用于鉴别和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法

用于鉴别和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法

　　本申请是申请号为201080039297.2，申请日为2010年8月13日，发明名称为“用于tt鉴别和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法”的中国专利申请的分案申请。tt

　　技术领域tt

　　本发明涉及用于筛选、表征和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法，由此获得的ω-转氨tt酶及其在各种氨基转移过程中的应用。tt

　　背景技术tt

　　手性胺在制药、农用化学和化学工业中发挥着重要作用。它们常被用作中间体或合成tt子(synthones)以制备各种生理学，如药学活性物质，如头孢菌素或吡咯烷衍生物。在手性tt胺的众多应用中，仅有一种特定的光学活性形式((R)或(S)对映体)具有生理学活性。因此，tt需要提供一种制备光学活性形式的手性胺的方法。tt

　　这些需求通过以下方法得到部分满足，即通过加入手性羧酸使非对映体盐结晶来制备tt手性胺(Breuer et al.,Angewandte Chemie(2004)116,806-843)。其它化学方法使用通过还原tt含C＝N双键的前手性前体的对映选择性合成。tt

　　在已用于合成光学活性氨基酸和胺的若干酶促方法中，由于其用于光学活性胺的不对tt称合成的潜力，ω-转氨酶(ω-TAs)最近已得到更多关注，其常被用作多种药物制备的结构tt单元(building blocks)。tt

　　ω-转氨酶是PLP(磷酸吡哆醛)依赖性酶，其催化氨基转移反应。当采用ω-转氨酶时，tt主要可经由两种反应策略来制备所谓的对映体富集和/或纯光学活性胺：(i)从酮起始的不tt对称合成，和(ii)从外消旋胺起始的动力学拆分。虽然ω-转氨酶总体上显示出良好的对映tt选择性，但它们尚未被频繁地用在不对称合成中，尽管在不对称合成中理论上可能的产率tt是100％。使用ω-转氨酶的不对称合成的一个特殊要求是平衡向产物侧移动，特别是当使tt用诸如丙氨酸等氨基酸作为氨基供体时，因为在此情况下平衡状态在底物(酮、丙氨酸)侧，tt而不在产物(胺、丙酮酸盐)侧；另一个要求是酶必须具有最佳的对映选择性，而ω-转氨酶tttttt并非一向如此。因此，ω-转氨酶主要用于外消旋胺的动力学拆分，其中不需要最佳的对映tt选择性。因此，虽然已经研究了外消旋胺的动力学拆分，但50％最大产率的限制很大程tt度上阻碍了其应用。另一方面，不对称合成需要将不利的平衡向合成光学纯胺的单个对映tt体的方向移动，这是能够在工业规模上使用转氨酶的有效方法的一个重要先决条件。WO tt2007/093372公开了这类方法。tt

　　EP 0 987 332 A1公开了通过微生物酶，特别是源自节杆菌(Arthrobacter sp.)的(R)-选择tt性ω-转氨酶来制备光学活性氨基化合物，即(R)-氨基化合物的方法。EP 1 038 953 A1公开tt了另一种(R)-选择性ω-转氨酶，但其源自金色分支杆菌(Mycobacterium aurum)。tt

　　Iwasaki等(Biotechnol.Let.2003(25),1843-1846)、Koszelewski等(Adv.Synth.Catal.tt2008(350),2761-2766)和Iwasaki等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2006(69),499-505)公开了tt源自节杆菌的R-特异性转氨酶。通常通过选择得自于如土壤样品的微生物并在培养中将tt其富集来完成提供有用(S)-或(R)-选择性转氨酶的微生物的鉴别(Jun等,App.Microbiol.ttBiotechnol.2004(70),2529-2534和Shin等(Biosc.Biotechnol.Biochem.2001(65),tt1782-1788))。特别地，全部所述的R-选择性ω-转氨酶均通过富集培养获得。此种方法耗tt时，这是因为对于有效的方法，通常优选在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)等异源生物体tt中过表达酶。这需要从野生型生物体中分离基因序列，但DNA序列的克隆不总能成功并tt且是极为耗时的过程。tt

　　特别地，在工艺开发和新型ω-TA的鉴别期间，酶的纯化及其酶促性质的表征很受人tt关注。然而，由于通常通过诸如HPLC或毛细管电泳(CE)等低通量方法确定ω-TA活性，tt所以在一定程度上，酶性质的确定通常是限速步骤。tt

　　通常，相比于(S)-选择性ω-转氨酶，可用的(R)-选择性ω-转氨酶的数量更受限制。这tt与对(R)-选择性ω-转氨酶的高需求形成了鲜明的对比，所述(R)-选择性ω-转氨酶对于各种tt手性胺的(R)-对映体的不对称合成非常适合。因此，仍需要提供其他(R)-选择性ω-转氨酶tt以及获得它们的装置和方法，从而产生诸如用于制药或农用化学应用中的R-对映体，特tt别是光学活性胺，但这些至今仍根本无法获得或无法以经济上可行的方法，优选以工业规tt模获得。tt

　　发明内容tt

　　因此，基于以上技术问题，本发明提供了简单、快速和可靠的装置和方法，以鉴别、tt表征和获得(R)-选择性ω-转氨酶，特别是用于生产所需的(R)-对映体，优选光学纯形式，tttttt所述装置和方法优选适用于工业规模的鉴别、表征和制备。tt

　　本发明通过提供独立权利要求中的教导，特别是所要求保护的方法以及由此获得的产tt品和应用解决了其技术问题。tt

　　因此，在具体实施方式中，本发明的教导提供了用于制备(R)-选择性ω-转氨酶(也称tt为ω-TA)的方法，其包括以下步骤：tt

　　a)提供至少一种转氨酶或裂解酶，优选属于折叠IV型的PLP依赖性酶(fold-type IV of ttPLP-dependent enzymes)的转氨酶或裂解酶的至少一个查询生物分子序列(query ttbiomolecule sequence)，和至少一个生物分子库，tt

　　b)用所述查询生物分子序列检索所述生物分子库，以鉴别出第一靶生物分子序列组，tt其中以氨基酸水平计算，所述第一靶生物分子序列与所述查询生物分子序列具有至少tt20％，优选32％的序列相同性，tt

　　c)在所述第一靶生物分子序列组中选择第二生物分子靶序列组，所述第二生物分子tt靶序列组在氨基酸水平上不包含以下氨基酸序列基序(motives)c1)至c3)中的至少一种，其tt中tt

　　c1)在95位至97位的氨基酸序列Tyr Xa1Xa2，其中Xa1为氨基酸Ile、Val、ttLeu、Met、Phe，且Xa2为氨基酸Arg或Lys，或者tt

　　c2)在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，优选为常tt规氨基酸，和在105位至111位，优选在107位至109位区域中的氨基酸序列Arg Xaa ttXa3，其中Xa3为氨基酸，优选为His，或者tt

　　c3)在38位的Thr、在97位的Lys和在107位至109位的氨基酸序列Arg Xa4 ttXa5，其中Xa4为氨基酸，优选为Gly，且Xa5为氨基酸，优选为Tyr，tt

　　而包含：tt

　　c4)在95位除Tyr、Arg、Lys外的另一种氨基酸，或在95位的Tyr，但在97tt位无Arg或Lys，且tt

　　c5)在40位无Lys或Arg，且tt

　　c6)在161位至165位区域中，优选在163位的Lys，tt

　　以鉴别出第二靶生物分子序列组，和tt

　　d)提供，优选制备这样的生物分子，其具有在步骤c)中鉴别的第二生物分子靶序列，tt且为具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白或至少部分编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性tt的蛋白。tt

