一种用于检测膀胱癌的探针组及基因芯片
技术领域tt
本发明涉及生物基因领域，具体涉及一种用于检测膀胱癌的探针组及基因芯片。tt
背景技术tt
膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十tt大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺tt癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的tt第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50～tt70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍。膀胱癌癌主要是根据患者既往史、家族史，结合tt症状和查体做出初步判断，并进一步进行相关检查。检查方法包括尿常规检查、尿脱落细胞tt学、尿肿瘤标记物、腹部和盆腔B超等检查。根据上述检查结果决定是否行膀胱镜、静脉尿tt路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等检查明确诊断。其中，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方tt法。目前，膀胱癌尚没有有效早期诊断与预后指标。tt
基因芯片(Gene Chip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵，借tt助核苷酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。tt
基因芯片起源于20世纪80年代，近年来得到了迅猛的发展，但主要是应用于医药和研究tt领域，目前并没有将基因芯片技术应用于膀胱癌早期检测的报道。tt
发明内容tt
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了特异性好、灵敏度高、准确率高tt的用于检测膀胱癌的探针组及基因芯片。tt
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于检测膀胱癌的探针组，由探针tt1-探针25共25条探针组成，所述探针1-探针25的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列tt1-25。tt
用于检测膀胱癌疾病的探针组，包括25个基因片段，其中第25种基因片段为质控基因，tt25个基因片段是针对膀胱癌的25个指标而设计的，利用25个基因片段共同来检测膀胱癌基tt因表达谱的改变，进而对膀胱癌进行侦检和预后监控。tt
25种基因片段如表1和表2所示，其中表1为序列1-13，表2为序列14-25：tt
表1tt
表2tt
25个基因片段的详细序列如序列表1-2中序列1-25所示。tt
上述用于检测膀胱癌的探针组可应用于生物芯片技术(包括基因芯片技术、蛋白芯片技tt术、组织芯片技术、细胞芯片技术等)、聚合酶链反应(PCR)、核酸分子杂交技术以及其tt他病原体基因诊断技术。tt
本发明的第二个目的是提供了一种用于检测膀胱癌的基因芯片，所述基因芯片是将上述tttttt的寡核苷酸探针1-25通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。tt
进一步的，上述的一种用于检测膀胱癌的基因芯片，所述探针1-探针24为检测寡核苷tt酸探针，探针25为质量控制寡核苷酸探针。tt
进一步的，上述的一种用于检测膀胱癌的基因芯片，所述基因芯片中的探针标记技术为tt核素标记、生物素标记、地高辛标记、荧光素标记、胶体铁标记、胶体金标记或联合标记。tt
本发明的第三个目的是提供了上述的用于检测膀胱癌的基因芯片在检测早期膀胱癌中tt的应用。tt
进一步的，上述的应用，所述检测早期膀胱癌过程中，检测样本为膀胱癌新鲜组织或膀tt胱癌患者的尿脱落细胞。tt
本发明的有益效果为：本发明所提供的将探针组和基因芯片应用于膀胱癌的早期检测在tt我国尚属首次，这将会极大促进膀胱癌早期诊断的发展，具体有以下优点：tt
1、特异性好：现有的膀胱癌的诊断仅是检测一个或几个指标缺乏特异性，所以容易引tt起误诊，尤其是早期膀胱癌的误诊率更是高达70％以上。本发明用于检测膀胱癌的新的基因tt组合可同时检测膀胱癌病原体的25个指标，特异性高达95％；tt
2、灵敏度和准确率高：敏感性达95％，临床符合率(准确率)达95％；tt
