基于高通量测序构建鼠TCRB文库的多重PCR引物和方法
技术领域tt
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建鼠TCRB文库的多重PCR引物，tt还涉及利用该引物构建鼠TCRB文库的方法。tt
背景技术tt
得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组tt学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域已经被应用于T细胞和Btt细胞受体的免疫组库测序。在获得性免疫中，T细胞和B细胞通过表面的T细胞受体和B细tt胞受体特异性的识别抗原肽-主要组织相容性复合物(pMHC)进而启动免疫系统活化。通过tt测序淋巴细胞受体的CDR3免疫组库，确定T、B淋巴细胞中受体分子的组成，可以用以评tt价免疫组库的多样性等特征参数，并进一步研究获得性免疫系统的应答发生过程及其发生机tt制。T细胞受体(TCR)由alpha和beta两条肽链组成，分别由TCRA和TCRB基因编码，tt同时由于beta链具有更复杂的内部组成因而能更好的反映TCR的组成状况。TCRB基因的胚tt系基因由多个开放阅读框依次排列而成，可划分为TRBV，TRBD，TRBJ，TRBC四组片段，tt在T淋巴细胞发育过程中通过体细胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的TCRB分子，tt为TCR的多样性提供了分子遗传基础。在TRBD-TRBJ，TRBV-TRBD的连接处，由于非模tt版核苷酸的随机插入与缺失，大大增加了TCR分子的多样性程度。而TCRB基因的互补决定tt区3(CDR3)刚好覆盖TRBV-Junction-TRBD-Junction-TRBJ区域，包括了TCRB基因几乎tt全部的多样性信息，因此，对于T淋巴细胞TCRB基因CDR3区域的序列组成进行测序可以tt很好的反映TCR免疫组库的组成及应答状况。tt
发明内容tt
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于高通量测序技术构建鼠TCRB文库的多重ttPCR引物；本发明的目的之二在于提供利用所述多重PCR引物构建鼠TCRB文库的方法。tt
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：tt
1、基于高通量测序构建鼠TCRB文库的多重PCR引物，所述多重PCR引物如SEQ ID ttttttNO.2～25所示。tt
2、利用所述多重PCR引物构建鼠TCRB文库的方法，先提取鼠脾腺组织或外周血总ttRNA，然后以SEQ ID NO.1为反转录引物反转合成cDNA，再以合成的cDNA为模板，SEQ ID ttNO.2～25所示序列为引物进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然tt后进行PGM测序，得鼠TCRB文库。tt
优选的，所述多重PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，tt72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。tt
本发明的有益效果在于：本发明公开了构建鼠TCRB文库的多重PCR引物，该引物能够tt扩增TCRB基因CDR3区，获得鼠TCRB文库；本发明还公开了构建鼠TCRB基因CDR3区tt测序文库的操作流程，实现了T细胞受体免疫组库的稳定检测，对进一步了解免疫组库变化tt规律、揭示疾病发病机制有重要意义。tt
附图说明tt
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：tt
图1为凝胶成像检测目的条带图(1：DL2000；2：鼠TCRB文库条带)。tt
图2为鼠TCRB文库统计结果。tt
具体实施方式tt
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的tt实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所tt述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。tt
实施例1、提取鼠组织中总RNAtt
鼠组织中总RNA的提取方法，包括如下步骤：tt
a.取鼠脾腺组织和外周血加入Trizol后吹打，室温静置5min，直接提取RNA或放入-80℃tt冰箱冻存；tt
b.按每微升Trizol加入200μl氯仿，颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃、12000gtt离心15min；tt
c.取水相，按每微升Trizol加入200μl氯仿颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃tt条件下12000g离心15min；tt
