玉米DNA指纹库构建及品种分子鉴定SNP核心位点组合-maizeSNP384
技术领域tt
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于玉米DNA指纹数据库构建和品种分子鉴定的ttSNP核心位点组合maizeSNP384及其应用。tt
背景技术tt
玉米是重要的农作物，由于具有粮、经、果、饲、能多元用途而在全球广泛种植。2012tt年统计，玉米种植面积和总产量均居中国的第一位，在中国农业经济结构中具有关键作用。tt同时由于玉米为杂交作物、重组率高、遗传多样性丰富、以及较好的基因组学研究基础而成tt为遗传学研究的模式植物。自20世纪80年代以来，随着种业市场化的发展，我国玉米品种tt逐步增加，截止至2013年，已通过国家和省级审定的总品种数为6291个，其中国家审定503tt个，而且近几年每年参加国家、各省市的区域试验样品约2000个；申请品种权保护3585个，tt已授权1548个品种。庞大的玉米品种数量增加了品种管理的难度，同时，由于种质资源日趋tt狭窄，少数骨干亲本被集中应用，在原品种基础上仅改良少数甚至单个性状的依赖性派生品tt种增多，品种间的遗传差异越来越小，如何有效地管理和甄别数量庞大的玉米品种成为品种tt管理的难题。tt
传统田间种植鉴定、蛋白质电泳方法，由于区分能力有限，特别是随着育种技术的进步，tt品种间差异越来越小，这些方法已完全不能满足准确、快速鉴定的需要。DNA指纹鉴定技术tt具有不受环境影响、快速、准确的优点，成为目前玉米品种鉴定的重要手段。DNA指纹(DNA ttfingerprinting)指不同品种间遗传物质DNA的碱基组分、排列顺序及长度各不相同，分别呈tt现出各自特有的DNA序列，它们就像人类的指纹一样，具有专一性和特异性，因此被形象tt的称为DNA指纹；将能够检测区分上述DNA序列差异的技术称为DNA指纹鉴定技术(DNA ttfingerprinting technology)。各种DNA指纹鉴定标记，SSR和SNP由于均为共显性遗传、反tt映的是确定目的片段或序列信息的差异，染色体位置已知、具有高通量自动化的潜力而被ttUPOV(International Union for the Protection of New Varieties of Plants)的BMT分子测试指南tt推荐作为品种DNA指纹鉴定和数据库构建的优选标记。tt
SSR标记由于具有高区分能力、技术相对成熟简便，以及常规试验室即可开展的优势，tt在品种鉴定领域已应用十多年。但是随着技术的发展和鉴定需求的提高，SSR标记显示出了tt一些缺点：如位点通量难以提高，增加位点数目，工作量和成本都相应增加；不同电泳平台tt间数据共享困难等。SNP与SSR相比具有以下优势：一是在基因组中分布密度更高更均匀；tt二是SNP位点通常情况下为二等位基因，易实现平台间数据整合比较；三是更易实现位点高tt通量；四是SNP位点在基因内区域分布较多，可能与功能基因相关。近些年来，随着玉米全tt基因组序列信息的完善，大量SNP位点被开发，各种SNP基因分型平台的出现，SNP标记tt成为玉米品种DNA指纹鉴定和数据库构建最具发展潜力的标记系统。tt
SNP位点开发、筛选以及应用在玉米中具有较好的研究基础。基于Infinium或GoldenGatett芯片技术平台各种SNP array被报道，如包含56110个位点高密度的SNP array maizeSNP50tt芯片，该芯片在全基因组关联分析、QTL定位中成功应用；包含768、1536个位点通量SNPtt芯片，该芯片在玉米种质资源遗传多样性评估、分子育种中成功应用；以及适于玉米品种DNAtt指纹分析和分子育种的通用型SNP芯片maizeSNP3072等。尽管有多种不同通量玉米SNP芯tt片可供使用，但是适于玉米真实性鉴定及指纹数据库构建的位点的选择标准与其它研究领域tttttt如遗传多样性、关联分析、分子育种等有很大差别，并不能直接将已报道的位点组合直接应tt用到玉米真实性鉴定和数据库构建中。tt
发明内容tt
本发明的目的是提供一种用于玉米指纹数据库构建和分子鉴定的核心SNP位点组合ttmaizeSNP384及其应用。tt
本发明保护384个SNP位点在如下任一中的应用：tt
(1)构建玉米DNA指纹数据库；tt
(2)检测玉米品种真实性；tt
(3)玉米种质资源遗传分析(如类群划分、遗传结构分析或遗传多样性分析)；tt
(4)玉米分子育种；tt
所述384个SNP位点的物理位置是基于玉米品种B73的全基因组序列比对确定的，所tt述玉米品种B73全基因组序列的版本号为B73 RefGen V1；所述384个SNP位点是ttMG001-MG384(具体见实施例1)。tt
本发明所提供的位点组合可以形成用于检测所述384个SNP位点的基因芯片。tt
在本发明中，所述基因芯片具体是根据序列表中序列1-384所示序列按照Illumina公司tt的GoldenGate要求设计探针进而制作的芯片。tt
其中，根据序列表中序列1-384所示序列按照Illumina公司的GoldenGate要求设计探针tt具体是参照美国专利US 6355431和US 6429027进行的。tt
其中，序列表中序列1-384所示序列中n均表示a或t或c或g。tt
所述基因芯片在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：tt
(1)构建玉米DNA指纹数据库；tt
(2)检测玉米品种真实性；tt
(3)玉米种质资源遗传分析(如类群划分、遗传结构分析或遗传多样性分析)；tt
(4)玉米分子育种。tt
本发明还提供了一种构建玉米DNA指纹数据库的方法。tt
本发明所提供的构建玉米DNA指纹数据库的方法(记为方法A)，具体可包括如下步骤：tt
(a1)分别提取用于构建玉米DNA指纹数据库的所有玉米品种的基因组DNA；tt
(a2)利用所述基因芯片对每个所述玉米品种的基因组DNA进行所述384个SNP位点tt的检测，从而获得所有所述玉米品种在所述384个SNP位点上的基因型数据，即构成玉米ttDNA指纹数据库。tt
本发明还保护用于构建玉米DNA指纹数据库的试剂盒。tt
所述用于构建玉米DNA指纹数据库的试剂盒，含有所述基因芯片及记载有所述方法Att的说明书。tt
本发明还提供了一种检测玉米品种真实性的方法。tt
本发明所提供的检测玉米品种真实性的方法(记为方法B)，具体可包括如下步骤：tt
(b1)分别提取待测玉米样品和对照玉米样品的基因组DNA；tt
(b2)利用所述基因芯片对所述待测玉米样品和所述对照玉米样品的基因组DNA分别tt进行所述384个SNP位点的检测，从而获得所述待测玉米样品和所述对照玉米样品各自在所tt述384个SNP位点上的基因型数据；tt
(b3)根据(b2)的结果，按照如下方法确定所述待测玉米样品的真实性与否：若所述tttttt待测玉米样品与所述对照玉米样品在所述384个SNP位点上的基因型数据中差异位点百分比tt小于5％，则所述待测玉米样品与所述对照玉米样品属于同一品种或候选属于同一品种；若所tt述待测玉米样品与所述对照玉米样品在所述384个SNP位点上的基因型数据中差异位点百分tt比大于等于5％，则所述待测玉米样品与所述对照玉米样品不属于同一品种。tt
本发明还保护用于检测玉米品种真实性的试剂盒。tt
所述用于检测玉米品种真实性的试剂盒，含有所述基因芯片及记载有所述方法B的说明tt书。tt
本发明还提供了一种对玉米种质资源进行类群划分的方法。tt
本发明所提供的对玉米种质资源进行类群划分的方法(记为方法C)，具体可包括如下tt步骤：tt
(c1)分别提取待进行类群划分的所有玉米品种的基因组DNA；tt
(c2)利用所述基因芯片对所有所述玉米品种的基因组DNA分别进行所述384个SNPtt位点的检测，从而获得所有所述玉米品种在所述384个SNP位点上的基因型数据；tt