　　术语“为……或至少部分编码蛋白的生物分子”优选是指所述生物分子可为具有(R)-tt选择性ω-转氨酶活性的蛋白，或在此生物分子为核苷酸序列的情况下，至少部分的所述tt核苷酸序列编码所述蛋白，优选全长蛋白。因此，在所提供的生物分子为核苷酸序列分子tt的情况下，至少部分的所述核苷酸序列编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白，因此可tt能另一部分的所述核苷酸分子具有一些其它功能，如调节或复制功能。因此，术语“提供tt这样的生物分子，其具有在步骤c)中鉴别的第二生物分子靶序列，且为具有(R)-选择性ω-tt转氨酶活性的蛋白或至少部分编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白”优选等同于术语tt“提供这样的生物分子，其具有在步骤c)中鉴别的第二生物分子靶序列，所述生物分子可tt为具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白，或可为包含编码所述蛋白的序列的核苷酸序列分tt子，只要所述蛋白具有(R)-选择性ω-转氨酶”。tt

　　在本发明的一个实施方式中，在步骤c2)中，Arg Xaa Xa3-基序可与107位至109位tt相差1-2个氨基酸，即Arg Xaa Xa3-基序可在105位至111位。tt

　　在本发明的一个实施方式中，在步骤c6)中，Lys的位置可与163位相差1-2个氨基tt酸，即Lys可在161位至165位。tt

　　在本发明上下文中，除非另有说明，所给出的每个氨基酸序列，无论使用何者，特别tt是给出的氨基酸序列基序，或DNA序列或DNA序列基序，都是从氨基端至羧基酸，或tt5′至3′方向。优选地，无论使用何者，以给定方向给出的序列均作为连续片段给出，而没tt有任何插入的核苷酸或氨基酸。tt

　　在本发明的优选实施方式中，步骤a)中所使用的至少一种转氨酶的至少一个查询生tt物分子序列优选为(R)-选择性ω-转氨酶。在另一优选实施方式中，步骤a)中所使用的至少tt一种转氨酶的至少一个查询生物分子序列选自(R)-选择性ω-转氨酶、支链氨基酸氨基转移tt酶(BCAT)和D-氨基酸转氨酶(DATA)。优选地，所述支链氨基酸氨基转移酶来自大肠杆菌。tt在本发明的优选实施方式中，步骤a)中所使用的至少一种裂解酶的至少一个查询生物分tt子序列为氨基脱氧分支酸裂解酶(ADCL)。tt

　　本发明提供了以快速、有效、简单、可靠且简便的方式制备(R)-选择性ω-转氨酶的方tt法。因此，本发明能够鉴别并制备(R)-选择性ω-转氨酶，这是以前不知道或无法达到的，tt由此获得了提供手性胺，优选(R)-对映体的多种途径，特别是非常有效的不对称合成途径。tt与预期相反，其能够成功地显示，事实上即便是与已知的(R)-选择性ω-转氨酶具有低序列tt相同性，如仅35％序列相同性的蛋白也为(R)-选择性ω-转氨酶。优选地，本发明能够以特tt别有利且预想不到的方式提供了来自土曲霉(Aspergillus terreus)和百脉根根瘤菌tttttt(Mesorhizobium loti)的(R)-选择性ω-转氨酶，其中来自曲霉(Aspergillus)的转氨酶为第一真tt核生物ω-转氨酶且以(R)-选择性的方式转化底物。tt

　　基本上，本发明基于以下教导：即便是与已知转氨酶或裂解酶，特别是(R)-选择性ω-tt转氨酶具有低序列相同性的蛋白或其编码核苷酸序列也能用作潜在来源以鉴别和制备tt(R)-选择性ω-转氨酶，其中通过区分不希望的蛋白并由此阳性选择在氨基酸序列中显示导tt致所需酶促活性的特定序列基序的蛋白来筛选和制备推定的(R)-选择性ω-转氨酶。因此，tt本发明具体地使用了特定的结构特征，特别是推定的(R)-选择性ω-TA中特定氨基酸的缺tt失和存在，以鉴别和制备(R)-选择性ω-转氨酶。tt

　　因此，在本发明方法的第一步骤a)中，提供了至少一种转氨酶或裂解酶，如已知的(R)-tt选择性ω-转氨酶的查询生物分子序列，或至少此类裂解酶或转氨酶，优选(R)-选择性ω-tt转氨酶的特征序列部分，其特别优选能够鉴别折叠IV型的PLP依赖性酶，以及至少一种tt生物分子库。优选地，查询生物分子序列为转氨酶或裂解酶，特别为(R)-选择性ω-TA的ttORF(开放阅读框)，其编码核苷酸序列或其特征部分。在另一实施方式中，查询生物分子tt序列为ORF-氨基酸序列本身或其特征部分。tt

　　在本发明的上下文中，至少一种转氨酶或裂解酶，特别是已知的(R)-选择性ω-转氨酶tt的查询生物分子序列的特征部分为这样的生物分子序列，其DNA序列分子的形式在以下tt条件下与全长查询生物分子序列，特别是与ORF的DNA序列杂交。tt

　　用于诸如DNA等核酸杂交的方法是已知的，且描述在如Molecular Cloning,Third ttEdition(2001)；Methods for General and Molecular Bacteriology,ASM Press(1994)；ttImmunology methods manual,Academic Press(Molecular)和许多其它标准教材中。tt

　　严谨条件下杂交的实例如下。在42℃下，将其上固定有核酸的滤器和用作探针的核tt酸在包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM氯化钠和75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、tt5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/l变性鲑鱼精子DNA的溶液中孵育过夜。孵育tt后，将滤器用0.2×SSC溶液(约65℃)中清洗。可通过调节甲酰胺浓度(随着甲酰胺浓度降tt低，条件变得较不严谨)以及改变盐浓度和温度条件来修改这些严谨性杂交条件。tt

　　在较不严谨条件下的杂交通过例如在37℃下，将其上固定有核酸的滤器和用作探针tt的核酸在包含6×SSCE(20×SSCE：3mol/l氯化钠、0.2mol/l磷酸二氢钠和0.02mol/l EDTA，ttpH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺和100μg/l变性鲑鱼精子DNA的溶液中孵育过夜，并将tt滤器用含0.1％SDS的1×SSC溶液(50℃)清洗来进行。tt

　　在特别优选的实施方式中，本发明将术语“至少一种转氨酶或裂解酶的至少一个查询tttttt生物分子序列”理解为这样的生物分子序列，其适合用于根据本文定义的序列基序c1)至ttc6)的存在或缺失来选择生物分子序列。因此，这类查询生物分子序列为用于筛选和鉴别tt下述生物分子序列的序列，所述生物分子序列在氨基酸水平上不包含氨基酸序列基序c1)tt至c3)中的至少一个，且在氨基酸水平上包含序列基序c4)、c5)和c6)。这类查询生物分子tt序列可体现为氨基酸序列信息、或DNA序列分子、或DNA序列信息。tt

　　在优选实施方式中，步骤a)所用的查询生物分子序列的特征部分包含，优选由以下tt组成：转氨酶，优选(R)-选择性ω-转氨酶，或裂解酶的ORF的30位至170位区域，最优tt选30位至120位。tt

