构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法和筛选病毒广谱中和性抗体的方法及其应用
技术领域t
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法和筛选病毒广谱中和性抗体的方法及其应用。 t
背景技术t
广谱病毒中和抗体是感染病人获得性免疫球蛋白，此类抗体广谱的与病毒颗粒结合，阻止其进一步感染人体细胞，可导致病毒颗粒裂解，进而引起“中和”反应。尤其在易突变的病毒，譬如HIV治疗中及其重要。目前筛选病毒广谱中和抗体，多利用病人外周血单个核淋巴细胞PBMC细胞，进行抗体DNA的扩增，利用噬菌体展示进行顺次反复筛选，建立噬菌体展示的抗体库。 t
但是，由于中和性抗体的比例小，且极其稀有，若筛选压力不足，很难从108-109库容量的库中获得阳性克隆，假阳性高。若筛选压力过大，容易丢失亲和力低但中和性强的抗体株。因此，噬菌体筛选的缺点是假阳性率高，且筛选过程不易控制，容易造成有效克隆丢失。 t
因此有必要提供一种高效、假阳性率低、且筛选过程可控的筛选病毒广谱中和性抗体的方法。 t
发明内容t
为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，该方法通过构建酵母抗体展示库，采用荧光标记的病毒抗原蛋白，结合流式细胞仪分选技术筛选病毒广谱中和性抗体，该流式分选过程为可视化筛选，通过设置细胞分离门，提高了筛选过程的可控性，避免了常规筛选带来的假阳 性过高问题。本发明第二方面提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法的应用。本发明第三方面提供了一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法。本发明第四方面提供了一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法的应用。 t
本发明所述“单个核淋巴细胞”是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞。VH代表抗体重链，VL代表抗体轻链。 t
第一方面，本发明提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，包括如下步骤： t
（1）提供病毒抗原蛋白； t
（2）采用荧光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记； t
（3）制备病毒阳性病人的cDNA模板，设计引物，扩增抗体基因； t
（4）采用所得抗体基因构建酵母抗体展示库； t
（5）取所得抗体展示库中的酵母细胞与步骤（2）所得具有荧光标记物的病毒抗原蛋白混合孵育，然后设定细胞分离门，采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞； t
（6）对所得荧光阳性的酵母细胞进行测序鉴定，得到病毒广谱中和性抗体。 t
优选地，所述步骤（1）中，所述病毒抗原蛋白为HIV-1型病毒的抗原蛋白。 t
进一步优选地，所述HIV-1型病毒为HIV-1病毒A、B、B′、C、D、G和F亚型中的至少一种。 t
进一步优选地，3、4、所述HIV-1型病毒的抗原蛋白为HIV-1型病毒的gp41抗原蛋白、gp120抗原蛋白和gp160抗原蛋白中的一种或多种。 t
优选地，所述步骤（2）中，所述采用荧光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记的步骤为采用不同的荧光标记物对不同的所述病毒抗原蛋白分别进行标记。 t
进一步优选地，所述不同的荧光标记物为Alexa Fluor488、Alexa Fluor555和Alexa Fluor 647中的一种或多种。 t
优选地，所述步骤（3）中，所述制备病毒阳性病人的cDNA模板的步骤为： 制备或提供HIV-1阳性病人外周血单个核淋巴细胞PBMC，提取总RNA，以随机六聚体为引物反转录合成cDNA。 t
所述设计引物的步骤包括: t
a、合成第一轮PCR引物 t
包括VH上游引物、VH下游引物、VL上游引物、VL下游引物，各引物不含酶切位点和linker序列； t
b、合成第二轮PCR引物 t
将每条第一轮PCR引物的5’端加上linker序列，得到第二轮PCR引物，其中，加在VH的上游引物和VL的下游引物的5’端的linker序列中各有一个SfiⅠ酶切位点，加在VH的下游引物和VL的上游引物的5’端的linker序列反向互补； t
所述扩增抗体基因的步骤包括: t
S01、多重PCR扩增抗体重链： t
以所得cDNA为模板，取第一轮PCR引物的重链下游引物等摩尔混合，再分别与重链上游引物进行多重PCR，得到第一轮重链PCR产物；然后以第二轮PCR引物的重链上游引物等摩尔混合，再分别与重链下游引物进行第二轮多重PCR，得到第二轮重链PCR产物； t
S02、多重PCR扩增抗体轻链： t
以所得cDNA为模板，取第一轮PCR引物的轻链下游引物等摩尔混合，再分别与轻链上游引物进行多重PCR，得到第一轮轻链PCR产物；然后以第二轮PCR引物的轻链上游引物等摩尔混合，再分别与轻链下游引物进行第二轮多重PCR，得到第二轮轻链PCR产物； t
S03、将步骤S01所得的第二轮重链PCR产物和S02所得的第二轮轻链PCR产物混合进行重叠PCR，得到抗体基因。 t
进一步优选地，所述设计引物的步骤中，所述VL包括Vκ和Vλ链。 t
进一步优选地，所述设计引物的步骤中，所述VH上游引物、VH下游引物、Vκ上游引物、以及Vκ下游引物分别有9条、4条、6条以及5条。 t