(c3)根据步骤(c2)所得的基因型数据，建立聚类树状图(如NJ聚类树状图)，从而tt将所有所述玉米品种划分为不同类群。tt
在步骤(c3)中，所述“根据步骤(c2)所得的基因型数据，建立聚类树状图(如NJtt聚类树状图)”具体为：根据步骤(c2)所得的基因型数据，利用Power-Marker ver.3.25软件，tt选用Rogers(1972)遗传距离计算法，分析建立NJ聚类树状图(neighbor-joining tree)。tt
本发明还保护用于对玉米种质资源进行类群划分的试剂盒。tt
所述用于对玉米种质资源进行类群划分的试剂盒，含有所述基因芯片及记载有所述方法ttC的说明书。tt
实验证明，这384个核心SNP位点具备兼容多平台、高稳定性、高重复性、高区分能力tt特点，满足标准指纹数据构建的要求；将待测玉米样品基因组DNA的这384个SNP位点基tt因型与对照玉米样品基因组DNA的所述384个SNP位点基因型进行比较，能够鉴别所述待tt测玉米品种的真实性；对骨干自交系分析显示，这384个SNP位点多态性较高而且无偏向性，tt能区分不同玉米类群。因此本发明提供的384个SNP位点可应用于玉米品种DNA指纹数据tt库构建、品种真实性鉴定、种质资源类群划分，以及其它相关研究中。这384个核心位点组tt合在玉米中的应用将加快我国玉米品种标准SNP指纹数据库构建的进程，推进SNP标记技tt术在真实性鉴定中的应用，为玉米品种管理、种子市场监测、企业维权等提供科技支撑，确tt保粮食生产安全；同时为玉米分子育种中种质资源分析奠定了技术基础，加快优良玉米新品tt种的选育进程。tt
附图说明tt
图1为基于300份玉米杂交种的384个SNP位点的基因型数据，品种间两两比较差异位tt点百分比分布图，横坐标为差异位点比值，纵坐标为两两比较的对数。tt
图2为基于300份玉米自交系的384个SNP位点的基因型数据，建立各类群的NJ聚类tt分析图。tt
具体实施方式tt
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。tt
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。tt
实施例1、用于玉米DNA指纹数据库构建和品种分子鉴定SNP核心位点组合ttmaizeSNP384及其芯片的制备tt
基于300份玉米杂交种、300份国内外自交系以及240份DH系样品的3072个SNP位点tt数据(参见专利号为ZL 2012 8 0000286.2的中国发明专利)，从玉米通用型SNP芯片产品ttmaizeSNP3072中，根据试验效果、区分效率、均匀分布原则筛选确定适于玉米真实性鉴定和tt指纹数据库构建的核心384个SNP位点。具体筛选过程分为三步：(1)根据以下指标“3072 ttSNPs完全兼容GoldenGate和Infinium两种平台、高数据质量、MAF值≥0.2”获得1212个tt候选SNPs；(2)根据Illumina design rank score>＝0.7，AA、AB、BB三种基因型具备明显tt界限的原则获得800个候选SNPs；(3)包含96个区分杂种优势群的祖先信息位点；(4)基tt于在玉米自交系和杂交种具有高的区分能力，无紧密连锁，均匀分布的原则，确定了384个tt核心SNPs。tt
将384个SNP位点及其侧翼序列(具体参见序列表中序列1-384)提交Illumina公司tt(http://www.illumina.com)最终筛选评估获得的384个SNP位点，经芯片设计系统评估，384tt个SNP位点分值均在0.7以上，全部适合订制芯片。这384个SNP位点的物理位置及其侧翼tt序列是基于玉米品种B73的全基因组序列(版本号为B73 RefGen V1，网址：tthttp://www.maizesequence.org/)比对确定的，所述384个SNP位点为MG001-MG384。tt
MG001位于1号染色体上第2291351位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG002位于1号染色体上第8950703位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG003位于1号染色体上第11450804位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG004位于1号染色体上第17673955位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG005位于1号染色体上第21456178位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG006位于1号染色体上第24680076位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG007位于1号染色体上第27908989位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG008位于1号染色体上第32276332位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG009位于1号染色体上第35094072位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG010位于1号染色体上第39182909位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG011位于1号染色体上第43113733位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG012位于1号染色体上第44702431位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG013位于1号染色体上第51119678位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG014位于1号染色体上第56663536位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG015位于1号染色体上第61693888位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG016位于1号染色体上第65906267位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG017位于1号染色体上第76603880位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG018位于1号染色体上第78211919位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG019位于1号染色体上第86755374位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG020位于1号染色体上第96547084位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG021位于1号染色体上第110113228位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG022位于1号染色体上第120826915位