　　在随后的步骤b)中，使用所述查询生物分子序列检索所述生物分子库以鉴别出第一tt靶生物分子序列组，基于氨基酸水平，所述第一靶生物分子序列组与所述查询生物分子序tt列具有至少20％的的序列相同性，优选25％，优选32％，优选至少33％，最优选34％，tt至少35％，至少36％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％和至少80％，至少90％tt或至少95％的序列相同性，且其中所述第一靶生物分子组代表从步骤a)中所用生物分子tt库的第一次选择。所述的序列相同性优选为所述查询生物分子序列的ORF的至少特征部tt分，优选基本完整，特别是完整ORF的至少特征部分与所筛选生物分子序列的ORF的至tt少特征部分，优选基本完整，特别是完整ORF的至少特征部分之间的序列相同性。在所tt述步骤b)后，在此第一靶生物分子序列组中，在步骤c)中选择那些序列，其不包含95位tt至97位的作为序列基序c1)的氨基酸序列Tyr Xa1Xa2，其中Xa1为氨基酸Ile、Val、Leu、ttMet、Phe，且Xa2为氨基酸Arg或Lys；或者其不包含97位至99位的作为序列基序c2)tt的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，优选常规氨基酸，且在105位至111位，tt优选107位至109位区域中，且不包含氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xa3为氨基酸，优tt选常规氨基酸，优选His；或者其不包含序列基序c3):38位的Thr、97位的Lys和107位tt至109位的氨基酸序列Arg Xa4 Xa5，其中Xa4为氨基酸，优选常规氨基酸，优选Gly，tt且Xa5为氨基酸，优选常规氨基酸，优选Tyr，以此来区分和排除体现出以上确定的序列tt基序c1)、c2)或c3)中至少一个的那些序列。在随后或同时进行的选择中，选择以下那些tt生物分子序列，所述生物分子序列根据序列基序c4)在95位显示为除Tyr、Arg、Lys外的tt其它氨基酸，或在95位显示为Tyr，但在97位不为Arg和Lys，且根据序列基序c5)在tt40位不为Lys和Arg，且根据序列基序c6)在161位至165位的区域中具有至少一个Lys，tt优选为一个Lys，优选在163位为Lys，以此选择和鉴别出第二生物分子靶序列组。由上tt述确定的序列基序鉴别和筛选出的第二靶生物分子序列组代表作为具有(R)-选择性ω-转tttttt氨酶活性的蛋白或编码具有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白的生物分子，从而提供所述具tt有(R)-选择性ω-转氨酶活性的蛋白。tt

　　在本发明的上下文中，转氨酶为催化氨基转移的磷酸吡哆醛依赖性酶，其优选属于折tt叠IV型。转氨酶归类为E.C.2.6.1.X。在本发明特别优选的实施方式中，转氨酶为(R)-选tt择性转氨酶，在优选实施方式中，特别地为ω-转氨酶。在本发明的上下文中，具有(R)-tt选择性ω-转氨酶活性的蛋白为下述蛋白，其能够在适合反应条件下催化诸如氨基等含氮tt基团从供体向受体的转移，例如(R)-选择性ω-转氨酶(β-丙氨酸丙酮酸转氨酶)即能如此。tt在本发明的上下文中，(R)-选择性ω-转氨酶优选为分类编号E.C.2.6.1.18的酶。tt

　　在本发明的上下文中，术语“光学活性的手性胺”与术语“对映体活性的手性胺”涉及相tt同的主題。这些术语特别是指基本上不含不良对映体的制备物，且在更优选的实施方式中tt是指不含不良对映体的制备物。因此，光学活性的手性胺基本上包含过量的一种对映体，tt或甚至仅由一种对映体组成。tt

　　特别地，在本发明的上下文中，光学活性的手性胺具有至少70％、80％、90％、91％、tt92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％和特别tt是至少99.9％的光学纯度。tt

　　在本发明中，光学纯度表示为一种对映体超过另一种对映体的过量％。因此，光学纯tt度％为(R)对映体和(S)对映体浓度之差除以两种对映体浓度之和(A的光学纯度％＝tt([A]-[B]):([A]+[B])x 100，其中A和B代表(R)对映体和(S)对映体的浓度，反之亦然)。tt

　　在本发明的上下文中，生物分子库为生物分子本身的来源或生物分子序列数据的集tt合，特别是多核苷酸或多肽序列数据的集合。tt

　　在本发明的上下文中，生物分子优选为携带遗传信息的多核苷酸分子，特别是DNAtt分子。在本发明另一优选实施方式中，生物分子为包含大量氨基酸的多肽，特别是蛋白。tt因此，生物分子库可为生物分子的物理来源，特别地可为基因库，特别是cDNA或基因tt组文库，或为有关所述生物分子的信息集合，特别是序列数据的集合，特别是氨基酸序列tt或多核苷酸序列数据的集合，特别是DNA序列数据的集合。tt

　　本发明也涉及生物分子序列、氨基酸序列、多核苷酸序列或核苷酸序列，特别是DNAtt序列，因此，所述措辞一方面是指物理物质本身，即蛋白、多肽或DNA分子，另一方面tt是指所述化学物质的信息内容，其中在多核苷酸的情况下，所述信息内容是指其核苷酸的tt类型、顺序和数量，且在多肽的情况下，所述信息内容是指形成所述多肽的单个氨基酸的tt类型、顺序和数量。tt

　　在本发明的上下文中，术语“生物分子”、“DNA分子”、“多核苷酸分子”、“多肽”或“蛋tt白”是指化学物质本身。在此情况下，本发明特别是指氨基酸序列信息、DNA序列信息、tt多核苷酸序列信息或生物分子序列信息，其不是指生物分子的物理形式，而是指其中所含tt的信息，即其组成物(即，氨基酸或核苷酸)的类型、顺序和数量。tt

　　在一个优选实施方式A)中，在其步骤a)至c)中，本发明适用于作为序列数据集合的tt生物分子库，在一个实施方式中，所述生物分子库为多核苷酸序列，特别是DNA序列的tt序列数据集合，或在另一个实施方式中，所述生物分子库为氨基酸序列的序列数据集合，tt两种序列数据集合均在步骤b)中用序列比对工具，优选如BLAST(基本的局部比对检索tt工具)进行检索，以鉴别出第一靶生物分子序列组(Altschul,S.F.et al.1990.J.Mol.Biol.tt215:403；Altschul,S.F.et al.1997.Nucleic Acid Res.25:3389-3402)。其它适合的程序包括威tt斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Grouptt(GCG),Madison,WI,USA)中的GAP、BESTFIT和FASTA。在进一步的步骤c)中，对所tt鉴别的第一生物分子序列组进行进一步的选择步骤，在此期间，使用所鉴别的序列基序由tt序列基序c1)至c3)进行否定地鉴别和选择，且由序列基序c4)至c6)来肯定地选择所希望tt的生物分子序列。一旦鉴别出第二组生物分子序列，本发明使用所述序列信息来制备对应tt的寡核苷酸或多核苷酸分子，如杂交引物，以在物理形式的生物分子库中筛选和选择编码tt在第二组中所鉴别的酶的DNA序列分子。因此，在优选实施方式中，步骤c)中所得的序tt列信息可用于从基因组DNA或cDNA文库中克隆对应的基因，以及在诸如大肠杆菌、酿tt酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)等中表达所述蛋白。在本发明tt另一优选实施方式中，步骤c)中所得的序列信息用于从头(de novo)合成所希望的(R)-选择tt性ω-转氨酶。在此类优选实施方式中，可以使用步骤c)中所得的序列信息，通过诸如优tt化的密码子应用和mRNA稳定性来合成基因，以及克隆和表达此基因。根据此类优选实tt施方式，可将包含DNA序列信息或氨基酸序列信息的生物分子库用作步骤a)中的至少一tt个生物分子库。在这种情况下，生物分子库包含DNA序列信息，所述信息或者已被翻译tt为氨基酸序列信息以根据步骤b)至c)来处理，其中氨基酸序列被用作查询生物分子序列tt和氨基酸序列基序，或者使用查询生物分子序列和被翻译回DNA序列信息的序列基序c1)tt至c6)在DNA序列库中实施所述步骤b)至c)。tt