更进一步优选地，所述9条VH上游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO:1～9所示的DNA分子。 t
更进一步优选地，所述4条VH下游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO:10～13所示的DNA分子。 t
更进一步优选地，所述6条Vκ上游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO:14～19所示的DNA分子。 t
更进一步优选地，所述5条Vκ下游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO:20～14所示的DNA分子。 t
设计第二轮PCR引物时，加在VH的下游引物和VL的上游引物的5’端的linker序列反向互补，用以通过重叠PCR获得VH和VL依次相连的抗体基因（ScFv）。 t
进一步优选地，所述linker序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25～28所示，其中，每条VH上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示的Linker，每条VH下游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示的Linker，每条VL上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的Linker，在每条VL下游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示的Linker。 t
在此优选情况下，本发明先采用多重PCR扩增抗体的重链（VH）和轻链（VL），再通过重叠PCR将重链和轻链进行拼接，从而获得ScFv基因，具体步骤包括：首先以第1链cDNA（即RNA逆转录所得cDNA）为模板，通过1st PCR上游引物的混合引物和单条下游引物分别进行多重PCR，获得1st PCR产物，回收PCR产物。再以1st PCR产物为模板，2ndPCR的引物分别进行第二轮多重PCR，分别获得2nd PCR产物，琼脂糖电泳回收并合并2nd PCR产物，形成2ndVH mix和2nd VLmix。以2nd VH mix和2nd VLmix为模板，通过重叠PCR将其拼接成ScFv。 t
优选地，所述重叠PCR的步骤为： t
先以2nd VH mix和2nd VLmix为模板，无引物运行PCR2～3个循环，再加 入VH上游引物的linker以及VL下游引物的linker作为上下游引物运行PCR25～30个循环。其中，VH上游引物的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，VL下游引物的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。 t
优选地，所述步骤（4）中，所述采用所得抗体基因构建酵母抗体展示库的步骤包括：将所得抗体基因插入酵母表达载体，转化酵母细胞并筛选后得到酵母抗体展示库。 t
进一步优选地，所述酵母表达载体为pZAC-2表达载体。 t
进一步优选地，所述酵母细胞为啤酒酵母细胞。 t
优选地，所述步骤（4）中，所述酵母抗体展示库为啤酒酵母抗体展示库。 t
优选地，所述步骤（5）中，所述设定细胞分离门，采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞的步骤重复3～4次。 t
进一步优选地，所述采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞的过程中，分选方式为每次分选选取0.5%的细胞群。 t
更进一步优选地，所述采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞的过程中，分选方式为第一次分选选取0.5%的细胞群，第2～4次分选选取0.1%的细胞群。 t
进一步优选地，所述采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞的过程中，分选方式为选取各种荧光均为阳性的细胞区域。 t
更进一步优选地，所述各种荧光均为阳性的细胞区域为lexa Fluor488、Alexa Fluor555和Alexa Fluor 647三种荧光均为阳性的细胞区域。 t
本发明提供的筛选病毒广谱中和性抗体的方法通过构建酵母抗体展示库作为配体库，采用荧光标记的病毒抗原蛋白作为受体，结合流式细胞仪分选技术筛选病毒广谱中和性抗体。该方法通过设定不同的细胞分离门，利用多种荧光标记的病毒蛋白，可一次性筛选出对多种病毒抗原具有亲和性的抗体，而不需要多轮筛选才能得到对多种病毒亚型抗原都有亲和力的抗体，提高了筛选工作的质量和效率。此外，该方法先进行抗原抗体孵育，再采用流式细胞仪分选技术筛选荧光阳性的细胞，避免了噬菌体展示富集阳性克隆步骤中依次孵育的繁琐工作，同时也不会造成亲和力低但中和性强的抗体株的丢失。其次，该方法 采用流式细胞仪分选技术能多维立体地筛选广谱中和抗体，使得筛选过程可视化，有效地提高了阳性克隆的得率。 t
本发明提供的方法提高了筛选过程的可控性，避免了常规筛选带来的假阳性过高问题，可达到100%的阳性克隆收率，同时，该方法能避免传统筛选过程需要大量重复筛选工作的缺点。 t
优选地，本发明提供的筛选病毒广谱中和性抗体的方法得到的抗体能用于制备预防或治疗针对AIDS患者的药物。 t
