辅tt助噬菌体(Stratagene,La Jolla,CA)感染该细菌，然后在3,000rpm下进行离tt心步骤15分钟。在该步骤，标准规程要求用2XYT/羧苄青霉素/IPTGtt(1mM)诱导该细菌培养物。然而，我们将培养物分成两份，将1mM IPTGtt添加至一份，另一份未添加，假设该系统泄漏将足以产生具有随后的噬菌tt体包装的融合蛋白。概括地说，对于每个构建体，制备了四份不同的噬菌tt体制备物：(i)TG-1，使用IPTG(ii)TG-1，不使用IPTG(iii)XL-1blue，使tt用IPTG(iv)XL-1blue，不使用IPTG。将该培养物在30℃下以250rpm培tt养过夜，第二天，以3,000rpm离心15分钟，然后在PEG/NaCl中沉淀噬菌tt体上清液。在冰上2小时后，将沉淀的噬菌体在10,000rpm下离心15分tt钟，将噬菌体沉淀物再悬浮于2ml PBS中。通过以10,000rpm离心10分钟tttttt将噬菌体制备物进一步净化除去任何残余的细菌沉淀物并在4℃下保存于tt2ml试管中。tt
D.噬菌体滴度
根据标准规程测定噬菌体滴度。简而言之，将TG-1细胞在2XYT中tt培养直至OD(600nm)达到0.5。将噬菌体制备物在96孔板中用PBS进行系tt列稀释，将TG-1细胞添加至该噬菌体并在37℃下温育以进行感染。30分tt钟后，通过将每孔2ul分配至含有1％葡萄糖和羧苄青霉素的LB琼脂板上tt来进行点滴定。将板在37℃下温育过夜，测定噬菌体的浓度，单位为集落tt形成单位(cfu)/ml。表3示出了针对所有构建体和培养条件的噬菌体滴定的tt结果。所有的克隆均产生高的噬菌体滴度，在10^11–10^13cfu/ml之间，这tt是所预计的范围并且表明噬菌体得以有效制备。tt
表3.tt
E.用以评估功能性展示的IgG结构域特异性夹心ELISA
为了评估全长IgG分子在噬菌体pIX上的展示，建立了一系列夹心ttELISA。用1μg/ml的在TBS中稀释的如下捕集抗体中的一种包被黑色ttmaxisorp板：绵羊抗人IgG(Fd,CH1)抗体(The Binding Site,Birmingham,ttUK)、小鼠抗人k轻链(Southern Biotech,Birmingham,AL)、小鼠抗人IgGtt(CH2结构域)抗体(AbD Serotec,Raleigh,NC)和小鼠抗人IgG(CH3结构tt域)抗体(AbD Serotec)。在用Chemiblocker(Chemicon/Millipore,Billerica,ttMA)对板进行封闭后，洗涤板并以2×10^11cfu/ml的浓度(在10％ttttttchemiblocker/TBST中稀释)添加噬菌体并温育一小时。洗涤板并将HRPtt缀合的小鼠抗M13抗体添加至板。温育30分钟后，洗涤板并将化学发光tt底物添加至孔中，在Envision读板仪中进行读板。图10A–D分别示出了tt来自CH1(图10A)、k(图10B)、CH2(图10C)和CH3(图10D)夹tt心ELISA的结果。用于ELISA的对照为展示vDR10中的克隆6-2的Fab-ttpIX融合物(经人密码子优化，在TG-1细胞中制备，用IPTG诱导)(为tt一种非特异性支架蛋白-pIX融合物)或CNTO530-pIX融合物的噬菌体。tt在CH1和k ELISA中，6-2Fab用作阳性对照，而EMP-1构建体(CNTO530)tt分子用作阴性对照。在CH2和CH3ELISA中，6-2Fab用作阴性对照，ttCNTO530分子用作阳性对照。该支架蛋白噬菌体在所有ELISA中用作阴tt性对照，因为其携带任何抗体结构域。还以5ug/ml的浓度添加抗IL13全tt长IgG1抗体作为可溶性竞争物进行ELISA测定以防止噬菌体与不同的捕tt集抗体结合。tt
如图10A-D中所示，可在所有的夹心ELISA中检测到噬菌体，从而tt提供证据表明所述噬菌体事实上在表面上展示不同的抗体结构域。在XL-1ttblue细胞中产生的噬菌体具有最高的信号，并且添加IPTG对结合信号具tt有积极效果。可通过添加可溶性抗IL13抗体抑制噬菌体的结合，这可指示tt特异性相互作用。然而，可溶性抗IL13抗体不能竞争噬菌体与CH3结构tt域之间的相互作用(图10D)。对于全长IgG-pIX融合物以及对于EMP-1-ttFc-pIX融合物(CNTO530)二者均观察到这一点。tt
F.全长IgGpIX噬菌体与IL13结合
在证实可通过ELISA在噬菌体颗粒上检测到IgG分子的所有结构域tt后，有必要确定所述构建体是否还保留与它们各自的抗原结合的能力。通tt过用1μg/ml市售抗IL13抗体(小鼠抗人IL13，MAB213，R&D Systems)tt包被黑色Maxisorp板建立IL13结合ELISA。MAB213不与6-2或16-7竞tt争与IL13的结合，因而其作为夹心ELISA捕集抗体是理想的。在洗涤和tt封闭后，以100nM添加生物素化的人IL13R130Q human(Peprotech)并温育tt一小时。洗涤板并以2×1011cfu/ml添加在pIX上展示全长IgG形式的6-2tt和16-7的噬菌体，该添加是单独添加或与用于竞争的可溶性抗IL13抗体tt一起添加。用HRP缀合的小鼠抗M13抗体检测结合的噬菌体，在ttttttEnvision仪中读取化学发光。图11示出了IL13噬菌体ELISA的结果。