　　在本发明的另一优选实施方式中，本发明的教导适用于实施方式B)的步骤a)中的生tt物分子库，所述生物分子库以物理形式的基因库存在，特别是以诸如cDNA、宏基因组或tt基因组文库等基因文库存在，使用编码至少一种(R)-选择性ω-转氨酶的全部或至少特征部tttttt分的DNA分子，以检索、鉴别和选择第一生物分子序列组，特别是DNA序列分子，其tt基于氨基酸水平计算与所述查询DNA序列分子具有至少20％，优选32％的序列相同性。tt随后的步骤c)优选在所述第一组DNA分子中进行，使用核苷酸分子引物来鉴别以及肯定tt和否定选择所希望序列基序c1)至c6)。tt

　　在本发明的上下文中，术语“序列基序”是指所要求保护的方法的步骤c)中具体鉴别的tt推定(R)-选择性ω-转氨酶的氨基酸序列的特异选择性特征。特别地，第一序列基序c1)为tt在95位至97位中鉴别的序列基序，其为此顺序的氨基酸序列Tyr Xa1Xa2，其中Xa1为tt氨基酸Ile、Val、Leu、Met、Phe，且Xa2为氨基酸Arg或Lys，且其根据本发明，其不tt应存在于最终选择的生物分子序列中。第二序列基序c2)为在97位至99位鉴别的序列基tt序，其为此顺序的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaa为氨基酸，和在105位至111位，tt优选在107位至109位区域的为此顺序的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，其中Xaa为氨基酸，tt且Xa3为氨基酸，优选为His，且其也不应存在于最终选择的生物分子序列中。第三序列tt基序c3)为这样的序列基序，其表征为在38位存在Thr、在97位存在Lys以及在107位tt至109位存在氨基酸序列Arg Xa4 Xa5，其中Xa4为氨基酸，优选为Gly，且Xa5为氨基tt酸，优选为Tyr，基序c3)不应存在于最终选择的生物分子序列中。tt

　　第四序列基序c4)要求在95位为除Tyr、Arg、Lys外的另一种氨基酸，或在95位为ttTyr，但在97位无Arg或Lys存在，从而使其适合充当本发明制备的推定的(R)-选择性ω-tt转氨酶。第五序列基序c5)要求在最终制备并鉴别的推定的(R)-选择性ω-转氨酶的40位不tt存在Lys和Arg。第六序列基序c6)要求在最终制备并鉴别的推定的(R)-选择性ω-TA的161tt位至165位存在至少一个Lys，优选存在一个Lys，优选在163位为Lys。tt

　　在本发明的上下文中，氨基酸位置的鉴别和定位确定如下所述。将第一靶生物分子序tt列彼此和与查询生物分子序列比对，优选多比对。比对可使用常规比对软件，如STRAP，tt特别是ClustalW，优选ClustalW3D完成。在另一个实施方式中，也可将序列成对地比对，tt即每个第一靶生物分子序列与查询生物分子序列比对。在优选实施方式中，将第一靶生物tt分子序列与大肠杆菌的BCAT比对。在另一优选实施方式中，将第一靶生物分子序列与tt本发明所用的另一查询生物分子序列，如(R)-选择性ω-转氨酶比对。tt

　　本发明中给出的氨基酸位置的注释通过对应序列基序在用作位置标准的查询生物分tt子序列中的位置来确定。上述比对将第一靶生物分子序列的对应氨基酸位置与存在于查询tt生物分子序列中的序列基序进行比对。tt

　　例如，使用大肠杆菌BCAT作为位置注释的标准，使用大肠杆菌BCAT的92位至100tttttt位的已知氨基酸序列，即TSAYIRPLI(SEQ ID no.9)来鉴别推定的ω-转氨酶中95位至99tt位，对所述推定的ω-转氨酶的序列基序c1)、c2)、c3)的缺失和c4)的存在进行分析。大肠tt杆菌BCAT的35位至42位的已知氨基酸序列，即VFEGIRCY(SEQ ID no.10)标记出用tt于序列基序c3)和c5)的位于38位的G的位置。大肠杆菌BCAT的氨基酸序列中的氨基酸tt序列DVGMGVNP(SEQ ID no.11)标记出用于105位至111位的序列基序c3)的104位至tt111位。已知大肠杆菌BCAT的159位至167位的氨基酸序列PTAAKAGGN(SEQ ID no.12)tt标记出用于序列基序c6)的163位的K。tt

　　因此，在本发明的优选实施方式中，生物分子为蛋白，且生物分子序列为氨基酸序列。tt因此，在一个优选实施方式中，生物分子库为库，特别是数据库，所述库是具有各种蛋白tt信息，特别是氨基酸序列信息的集合的库。优选的数据资料库为NCBI蛋白数据库，ttUniProtKB/SwissProt和Uni-ProtKB/TrEMBL数据库。tt

　　在优选实施方式中，生物分子也可为DNA分子，且生物分子序列也可为DNA序列。tt因此，在一个优选实施方式中，所述生物分子库是具有各种多核苷酸序列信息，特别是ttDNA序列信息的集合的库，特别是数据库。tt

　　在优选实施方式中，本发明使用上述方法，其中所述生物分子库为生物分子数据库，tt且在步骤b)中使用生物分子序列比对程序，特别是BLAST检索所述生物分子数据库。在tt优选实施方式中，可预期如果生物分子库为生物分子数据库，则在步骤b)中使用氨基酸tt序列(如果生物分子数据库为氨基酸序列数据库)，或使用DNA序列(如果生物分子数据库tt为DNA序列数据库)检索所述生物分子数据库。tt

　　本发明预期通过转氨酶的从头合成，或借助引物(在第二生物分子序列的基础上定义)tt从物理基因库中分离编码所希望转氨酶的多核苷酸，以最终在步骤d)中提供生物分子，tt优选DNA分子或氨基酸序列分子，即蛋白。将所得多核苷酸，特别是DNA序列分子用tt于在合适条件下，在合适培养基中表达所希望的转氨酶。tt

　　本发明还涉及筛选和鉴别(R)-选择性ω-转氨酶的方法，包括以上确定的步骤a)至c)，tt特别是提供至少一种(R)-选择性ω-转氨酶的至少一个查询生物分子序列和至少一个生物tt分子库，用所述查询生物分子序列检索所述生物分子库以鉴别出第一靶生物分子序列组，tt其中以氨基酸水平计算，第一生物分子序列与所述查询生物分子序列具有至少20％、优tt选25％、优选32％的序列相同性，在第一靶生物分子序列组中选择以下生物分子序列，tt所述生物分子序列在氨基酸水平上不包含c1)至c3)中的任一个序列基序，其中c1)为在95tt位至97位的氨基酸序列Tyr Xa1 Xa2，其中Xa1为氨基酸Ile、Val、Leu、Met、Phe，且ttttttXa2为氨基酸Arg或Lys，或者c2)为在97位至99位的氨基酸序列Tyr Xaa Gln，其中Xaatt为氨基酸，和在105位至111位，优选在107位至109位区域的氨基酸序列Arg Xaa Xa3，tt其中优选Xa3为氨基酸，优选为His，或者c3)为在38位的Thr、在97位的Lys和在107tt位至109位的氨基酸序列Arg Xa4 Xa5，其中Xa4为氨基酸，优选为Gly，且Xa5为氨基tt酸，优选为Tyr，且所述生物分子序列务必包含序列基序c4)、c5)和c6)，其中c4)为在95tt位除Tyr、Arg、Lys外的氨基酸，或在95位为Tyr，但在97位无Arg或Lys，且c5)在40tt位无Lys或Arg，且c6)为在161位至165位区域，优选在163位的Lys，以鉴别出第二靶tt生物分子序列组，所述第二靶生物分子序列组为(R)-选择性ω-TA的生物分子序列。tt