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG023位于1号染色体上第155470563位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG024位于1号染色体上第156581335位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG025位于1号染色体上第161564373位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG026位于1号染色体上第162595316位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG027位于1号染色体上第164414166位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG028位于1号染色体上第171401222位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG029位于1号染色体上第180787501位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG030位于1号染色体上第198107260位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG031位于1号染色体上第200694298位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG032位于1号染色体上第209039098位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG033位于1号染色体上第219701707位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG034位于1号染色体上第242421486位，其脱氧核苷酸为C或G；tt
MG035位于1号染色体上第244833433位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG036位于1号染色体上第247822084位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG037位于1号染色体上第252588825位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG038位于1号染色体上第262292730位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG039位于1号染色体上第264555055位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG040位于1号染色体上第268351644位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG041位于1号染色体上第271899595位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG042位于1号染色体上第275823657位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG043位于1号染色体上第276645374位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG044位于1号染色体上第278278236位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG045位于1号染色体上第280217079位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG046位于1号染色体上第281703161位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG047位于1号染色体上第284690172位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG048位于1号染色体上第286632553位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG049位于1号染色体上第288230871位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG050位于1号染色体上第289251466位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG051位于1号染色体上第291348621位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG052位于1号染色体上第295655509位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG053位于1号染色体上第297663954位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG054位于2号染色体上第2483514位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG055位于2号染色体上第3726615位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG056位于2号染色体上第4679569位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG057位于2号染色体上第6871249位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG058位于2号染色体上第8865202位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG059位于2号染色体上第21509279位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG060位于2号染色体上第33999904位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG061位于2号染色体上第46941561位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG062位于2号染色体上第47576473位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG063位于2号染色体上第57039873位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG064位于2号染色体上第105286286位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG065位于2号染色体上第107475133位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG066位于2号染色体上第108929606位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG067位于2号染色体上第141861097位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG068位于2号染色体上第148803932位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG069位于2号染色体上第153094141位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG070位于2号染色体上第157152392位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG071位于2号染色体上第179023674位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG072位于2号染色体上第182739969位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG073位于2号染色体上第187496675位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG074位于2号染色体上第192365750位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG075位于2号染色体上第193006055位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG076位于2号染色体上第196281500位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG077位于2号染色体上第197555652位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG078位于2号染色体上第201045737位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG079位于2号染色体上第204223382位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG080位于2号染色体上第209334570位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG081位于2号染色体上第212505369位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG082位于2号染色体上第215440964位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG083位于2号染色体上第217577775位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG084位于2号染色体上第220261901位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG085位于2号染色体上第221570008位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG086位于2号染色体上第222474438位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG087位于2号染色体上第231394325位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG088位于3号染色体上第8770902位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG089位于3号染色体上第14970725位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG090位于3号染色体上第23869473位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG091位于3号染色体上第25511136位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG092位于3号染色体上第27454866位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG093位于3号染色体上第28849320位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG094位于3号染色体上第54625695位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG095位于3号染色体上第56747962位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG096位于3号染色体上第57710146位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG097位于3号染色体上第66926417位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG098位于3号染色体上第102622567位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG099位于3号染色体上第106771959位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG100位于3号染色体上第113329366位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG101位于3号染色体上第114260854位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG102位于3号染色体上第119099014位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG103位于3号染色体上第122279513位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG104位于3号染色体上第128759257位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG105位于3号染色体上第131053938位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG106位于3号染色体上第137850581位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG107位于3号染色体上第138928574位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG108位于3号染色体上第147226099位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG109位于3号染色体上第148672043位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG110位于3号染色体上第151396685位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG111位于3号染色体上第155059601位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG112位于3号染色体上第159996630位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG113位于3号染色体上第161035765位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG114位于3号染色体上第167578743位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG115位于3号染色体上第171335941位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG116位于3号染色体上第172886369位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG117位于3号染色体上第178024230位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG118位于3号染色体上第179218369位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG119位于3号染色体上第182373006位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG120位于3号染色体上第194157875位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG121位于3号染色体上第198368844位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG122位于3号染色体上第199886758位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG123位于3号染色体上第201963177位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG124位于3号染色体上第204804088位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG125位于3号染色体上第206480087位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG126位于3号染色体上第207472248位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG127位于3号染色体上第210409715位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG128位于3号染色体上第216464994位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG129位于3号染色体上第219993851位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG130位于3号染色体上第224676822位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG131位于3号染色体上第227739402位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG132位于4号染色体上第4110799位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG133位于4号染色体上第14102037位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG134位于4号染色体上第18669851位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG135位于4号染色体上第19918437位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG136位于4号染色体上第20603065位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG137位于4号染色体上第22417298位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG138位于4号染色体上第31603521位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG139位于4号染色体上第32969498位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG140位于4号染色体上第37185517位，其脱氧核苷酸为A或T；tt
MG141位于4号染色体上第39618112位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG142位于4号染色体上第44935572位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG143位于4号染色体上第49953068位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG144位于4号染色体上第60772052位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
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MG148位于4号染色体上第127661947位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
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MG150位于4号染色体上第148408171位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
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MG366位于10号染色体上第89336128位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG367位于10号染色体上第95729487位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG368位于10号染色体上第103236809位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG369位于10号染色体上第109208850位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG370位于10号染色体上第113996493位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG371位于10号染色体上第117558317位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG372位于10号染色体上第121