在tt多大数条件下检测到了结合，其中使用1mM IPTG在XL-1blue细胞中产tt生的噬菌体显示出最高的信号。肽-Fc-pIX和备选的支架分子-pIX融合物tt为阴性(正如所预料的)，6-2Fab pIX对照为阳性。添加可溶性抗IL13抗tt体抑制了结合，从而显示该结合是特异性的。为了进一步检验IL13结合，tt建立了ELISA，其中将可溶性竞争抗体从50μg/ml–0.01μg/ml进行系列稀tt释。还包括了对照抗体。图12A和B分别示出了可溶性抗体对6-2IgG pIXtt和6-2Fab pIX的IL 13结合的影响。对于这两个构建体均观察到了结合的tt抑制，IC50为大约0.1μg/ml。然而，对于全长IgG pIX构建体，即使是在tt十分高的竞争物浓度下该抑制是不完全的，从而表明存在一定水平的非特tt异性相互作用。tt
G.全长IgGpIX噬菌体与IL13和IL17结合
进行了第二个确证性实验。通过克隆全长IgG形式的抗IL17A抗体来tt进行该实验。如上所述将该构建体转化进XL-1blue细胞中并制备噬菌tt体。进行ELISA来确认IL17IgG在pIX上的展示以及其与人IL17Amut6tt抗原的结合，如图13中所示。对于每个ELISA(Fd捕集、k捕集、CH2tt捕集、CH3捕集、IL13捕集和IL17捕集)，单独添加噬菌体或者将其与tt可溶性抗IL13单克隆抗体或可溶性抗IL17A单克隆抗体一起添加。添加tt竞争性单克隆抗体可显示ELISA的特异性。如上面的图12A和B中可看tt出的，IL17IgG在pIX上展示，但水平低于IL13IgG。这与Fab表达水平tt在这些构建体之间的不同(数据未显示)一致。可以看出抗原结合的特异tt性，因为噬菌体上的抗IL13IgG不与IL17结合，噬菌体上的抗IL17IgGtt不与IL13结合。此外，可通过它们的可溶性单克隆抗体对应物抑制这两种tt类型的噬菌体中每一者的结合。tt
实例X：与pVII融合的含Fc蛋白质的展示
另外，我们已证明Fc和MIMETIBODYTM蛋白可用pVII噬菌粒系统在tt噬菌体表面上展示。tt
<110> 森托科尔奥索生物科技公司t
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<120> 改善的细菌膜蛋白质分泌t
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<130> CEN5278WOPCTt
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<140> TBDt
<141> 随附t
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<150> 61/261,768t
<151> 11/17/2009t
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<160> 9 t
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<170> PatentIn 版本3.5t
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<210> 1t
<211> 22t
<212> PRTt
<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)t
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<220>t
<221> MUTAGENt
<222> (6)..(6)t
<223> X可以是P（野生型）或S（变体）t
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<400> 1t
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1 5 10 15 t
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<213> 胡萝卜软腐欧文氏菌t
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<213> 大肠杆菌t
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<223> 抗体识别序列t
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<223> 纯化t
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<213> 人工序列t
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<223> EGFR结合肽t
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<213> 人工序列t
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<223> 链霉亲和素配体t
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