　　在本发明的进一步的优选实施方式中，本发明的教导提供了可根据本发明制备方法获tt得的(R)-选择性ω-转氨酶。特别地，本发明提供了蛋白和DNA序列，特别是DNA分子，tt其编码来自百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)和土曲霉(Aspergillus terreus)的所述蛋白，如ttSEQ ID no.1和2所确定百脉根根瘤菌的蛋白以及SEQ ID no.3和4所确定的土曲霉的蛋tt白。在特别的和最优选的实施方式中，本发明提供了这样的教导，即可根据本发明获得或tt制备的(R)-选择性ω-转氨酶，如SEQ ID no.1和3中确定的那些，可用在转氨反应中，特tt别是可用在制备光学活性的手性胺，优选手性胺的(R)-对映体的方法中，包括将至少一个tt氨基受体和至少一个氨基供体与本发明的(R)-选择性ω-转氨酶(特别是SEQ ID no.1或3)tt反应，并获得光学活性的手性胺。在优选的实施方式中，用于制备光学活性的手性胺的方tt法为使用的含酮基的化合物，优选酮，和氨基供体的不对称合成。在另一优选实施方式中，tt所述制备方法使用动力学拆分反应。氨基供体优选为外消旋胺的混合物，而氨基受体优选tt作为离析物(educts)的酮。tt

　　在本发明的优选实施方式中，通过使用本发明的(R)-选择性ω-转氨酶，在从酮起始的tt不对称合成中合成光学活性的手性胺，向所希望的光学活性的手性胺，即(R)-对映体的优tt选转化率为至少70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％和最优选100％。tt

　　在本发明的另一优选实施方式中，将本发明的(R)-选择性ω-转氨酶用在从外消旋胺起tt始的动力学拆分反应中，向光学活性的手性胺，优选(S)-对映体的优选转化率为至少30％、tt40％、45％、46％、47％、48％、49％，特别是50％。tt

　　用于分析光学纯度和转化率的浓度可通过使用诸如HPLC、毛细管电泳(CE)、气相色tt谱(GC)或光度测定或荧光测定法来测定。tt

　　因此，在优选实施方式中，本发明涉及用于制备光学活性手性胺的方法，所述方法包tt括在转氨酶，特别是(R)-选择性ω-转氨酶，优选根据本发明的(R)-选择性ω-转氨酶存在下，tttttt将包含酮基的氨基受体化合物与胺的外消旋混合物反应，以获得手性胺的(S)-对映体。tt

　　在本发明的另一优选实施方式中，提供了制备光学活性的手性胺，特别是所述胺的tt(R)-对映体的方法，所述方法包括在(R)-选择性ω-转氨酶，特别是可根据本发明获得的(R)-tt选择性ω-转氨酶存在下，将包含酮基的氨基受体化合物和氨基供体反应，以获得胺的(R)-tt对映体。tt

　　在本发明的上下文中，氨基受体为这样的分子，其能够接受由转氨酶，特别是ω-转tt氨酶从氨基供体转移的氨基。在本发明特别优选的实施方式中，氨基受体包含酮官能团tt(ketone functionality)。tt

　　在本发明特别优选的实施方式中，氨基受体选自苯丙酮酸或其盐、丙酮酸或其盐、苯tt乙酮、2-酮戊二酸盐、3-氧代丁酸盐、2-丁酮、3-氧代吡咯烷(3-OP)、3-吡啶基甲基酮tt(3-PMK)、3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)、3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)、N-1-boc-氧代哌啶酮、ttN-1-boc-3-氧代吡咯烷(B3OP)、3-氧代-哌啶、N-1-boc-3氧代哌啶(B3OPi)、1-Cbz-3-氧代tt哌啶(C3OPi)、1-Cbz-3氧代吡咯烷(C3OP)、烷基-3-氧代-丁酸酯(butonoates)、甲氧基丙酮tt和1-氧代四氢萘酮组成的组。tt

　　在本发明的上下文中，氨基供体为这样的分子，其能够使用转氨酶，特别是ω-转氨tt酶向氨基受体提供氨基。在特别优选的实施方式中，氨基供体为胺或氨基酸。tt

　　在特别优选的实施方式中，氨基供体选自β-丙氨酸、丙氨酸、α-甲基苄胺(α-MBA)、tt谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、3-氨基丁酸、异丙胺、2-氨基丁烷和γ-氨基丁酸或其中任意tt一种的盐，如氯化物。在特别优选的实施方式中，所得的酮产物可为苯丙酮酸或其盐、丙tt酮酸或其盐、乙醛酸或其盐、苯乙酮、2-酮戊二酸盐、丙酮、3-氧代丁酸、2-丁酮、氧代tt丁酸盐、2-丁酮、3-氧代吡咯烷(3-OP)、3-吡啶基甲基酮(3-PMK)、3-氧代丁酸乙酯(3-OBEE)、tt3-氧代戊酸甲酯(3-OPME)、N-1-boc-氧代哌啶酮和N-1-boc-3-氧代吡咯烷(B3OP)或其中任tt意一种的盐，如氯化物。tt

　　在另一优选实施方式中，本发明涉及制备光学活性手性胺的方法，所述光学活性手性tt胺选自具有光学活性氨基的胺的组，特别是具有烷基、支链烷基或芳基烷基的胺。特别地，tt这些胺，特别是单环或二环胺为5元或6元环的胺，或S-、O-或N-取代的杂环烃或芳胺，tt特别是烷基或烷氧基取代的芳胺。在优选实施方式中，所得的手性胺选自苯丙氨酸、丙氨tt酸、3-氨基哌啶、烷基-3-氨基-丁酸盐、3-氨基吡咯烷(3-AP)、3-吡啶基-1-乙胺(3-PEA)、ttN-1-boc-3-氨基吡咯烷(B3AP)、N-1-boc-3-氨基哌啶(B3APi)、1-Cbz-3-氨基哌啶(C3APi)、tt1-Cbz-3-氨基吡咯烷(C3AP)、3-氨基丁酸乙酯(3-ABEE)、3-氨基戊酸甲酯(3APME)、α-甲tttttt基苄胺(α-MBA)、1-氨基四氢化萘、3,4-二甲氧基苯基丙酮、α-甲基-4-(3-吡啶基)-丁胺、γ-tt氨基丁酸盐、谷氨酸盐、异丙胺、β-氨基丁酸盐、仲丁胺、甲氧基异丙胺、3-氨基吡咯烷tt的衍生物、1-N-Boc-3-氨基哌啶、头孢菌素和头孢菌素的衍生物组成的组。tt

　　在特别优选的实施方式中，本发明由此预见到将3OP与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基tt供体反应以提供光学活性的(R)-3AP。tt

　　在另一优选的实施方式中，本发明预见到将3-PMK与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供tt体反应以提供光学活性的(R)3-PEA。tt

　　在本发明的另一优选实施方式中，本发明预见到将3-OBEE与(R)-选择性ω-转氨酶和tt氨基供体反应以提供光学活性的(R)3-ABEE。tt

　　在另一优选的实施方式中，本发明预见到将3-OPME与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基tt供体反应以提供光学活性的(R)3-APME。tt

　　在另一优选的实施方式中，本发明预见到将B3OP与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体tt反应以提供光学活性的(R)-B3AP。tt

　　在另一优选的实施方式中，本发明预见到将B3OPi与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供tt体反应以提供光学活性的(R)-B3APi。tt

　　在另一优选的实施方式中，本发明预见到将C3OPi与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供tt体反应以提供光学活性的(R)-C3APi。tt

　　在另一优选的实施方式中，本发明预见到将C3OP与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体tt反应以提供光学活性的(R)-C3AP。tt