274991位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG373位于10号染色体上第129100890位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG374位于10号染色体上第130006259位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG375位于10号染色体上第130673535位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG376位于10号染色体上第131550491位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG377位于10号染色体上第132148750位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG378位于10号染色体上第133502119位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG379位于10号染色体上第134965045位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG380位于10号染色体上第135550678位，其脱氧核苷酸为A或G；tt
MG381位于10号染色体上第136799253位，其脱氧核苷酸为T或G；tt
MG382位于10号染色体上第139770786位，其脱氧核苷酸为T或C；tt
MG383位于10号染色体上第144513547位，其脱氧核苷酸为A或C；tt
MG384位于10号染色体上第147119052位，其脱氧核苷酸为A或G。tt
将序列表中序列1-384提供给Illumina公司(http://www.illumina.com)，按照Illumina ttGoldenGate专利制造技术(美国专利，US 6355431和US 6429027)制作得到用于检测这384tt个SNP位点的芯片，将其命名为maizeSNP384。tt
实施例2、利用实施例1制备的SNP芯片构建玉米标准DNA指纹tt
1、DNA提取及质量鉴定tt
常规CTAB法分别提取用于构建玉米DNA指纹数据库的所有玉米品种的基因组DNA，tt并去除RNA。用琼脂糖电泳和紫外分光光度计分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基tt因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫tt外分光光度计检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于tt1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；ttDNA浓度>50ng/μl；芯片检测DNA用量500ng/每样品。稀释DNA浓度成为50ng/μl左右。tt
2、SNP芯片检测tt
采用实施例1制备的maizeSNP384芯片对步骤1获得的各玉米品种的基因组DNA进行tt384个SNP位点的检测。具体按照Illumina GoldenGate芯片检测标准流程操作(GoldenGate ttGenotyping Assay,Manual,http://www.illumina.com)，使用Illumina iScan芯片扫描仪(iScan，tt美国Illumina公司)扫描芯片，获得每个样本的原始数据。tt
3、基因型指纹数据tt
原始数据导入GenomeStudio software v2010软件，分析每个样品384个位点的基因型，tt最后导出获得SNP指纹数据。tt
实施例3、利用实施例1制备的SNP芯片鉴别玉米品种的真实性tt
一、利用实施例1制备的SNP芯片maizeSNP384鉴别玉米品种真实性检测结果判断标准tt的确定tt
与其它研究领域位点筛选原则不同，除了自交系样品之外，本发明还采用了大量杂交种tt作为评估材料，评估位点特异性、稳定性和品种区分能力，最终获得384个核心SNP位点(SNPtt位点筛选方法具体参见实施例1)。将300份玉米杂交种(1984-2011年国家审定推广品种)tt两两比较差异位点百分比分析，结果显示，几乎所有成对比较样品(98.91％)之间差异位点tt百分比介于40％-75％之间；其中差异位点百分比为60％左右的占据最多；差异位点百分比低tt于5％的成对比较样品数目极少，占据0.033％，因此384个位点完全可以应用到玉米品种真tt实性鉴定中，达到区分确认品种的鉴定目的(图1)。根据以上结果，将差异位点百分比5％tt作为玉米品种真实性鉴定的判断标准。tt
另外，农业行业标准(NY/T1432-2014)《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》，此标准tt为基于SSR标记的玉米品种DNA指纹鉴定方法，此标准将40个SSR位点中大于等于2个tt位点差异的品种认为是不同品种，按照位点比率计算同为5％差异。tt
所以，利用本发明进行玉米品种真实性检测具体判断标准如下：tt
获得待测样品和对照样品在384个SNP位点的基因型数据，并进行样品间数据比较，得tt到差异位点百分比。差异位点百分比的计算方法为D＝(差异位点数n/比较位点数N)×100％tt(比较位点数必须大≥365个，即数据缺失率＜5％，N最大值为384)。tt
(1)待测和对照品种间差异位点百分比≥5％，结论为检测到明显差异；tt
(2)待测和对照品种间差异位点百分比＜5％，结论为未检测到明显差异。tt
二、鉴定待测玉米样品是否为某已知对照玉米品种tt
以下将详述如何利用实施例1制备的SNP芯片maizeSNP384鉴别待测玉米样品(代号为ttA)是否为已知的对照玉米品种郑单958(代号为B)。tt
DNA提取及质量鉴定：提取待测玉米样品(代号为A)和对照玉米品种郑单958(代号tt为B)的基因组DNA，进行DNA质量鉴定、芯片检测和384个位点基因型指纹数据获得，tt具体方法同实施例2。tt
将样品A和样品B的384个SNP位点基因型指纹数据进行比对，结果为，A样品(待tt测玉米样品)和作为对照玉米样品的B样品(已知玉米品种郑单958)比较位点数为384个，tt差异位点数为243个，差异位点百分比为63％。根据5％的判断标准，鉴定待测玉米样品Att不是郑单958。tt
另外，采用目前我国正在使用的40个SSR核心位点进行真实性鉴定的行业标准(NY/Ttt1432-2014，玉米品种鉴定技术规程SSR标记法)进行检测，进一步证实玉米样品A不是郑tt单958。tt
实施例4、利用实施例1制备的SNP芯片对玉米种质资源进行类群划分。tt
本发明提供的384个SNP位点在筛选之初，由于考虑到区分玉米各杂种优势群的祖先信tt息型位点，因此可以用于玉米种质资源分析，如类群划分。以下将详述利用实施例1制备的ttSNP芯片maizeSNP384对300份不同杂种优势群代表自交系样品进行杂种优势群划分。tt
300份待分析样品DNA提取及质量鉴定、芯片检测和384个位点基因型指纹数据获得，tt具体方法同实施例2。基于获得的300份样品384个位点的基因型数据，利用Power-Marker ttver.3.25软件，选用Rogers(1972)遗传距离计算法，分析建立NJ聚类树状图(neighbor-joining tttrree)，300份样品被划分为到不同的群内。tt
结果如图2所示，从图中可以看出，7个类群(唐四平头、P、改良瑞德、旅大红骨、兰tt卡斯特、甜糯、SSS)均能较好的区分开来。tt