d.再取上层水相，按每微升Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，然后tt于4℃条件下12000g离心10min，弃上清；tt
e.沉淀按每微升Trizol加入1ml体积分数为75％乙醇，温和震荡，悬浮沉淀，然后于4℃、tt8000g离心5min，吸去上清，沉淀于室温(18～25℃)晾干；tt
d.晾干后用无RNA酶水溶解，得鼠总RNA。tt
将提取所得RNA用epoch测定RNA浓度和质量。检测结果显示，OD260/OD280在1.8～2.0tt左右。tt
再利用变性胶电泳检测28s，18s和5s。检测结果显示，条带明显，28s/18s在2.0左右。tt
上述检测结果表明本实施例提取的RNA质量满足建库需求，能够用于后续建库。tt
实施例2、逆转录和多重PCRtt
将实施例1获得的总RNA样本分别进行逆转录，逆转录使用RevertAid First Strand cDNA ttSysthesis kit，具体操作按试剂盒说明书进行，其反应体系为：总RNA 0.1～5μg，浓度为20pmoltt的反转录引物5’-actgtggacctccttgcca-3’(SEQ ID NO.1)1μL，加入DEPC处理水定容至12μL，tt然后将混合液在PCR仪中65℃孵育5min，然后迅速放入冰中冰浴5min，然后加入5×ttreaction buffer 4μL，RibolockTM RNase抑制剂(20u/μL)1μL，1mM dNTP Mix 2μL，revertAid ttTM M-MuLV反转录酶200u/μL 1μL，混匀后，离心，然后在42℃条件下孵育1h，得第一链ttcDNA。tt
根据T淋巴细胞受体Beta链(TCRB基因)体细胞重排、非模版随机插入缺失、体细胞tt超突变和类型转换重组的规律，设计多重PCR引物，为方便测序在正向引物和反向引物的上tt游添加的测序接头，具体的引物如表1所示。tt
表1、TCRB文库的多重PCR引物tt
然后以获得的第一链cDNA为模板，以表1所示序列为引物，进行PCR扩增，PCR扩增tt的反应体系如下：multiplex-PCR预混液25μL，正向引物5μL，反向引物5μL，cDNA 5μL，tt水10μL，共计50μL；PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，tt72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。将扩增得到的产物用质量分数为3％的ttTAE琼脂糖凝胶(低熔点琼脂糖凝胶)，在50V电压下电泳3h，电泳后在紫外下将含目的tt条带的凝胶切下，放入1.5mL EP管中，然后加入1mL QG Solubilization buffer，在45℃条件tt下水浴5～10min直至胶块完全溶解，然后冰浴1-2min；冰预后将溶解好的溶胶液加入到吸tt附柱上，每次加入500μL，然后在18000g离心1min，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附tt柱放回收集管中，向吸附柱中加入300μL QG Solubilization buffer，18000g离心1min，倒掉tt收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，18000g离心2min，在将吸附柱放在新的1.5ml EPtt管中，用吹风机将吸附柱上残留的酒精彻底吹干后向吸附柱中加入95℃预热的超纯水，静置tt2min，最后18000g下离心2min，收集洗脱液，该洗脱液为建库样本。tt
为了确定建库样本质量符合要求，对建库样本在质量分数为1.5％琼脂糖凝胶、100V电tt压下电泳30min，然后通过凝胶成像检测目的条带，结果如图1所示。上述检测结果表明获tt得的建库样本满足建库需求，能够用于下一步测序。tt
实施例3、emulsionPCR(微乳滴PCR)及PGM测序tt
利用Qubit测定获得不同样本的建库样本浓度，然后按相同量混合。样品稀释的方法为：tt假设Qubit测得的浓度为N ng/μL，文库扩增子程度为M kb，则文库的稀释倍数为ttN*1,.515*1000/26*M。tt
然后以稀释后的文库为模板，进行emPCR，emPCR使用Ion OneTouchTM测序系统提供tt试剂，操作步骤按试剂盒说明书进行，然后进行PGM测序，测序结果即为鼠TCRB文库。tttttt然后将测序结果进行统计，结果如图2所示。结果表明，利用本发明的方法构建的鼠TCRBtt文库能够覆盖TCRB基因的多样性信息。tt
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述tt优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和tt细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。tt