　　在另一优选的实施方式中，本发明预见到将苯乙酮与(R)-选择性ω-转氨酶和氨基供体tt反应以提供光学活性的(R)α-MBA。tt

　　在另一优选实施方式中，本发明预见到将氨基受体，特别是单环或二环、含氧代基团tt的5元或6元环，或S-、O-或N-取代的杂环烃或芳香族化合物，特别是烷基或烷氧基取tt代的芳香族化合物作为氨基受体与氨基供体和(R)-选择性ω-转氨酶反应，以获得胺，特别tt是单环或二环胺，特别是5元或6元环的胺，或S-、O-或N-取代的杂环烃或芳胺，特别tt是烷基或烷氧基取代的芳胺，特别是(R)形式。tt

　　在本发明特别优选的实施方式中，在诸如生理缓冲液等水性介质中将氨基受体和氨基tt供体与转氨酶反应。在特别优选的实施方式中，转氨反应在pH 5-9，特别是在pH 7-8.5tt范围内的pH下进行。在特别优选的实施方式中，反应在10℃至65℃，优选20℃至50℃，tt特别是18℃至25℃，优选室温或34℃至39℃，特别在37℃下进行。在本发明的另一优tttttt选实施方式中，以1:1至1:5，特别为1:1至1:2的的摩尔比提供氨基受体和氨基供体。在tt本发明的优选实施方式中，酶促活性为1至20.000μmol/min。tt

　　本发明还涉及用于分析转氨酶，特别是用于表征转氨酶性质的方法，其包括以下步骤：tt

　　i.提供带电的氨基受体、带电的氨基供体和转氨酶，优选ω-转氨酶，最优选可根据tt本发明获得的(R)-选择性ω-转氨酶，tt

　　ii.在反应介质中将氨基受体和氨基供体与转氨酶反应，和由此tt

　　iii.在第一反应条件设定下测定反应介质的电导率，和tt

　　iv.在步骤iii)后，在第二反应条件设定下测定反应介质的电导率，以获得反映转氨酶tt性质的至少两个电导率值。tt

　　在转氨酶(优选ω-TA)催化的，带电的底物氨基供体(优选胺)与氨基受体(优选酮酸，tt如丙酮酸盐)的反应期间，电导率降低，这是因为形成不带电的酮和两性离子的氨基组分，tt优选氨基酸，如丙氨酸。tt

　　本发明的分析方法允许简单测定反应进程。优选地，为避免过高的初始电导率，低电tt导率缓冲液，特别是低电导的CHES(N-环己基-2-氨基乙烷磺酸)缓冲液最适合。优选地，tt电导率校准方法可通过模拟不同的转化来进行。例如，对于标准底物对α-甲基苄胺和丙tt酮酸盐，1mM的转化对应于44μS电荷。通过使用毛细管电泳比较所测得的反应速率对tt本发明方法的确认获得很好的一致结果。细胞提取物没有对本发明方法产生显著干扰。因tt为丙酮酸盐是几乎全部ω-TA的共同氨基受体，可使用本发明来研究转氨酶对不同氨基供tt体的活性。而且，也可获得关于酶的对映选择性的信息。tt

　　在此实施方式中，本发明提供了用于分析转氨酶，特别是用于表征转氨酶性质的方法，tt此方法允许分析依赖于如pH值或反应介质温度的转氨酶活性，或者允许分析反应的稳定tt性、添加剂或缓冲液组成的影响。tt

　　根据本发明的分析方法，反应介质电导率的第一测量在第一反应条件设定下进行，随tt后进行反应介质电导率的至少一次第二测量，以能够比较所得的两个电导率值，并对所测tt试转氨酶的活性和性质做出结论。在根据本发明的转氨酶反应中的电导率的降低显示出所tt述转氨酶活性。识别较少降低的、较快降低的或没有降低的电导率能够对转氨酶的性质做tt出结论。tt

　　在本发明的上下文中，反应条件的设定优选为以下反应条件的设定，其条件优选选自tt温度、pH值和反应介质的组成，除了离析物和产物的浓度外，优选上述定义的反应条件。tt在本发明的一个实施方式中，反应条件的设定在反应时间内保持恒定。在本发明的另一个tt实施方式中，反应条件的设定可在反应时间内不同。tt

　　在优选实施方式中，本发明还涉及此种用于分析转氨酶的方法，其中所述反应介质为tt低电导率缓冲液。在所述方法的特别优选的实施方式中，所述带电的氨基受体为丙酮酸盐。tt

　　在本发明优选的实施方式中，将本发明分析转氨酶的方法用于本发明制备(R)-选择性ttω-转氨酶的方法之后，并将本发明的教导扩展为不但提供新的和有利的(R)-选择性ω-转氨tt酶，而且能够测定它们的性质。tt

　　本发明另一优选的实施方式为从属权利要求的主题。tt

　　本发明详述在以下实施例和所附序列表中。tt

　　SEQ ID no.1显示了来自百脉根根瘤菌的(R)-选择性ω-TA的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.2显示了编码SEQ ID no.1的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.3显示了来自土曲霉的(R)-选择性ω-TA的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.4显示了编码SEQ ID no.3的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.5显示了来自金色分支杆菌的(R)-选择性ω-转氨酶的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.6显示了编码SEQ ID no.5的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.7显示了来自节杆菌的(R)-选择性ω-转氨酶的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.8显示了编码SEQ ID no.7的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.9显示了用于确定95位至99位的大肠杆菌BCAT的序列基序；tt

　　SEQ ID no.10显示了用于确定38位的大肠杆菌BCAT的序列基序；tt

　　SEQ ID no.11显示了用于确定107位的大肠杆菌BCAT的序列基序；tt

　　SEQ ID no.12显示了用于确定163位的大肠杆菌BCAT的序列基序；tt

　　SEQ ID no.13显示了编码来自产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的(R)-选择性ω-TAtt的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.14显示了SEQ ID no.13的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.15显示了编码来自黑曲霉(Aspergillus niger)的(R)-选择性ω-TA的DNAtt序列；tt

　　SEQ ID no.16显示了SEQ ID no.15的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.17显示了编码来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的(R)-选择性ω-TA的DNAtt序列；tt

　　SEQ ID no.18显示了SEQ ID no.17的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.19显示了编码来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的(R)-选择性ω-TA的ttDNA序列；tt

　　SEQ ID no.20显示了SEQ ID no.19的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.21显示了编码来自费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)的(R)-选择性ω-TAtt的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.22显示了SEQ ID no.21的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.23显示了编码来自玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)的(R)-选择性ω-TA的ttDNA序列；tt

　　SEQ ID no.24显示了SEQ ID no.23的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.25显示了编码来自海王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)的(R)-选择性ttω-TA的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.26显示了SEQ ID no.25的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.27显示了编码来自百脉根根瘤菌MAFF303099的(R)-选择性ω-TA的DNAtt序列；tt

　　SEQ ID no.28显示了SEQ ID no.27的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.29显示了编码来自玫瑰杆菌(Roseobacter sp.)的(R)-选择性ω-TA的DNAtt序列；tt

　　SEQ ID no.30显示了SEQ ID no.29的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.31显示了编码来自海单胞菌(Marinomonas sp.)的(R)-选择性ω-TA的DNAtt序列；tt

　　SEQ ID no.32显示了SEQ ID no.31的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.33显示了编码来自艾特利根瘤菌(Rhizobium etli)的(R)-选择性ω-TA的ttDNA序列；tt

　　SEQ ID no.34显示了SEQ ID no.33的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.35显示了编码来自铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)的(R)-选择性ttω-TA的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.36显示了SEQ ID no.35的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.37显示了编码来自简纳西氏菌(Jannaschia sp.)的(R)-选择性ω-TA的DNAtt序列；tt

　　SEQ ID no.38显示了SEQ ID no.37的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.39显示了编码来自亚历山大拉布伦茨氏菌(Labrenzia alexandrii)的(R)-选tt择性ω-TA的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.40显示了SEQ ID no.39的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.41显示了编码来自伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)的(R)-选择性ω-TA的ttDNA序列；tt