3、可对膀胱癌进行快速侦检和预后监控；tt
4、可用于各种类型的膀胱癌的诊断和预后监控，尤其可用于早期膀胱癌的诊断。tt
为保证基因芯片的质量，应注意以下事项：tt
1)样品核酸的提取：提取的核酸必须具有较高的纯度(OD260/0D280比值应大于1.50)和tt一定的量(应10ng-100ng)，以保证标记的质量和特异性扩增，如果纯度不够，可能导致后tt面的杂交出现非特异点；tt
2)样品核酸的标记：掺入的标记物必须达到一定的浓度(每个反应掺入的标记物为0.1-1ttμg)，以保证杂交点的灵敏度，若浓度不够，杂交结果常会出现假阴性；tt
3)同源核酸杂交：应掌握杂交温度控制在42℃左右，温度过低，会出现非特异杂交点，tt使特异性降低，温度过高，则往往出现假阴性。tt
膀胱癌早期诊断基因芯片和常规检测疾病的方法向比较具有以下优点：tt
1、准确，基因芯片设有阳性和阴性对照，可避免环境和人为因素造成的错误的诊断；tt
2、快速，常规检测需要一周的时间，而芯片只需8个小时左右；tt
3、灵敏，芯片的灵敏性(0.1pg)可比PCR技术高1000倍；tt
4、信息量大：PCR一次只检一种指标，而芯片一次可检测20～30种指标。tt
附图说明tt
图1为芯片样式设计图。tt
图2为芯片检测结果。tt
具体实施方式tt
实施例1：tt
一、用于检测膀胱癌的探针组的基因芯片的制备：tt
1、材料和方法tt
1.1材料：tt
1.1.1试剂：tt
主要试剂RNA提取试剂(Trizol Reagent)、饱和酚、DEPC、DNA marker、Oligod(T)18、ttDIG DNA标记试剂盒、地高辛杂交检测试剂盒，均购自上海生工。逆转录酶M-MLV(RNase H-)、ttTaq酶、Agarose Gel、RNA酶抑制剂、琼脂糖(Agarose)、DNA纯化试剂盒，均购自大连tt宝生物公司。引物由上海生工生物工程公司合成；其他试剂均为国产分析纯。tt
1.1.2临床资料：tt
(1)膀胱癌新鲜组织样本：组织标本取自甘肃省人民医院在2011年10月-2013年4月期tt间手术切除的新鲜膀胱癌标本,前均未做化疗或放疗,术后经病理证实,同时距肿瘤边缘5－tt10cm以上切取正常组织(术后病理证实无癌细胞侵润)作为对照。标本离体后5min内即投入tt液氮罐内冻存。tt
(2)膀胱癌患者尿脱落细胞样本：检测样本为甘肃省人民医院在2012年4月-2013年4月tt期间膀胱癌及正常人尿脱落细胞样本的100例细胞检测样本(其中膀胱癌样本50例)分别用tt芯片方法进行对比检测，保存于-80℃。tt
1.1.3仪器和设备：tt
仪器和设备：PCR仪购自杭州郎基；点样器；杂交仪；扫描仪均为自行设计，委托生产tt厂家制造。tt
1.2引物设计：tt
确定膀胱癌肿瘤标志物数条序列，然后使用DNAStar分析设计出这些引物。具体引物如tt上述表1-表2所示。tt
1.3基因芯片的制作：tt
1.3.1膀胱癌核酸的提取(膀胱癌新鲜组织样本)：tt
(1)从液氮中取出冻存的新鲜组织200mg,在液氮预冷的研钵中研碎组织,采用Trizoltttttt法提取组织总RNA,测定总RNA纯度并用Oligo dT纤维素层析法纯化mRNA。tt
(2)使用逆转录酶M-MLV反转录合成cDNA的第一链,用于制备探针模板。tt
1.3.2核酸探针的扩增：tt
(1)以1.3.1所获得的核酸为模板，使用表1-2所设计的引物，分别扩增出片断，以tt作为探针。扩增片段具体序列为序列表中探针1-探针25所示序列。tt
(2)PCR反应体系50.0μL,包括10×Buffer5.0μL,25mmol dNTPmixture0.5,TaqDNA酶tt1.0μL,目的引物上下游各1.0μL,cDNA模板1.0μL,三蒸水40.5μL，反应条件:94℃预变性tt5min；94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸60s,30个循环；72℃10min后终止反应。tt
(3)利用小片段DNA纯化试剂盒对获得的25种基因片段PCR产物进行纯化。tt
1.3.3点膜：tt
通过微量点样器将所获得的探针点在预处理的尼龙膜上。tt
根据图1所示芯片样式设计图，用手动点样仪进行芯片点样。操作程序:tt
1)GAPDH,ACTIN,CYCLIND1等25种基因的点样液在100℃变性5min，迅速置冰，冰冷10mintt以上；tt
2)尼龙膜(购自Amersco公司，带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10min，悬空晾干；tt