　　SEQ ID no.42显示了SEQ ID no.41的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.43显示了编码来自洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)的(R)-选tt择性ω-TA的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.44显示了SEQ ID no.43的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.45显示了编码来自α-变形菌(alpha proteobacterium)的(R)-选择性ω-TA的ttDNA序列；tt

　　SEQ ID no.46显示了SEQ ID no.45的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.47显示了编码来自γ-变形菌(gamma proteobacterium)的(R)-选择性ω-TAtt的DNA序列；tt

　　SEQ ID no.48显示了SEQ ID no.47的全氨基酸序列(ORF)；tt

　　SEQ ID no.49显示了编码来自Mycobacterium vanbaalenii的(R)-选择性ω-TA的DNAtt序列；和tt

　　SEQ ID no.50显示了SEQ ID no.49的全氨基酸序列(ORF)。tt

　　附图说明tt

　　图1显示了通过标准合成获得的B3APi的色谱图。tt

　　图2显示了通过本发明的不对称合成获得的B3APi的色谱图。tt

　　图3显示了通过本发明的不对称合成获得的C3AP的色谱图。tt

　　图4显示了通过本发明的不对称合成获得的MPPA的色谱图。tt

　　图5显示了通过本发明的不对称合成获得的B3AP的色谱图。tt

　　具体实施方式tt

　　实施例：tt

　　实施例1-(R)-选择性ω-转氨酶的鉴别tt

　　将EP 1038953A1中给出的金色分支杆菌的(R)-选择性ω-TA的氨基酸序列(SEQ ttID no.5)和EP 0987332A1中给出的节杆菌的(R)-选择性ω-TA的氨基酸序列(SEQ I ttD no.7)用作查询生物分子序列。此实施例中所用的生物分子库为NCBI的pubmed蛋白tt数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed(2009年7月13日)。tt

　　已经使用来自金色分支杆菌或节杆菌ω-TA的氨基酸序列(SEQ ID no.5或7)作为查询tt序列，使用标准参数(BLOSUM62计分矩阵，词长:3，空位罚分:存在-11,延伸-1)进行ttBLAST检索，鉴别出来自不同生物体的第一组100条不同氨基酸序列，它们全部与查询tt序列具有最低为30％的序列相同性。tt

　　已在2009年7月13日，使用“非冗余蛋白序列(nr)”进行BLASTtt(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&BLAST_PROGRAMS＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&SHOW_DEFAULTS＝on&LINK_LOC＝blasthome)。在代表第一靶tt生物分子序列的此第一组100条不同氨基酸中，这些序列已通过序列基序检索进行了检索tt和鉴别，其未显示序列基序c1)、c2)或c3)，且显示序列基序c4)、c5)和c6)。可鉴别出21tt个ORF并列在下表1中。tt

　　表1tt

　　AS：节杆菌，MA：金色分支杆菌tt

　　实施例2-土曲霉、Mycobacterium vanbaalenii和百脉根根瘤菌转氨酶的制备和分析tt

　　2.1已获得来自Mycobacterium vanbaalenii的ω-TA(表1中的项目9，SEQ ID no.tt49和50)、来自土曲霉的ω-TA(表1中的项目1，SEQ ID no.3和4)、来自百脉根根瘤tt菌的ω-TA(表1中的项目11，SEQ ID no.1和2)，并以(对大肠杆菌)适合的密码子使用tt频率(codon usage)形式使用，以在大肠杆菌中表达suoshu酶。以下将Mycobacterium va ttnbaalenii转氨酶称为Mva-TA，将土曲霉转氨酶称为Ate-TA和将百脉根根瘤菌转氨酶称tt为Mlo-TA。tt

　　2.2苯乙酮测试tt

　　在pH 7.5和30℃，在使用2.5mM胺和2.5mM丙酮酸盐的苯乙酮测试中，Mva-TAtt和Ate-TA转化(R)-α-MBA比转化(S)-对映体快至少100倍。tt

　　测试：在245nm监测反应期间形成的苯乙酮的吸光值的增加。tt

　　Mlo-TA既没有转化(R)-α-MBA，也不转化(S)-α-MBA。tt

　　随后，在作为氨基受体的丙酮酸盐或α-酮戊二酸盐存在下，测试其他的胺(10mM胺、tt10mM丙酮酸盐、0.1mM PLP、磷酸盐缓冲液pH 7.5，30℃下孵育24小时，通过薄层色tt谱分析)。tt

　　对于2-氨基庚烷、2-氨基戊烷、1,3-二甲基丁基胺和4-苯基-2-氨基丁烷可观察到转化。tt此外，可检测到异丙胺的极少转化。tt

　　对于诸如D-丙氨酸、L-缬氨酸、γ-氨基丁酸盐、乙胺、苄胺、腐胺、2-氨基-3-甲基tt丁烷和3,3-二甲基-2-氨基丁烷等其它氨基供体未能检测到转化。tt

　　因此，证明全部三种蛋白均为ω-TA。tt

　　特别地，使用(R)-和(S)-2-氨基己烷作为底物，仅有(R)-对映体被显著转化。因此，ttMlo-TA也是(R)-选择性ω-TA。对于全部三种蛋白均未观察到DATA(D-氨基酸转氨酶)或ttBCAT(支链氨基转移酶)活性。tt

　　2.3电导率测试tt

　　此外，将1-N-boc-3-氨基吡咯烷(B3AP)、1-N-boc-3-氨基哌啶(B3APi)和1-Cbz-3-氨基tt哌啶(C3APi)用作底物来确定这些物质对模型底物α-MBA的相对活性。tt

　　在胺和丙酮酸盐(pH 7.5，两种底物均带电荷)向丙氨酸和酮(酮不带电荷，胺为两性离tt子化合物且对电导率无贡献)反应期间，电导率动力学的检测能够断定转化率。tt

　　在开始反应前，通过分别测定各种浓度的丙氨酸、丙酮酸盐、酮和胺的不同转化来进tt行校准。tt

　　每转化mMα-MBA、B3AP、B3APi和C3APi的电导率的降低是44μS、50μS、48.5ttμS和49.3μS。tt

　　除了三种重组表达的所述转氨酶，使用以下反应条件测试来自Codexis的商购(R)-选tt择性ω-TA 117：50mM CHES缓冲液，pH 7.5，BIS-TRIS(＝双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)tt甲烷)调节pH，0.1mM PLP，5-6mM胺和丙酮酸盐，25℃下反应。tt

　　对Ate-TA可显示底物的转化。与(R)-α-MBA相比，对(R)-B3AP和(R,S)-C3APi的相tt对活性为2％，对(R)-B3APi的相对活性为1％。tt

　　2.4通过来自土曲霉和百脉根根瘤菌的两种(R)-选择性ω-TA的胺的不对称合成测定tttttt对映选择性tt

　　通过独立的方法，显示出Mlo和Ate-TA是(R)-选择性的，并以优异对映选择性将底tt物转化为所需的产物。tt

　　对于两种转氨酶的(R)-对映选择性的确定性证据，进行不同胺的不对称合成，并测定tt其光学纯度。tt

　　使用过量百倍的丙氨酸作为氨基供体。转化未准确地确定，而是粗略估计。在进一步tt的实验中，可开发用于增加转化的不同方法(PDC)。除了C3APi外，使用两种转氨酶均获tt得了高至优异的对映选择性，而在C3Api的情形中仅获得极低的对映选择性。tt

　　表2tt

　　方法：tt

　　在大肠杆菌BL21中表达转氨酶。tt

　　当获得0.5的光密度(OD)时，使用0.2％鼠李糖诱导培养基(50ml LD-Amp培养基)，tt并在25℃下培养12小时。随后，将细胞用磷酸钠缓冲液清洗、离心、悬浮在1ml磷酸tt钠缓冲液中(pH 7.5)且以200μl等分试样冷冻。tt