3)每点1μl把上述探针片段点在尼龙膜上(每张尼龙膜面积大约20cm2)；tt
4)湿膜在紫外灯下照5min，取出让膜自然干燥。tt
1.4样品的处理：tt
1.4.1核酸的提取(膀胱癌患者尿脱落细胞样本)：tt
1)膀胱癌新鲜组织样本方法同1.3.1，使用引物5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA ttCGC GGG-3’和5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT(30)n-1n-3，反转录合成cDNA的tt第一链；tt
2)采用Trizol法提取膀胱癌患者宫腔脱落细胞样本总RNA,使用引物5，-AAG CAG TGG TAA ttCAA CGC AGA GTA CGC GGG-3’和5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC AGA GTA CT(30)n-1n-3，tt反转录合成cDNA的第一链。tt
1.4.2核酸的扩增：tt
1)以1.4.1所获得的核酸为模板，使用设计的通用引物5，-AAG CAG TGG TAA CAA CGC ttAGA GT-3扩增出基因片段，以作为检测样品；tt
2)PCR反应体系25.0μL,包括10×Buffer 2.5μL,10mmol dNTPmixture 0.5μl,地tt高辛-11-dUTP 0.5μl，TaqDNA酶0.5μL,通用引物上下游各0.5μL,cDNA模板5.0μL,tttttt三蒸水15μL，反应条件:94℃预变性5min；94℃预变性30s,65℃退火30s,68℃延伸tt500s,30个循环；72℃10min后终止反应。tt
1.5杂交：tt
加500μl预杂交液于基因芯片上，42℃处理40min，取20μl1.4.2的产物于1.5ml的离tt心管内,100℃变性10min.-20℃冷却5min,加杂交液450μl,混匀,于基因芯片上,42℃杂交tt1h。分别用2×SSC,0.1×SDS和0.1×SSC,0.1×SDS各洗三次，加400μl3％的BSA,42℃封闭tt30min，450μl缓冲液中加1.6μl AV-AP,42℃酶联20min，先用洗涤液洗膜三次,后加入显色tt液(450μl底物液+1.6μl BCIP+1.6μl NBT),常温或42℃显色3～5min。用蒸馏水或自来水tt冲洗,终止显色。tt
1.6杂交结果的分析：tt
将杂交完毕晾干的DNA阵列用自制的芯片扫描仪进行扫描分析，根据大量样品的分析，tt设置读数0.05以下为阴性，0.1以上为阳性，两者之间为可疑。打印诊断报告。tt
样品同时进行PCR或RT-PCR和其他检测方法以进行比较，结果如表3所示。tt
表3tt
阳性和阴性对照：分为人的GAPDH,ACTIN,CYCLIND1基因片段,加入反应系统,以监视标记tt和杂交、显色系统是否有效。tt
2、结果：tt
2.1准确率检测的结果：tt
针对性的分别对GAPDH,ACTIN,CYCLIND1等25种基因进行了检测，杂交结果：30张芯片分tt别出现GAPDH,ACTIN,CYCLIND1等25种基因特异性杂交点,检测结果如图2，没有非特异性杂tt交点的出现。tt
2.2检出率的检测结果：tt
利用膀胱癌基因诊断芯片对50例患者的尿脱落细胞进行检测，发现48例检测为阳性，1tt例为弱阳性，1例为阴性；其特异性达95％、敏感性达95％、临床符合率(准确率)达95％，基tt本上达到设计要求。tt
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管tttttt参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前tt述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发tt明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围tt之内。tt
序列表
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tcacaccatt gaaaccacta gttctgtccc cccaggagac ctggttgtgt gtgtgtgagt 180t
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