　　对于生物催化，将DMSO中的5μl 500mM酮溶液、22mg D-丙氨酸和10μl 10mM ttPLP加入到这些等分试样中。使用50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)将反应混合物充至500μltt的总体积。将反应混合物在25℃和500rpm下孵育过夜。为了通过CE测定对映体的过量，tt将200μl 1N NaOH加入到400μl样品中，用400μl二氯甲烷提取并分离有机相。随后，tt用100μl 5mM三乙基磷酸铵缓冲液(pH 3)提取有机相。随后，将获得的水相注入CE中。tt

　　分离程序：tt

　　CE-Capillare 30cm，50μm内径，温度15℃tt

　　-用三乙基磷酸铵缓冲液pH 3清洗，1min，30psitt

　　-用5％高度磺化的环式糊精(HSαCD或HSγCD)清洗，1min，10psitt

　　-注射：5-10s，1psitt

　　-水浸tt

　　-分离：电压10或15kVtt

　　-检测：MPPA、C3AP和C3APi，200nm；B3AP、B3APi，190nmtt

　　表3tt

　　分离条件：tt

　　实施例4-表1中鉴别的全部转氨酶的制备和分析tt

　　4.1转氨酶的表达和纯化tt

　　使用不依赖连接的克隆策略，将密码子优化的编码表1中项目编号1、2、3、4、8、tt9、11、13、14、15、17、18和21的开放阅读框插入pGASTON的NdeI和BamHI限制tt性位点之间。订购已经亚克隆到pET-22b中的编码全部其它蛋白的密码子优化的ORF。tt使转化的大肠杆菌BL21(DE3)株在补加氨苄青霉素(100μg/ml)的400ml LB中生长。细胞tt最初在37℃旋转摇床上培养，直至OD600达到0.7。随后，通过分别加入0.2％鼠李糖tt(pGASTON)或0.1mM IPTG(pET-22b)来诱导细胞，并同时将孵育温度降低至20℃。在诱tt导后，继续孵育20小时。在诱导后若干时间点时，回收等分试样，以跟踪表达。tt

　　在4℃下，将细胞颗粒(约3g湿重)用含0.1mM PLP的磷酸盐缓冲液(pH 7.5，50mM)tt清洗两次。在破碎后(french press)，将细胞悬液离心(4000×g，30min)，并在色谱前将所tt得上清液通过0.5μm滤器。色谱使用纯化器(GE Healthcare)进行。将过滤的细胞tt提取物加入到5ml的IMAC SepharoseTM 6Fast Flow柱(GE Healthcare)。以5ml/min的流tt速，使用10倍柱体积的，含300mM NaCl、0.1mM PLP和30mM咪唑(以避免非特异性tttttt结合)的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)来清洗柱，且用10倍柱体积的，含300mM NaCl、tt0.1mM PLP和30mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH 7.5，50mM，流速5ml/min)来洗脱ATAtt活性物。收集包含馏分的活性物，并使用含0.01mM PLP的20mM Tricine缓冲液(pH 7.5)tt通过凝胶色谱来脱盐。将纯化的酶在4℃储存。tt

　　下表4中给出了从约3g(湿重)细胞中纯化的每种蛋白的量。tt

　　表4tt

　　

　　4.2(R)-选择性ω-TA底物特异性的表征tt

　　为了在表达蛋白的初步筛选中测定对于α-甲基苄胺(α-MBA)的活性，使用基于苯乙酮tttttt的测试：在纯化酶存在下，使2.5mM(R)或(S)-α-MBA和丙酮酸盐的溶液反应，且245nmtt处吸光值的增加与苯乙酮的形成相关。使用电导率测试检测胺(2-氨基己烷、4-苯基-2-氨tt基丁烷和1-N-Boc-3-氨基吡咯烷)的转化：在纯化的胺转氨酶存在下，使含10mM胺和丙tt酮酸盐的溶液反应，且电导率的降低与底物的转化相关。tt

　　为了研究DATA-和BCAT-活性，使用脱氢酶偶联的测试在340nm下用分光光度法测tt定NADH的减少：在纯化的转氨酶、1U/ml乳酸脱氢酶和0.5mM NADH存在下，使5mMttα-酮戊二酸和D-丙氨酸的溶液反应，以测定DATA活性。使用含5mM 3-甲基-2-氧代丁tt酸和L-谷氨酸盐、10mM氯化铵、1U/ml谷氨酸脱氢酶和0.5mM NADH的溶液来测定ttBCAT活性。tt

　　全部反应在含0.01mM PLP的20mM Tricine缓冲液(pH 7.5)中进行。使用1,8-二氮杂tt双环[5.4.0]十一-7-烯调节缓冲液的pH。tt

　　结果显示在下表5中。tt

　　表5：各种底物的特异活性tt

　　1-氨基己烷；2-α-MBA；3-4-苯基-2-氨基丁烷；4-1-N-Boc-3-氨基吡咯烷；2KG-2-酮戊tt二酸盐；D-Ala-D-丙氨酸；L-Glu-L-谷氨酸盐；MOB-3-甲基-2-氧代丁酸。项目编号对应tt于表1。全部测量进行至少一式两份。单次测量与平均值的偏差<10％。tt

　　a)因为表达期间蛋白产量很低/纯化期间蛋白不稳定，而不可测量。tt

　　4.3使用来自土曲霉、百脉根根瘤菌和Mycobacterium vanbaalenii的ω-TAs的(R)-胺tt1-4的不对称合成(参见上表5的图例)tt

　　不对称合成在1.5ml Eppendorf管中含吡哆醛-5’-磷酸盐PLP一水合物(1mM)和ttNAD+(1mM)的磷酸钠缓冲液(100mM,pH 7)中，在30℃下进行24小时。tt

　　所述反应混合物包含50mM酮、L-丙氨酸(5当量，250mM)，来自牛心的乳酸脱氢tt酶(90U)、葡萄糖(150mM)和葡萄糖脱氢酶(15U)。如上文所述，在大肠杆菌BL21中表tt达来自土曲霉、慢生根瘤菌和Mycobacterium vanbaalenii(表1中的项目1、11和9)的ω-TA，tt在等分试样中冷冻并直接作为全细胞生物催化剂应用而无需进一步的纯化。通过所形成的tt胺测量所述转化(1,气相色谱(GC)；2-4,毛细管电泳(CE))。如上文所述，使用CE进行2-4tt的手性分析。通过GC分析1的对映体过量(％ee)值。在使用乙酸乙酯提取胺后，通过添tt加20倍过量的三氟乙酸酐进行形成三氟乙酰胺的衍生化反应。在使用氮气吹扫以除去过tt量的酐和残余的三氟乙酸后，将衍生的化合物溶解在乙酸乙酯(50μl)中，并通过使用装配tt了Heptakis-(2,3-二-O-乙酰-6-O-叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-环式糊精柱(25m x 0.25mm)的ttttttShimadzu GC14A分离基线。在80℃/10分钟//20℃//180℃/10分钟的炉温梯度下的保留时tt间为16.0分钟((S)-1)和16.2分钟((S)-2)。tt

　　结果显示在下表6中。tt

　　表6tt

　　

　　a反应条件:50mM酮,250mM D-丙氨酸,100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0),1mM PLP、tt1mM NADH。使用乳酸脱氢酶(LDH)除去反应的丙酮酸盐副产物。使用葡萄糖脱氢酶tt(GDH)回收辅因子。b转化未经优化。单次测量与平均值的偏差不超过10％。仅通过ttAte-TA转化化合物4。c(R)-对映体。tt