第二方面，本发明提供了一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法，包括如下步骤： t
S01、制备或提供HIV-1阳性病人外周血单个核淋巴细胞PBMC，提取总RNA，以随机六聚体为引物反转录合成cDNA； t
S02、多重PCR扩增抗体重链： t
a.提供第一轮PCR重链引物： t
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:1～9所示的DNA分子； t
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:10～13所示的DNA分子等摩尔混合； t
b.以所得cDNA为模板，取第一轮PCR重链引物的下游引物分别与上游引物进行多重PCR，得到4组第一轮重链PCR产物； t
c.再在每条上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示的Linker，在每条下游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示的Linker后进行第二轮多重PCR，得到4组第二轮重链PCR产物； t
S03、多重PCR扩增抗体轻链： t
a.提供第一轮PCR轻链引物： t
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:14～19所示的DNA分子； t
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:20～24所示的DNA分子等摩尔混合； t
b.以所得cDNA为模板，取第一轮PCR轻链引物的下游引物分别与上游引物进行多重PCR，得到4组第一轮轻链PCR产物； t
c.再在每条上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的 Linker，在每条下游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示的Linker后进行第二轮多重PCR，得到4组第二轮轻链PCR产物； t
S04、将步骤S01和S02所得所有第二轮PCR产物混合作为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示的Linker为上游引物，以核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示的Linker为下游引物进行重叠PCR，得到抗体基因； t
S05、将所得抗体基因插入酵母表达载体，转化酵母细胞并筛选后得到HIV病毒抗体酵母展示库。 t
酵母抗体展示库来源于本发明提供的引物扩增HIV阳性病人的抗体基因，抗体种类丰富，有助于抗原筛选到有效的抗体；且酵母展示有助于保证抗体表达后的生物构象，能充分展露抗原结合位点。 t
优选地，所述步骤S05中，所述酵母表达载体为pZAC-2表达载体。 t
优选地，所述步骤S05中，所述酵母细胞为啤酒酵母细胞。 t
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的筛选病毒广谱中和性抗体的方法在制备预防或治疗针对AIDS患者的药物中的应用。 t
第四方面，本发明提供了如第二方面所述的构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法在制备预防或治疗针对AIDS患者的药物中的应用。 t
本发明提供了的筛选病毒广谱中和性抗体的方法和构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法及其应用具有如下有益效果： t
（1）本发明通过构建酵母抗体展示库作为配体库，采用荧光标记的病毒抗原蛋白作为受体，结合流式细胞仪分选技术筛选病毒广谱中和性抗体，提高了筛选过程的可控性，避免了常规筛选方法假阳性过高的问题，且不会造成亲和力低但中和性强的抗体株的丢失； t
（2）本发明提供的酵母抗体展示库来源于本发明提供的引物扩增HIV阳性病人的抗体基因，抗体种类丰富，且酵母展示有助于保证抗体表达后的生物构象，能充分展露抗原结合位点，有助于抗原筛选到有效的抗体； t
（3）本发明提供的筛选病毒广谱中和性抗体的方法采用流式细胞仪分选 技术筛选荧光阳性的细胞，避免了噬菌体展示富集阳性克隆步骤中繁琐的筛选工作； t
（4）本发明提供的筛选病毒广谱中和性抗体的方法得到的抗体能用于制备预防或治疗针对AIDS患者的药物。 t
附图说明t
图1为本发明实施例流式细胞仪筛选3种荧光均为阳性的酵母细胞的结果； t
图2和图3为本发明实施例提供的抗体的病毒中和实验检测结果。 t
具体实施方式t
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。 t
本发明人实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。 t
图1为本发明提供的筛选病毒广谱中和性抗体的方法的流程图。结合图1，本发明实施例优选以三个GladeB亚型的HIV-1病毒gp120蛋白为例，提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，包括如下步骤： t
一、选取三个亚型的HIV-1病毒gp120蛋白，表达并分别标记3种不同类的荧光素，包括如下步骤： t
1、病毒蛋白的表达:构建3种gp120蛋白的pCDNA3.1重组表达载体，转化入293fs细胞，进行瞬时表达，并利用His标签进行蛋白的纯化，所得三种蛋白分别标记为蛋白1、蛋白2、及蛋白3。 t
2、病毒蛋白的荧光标记：利用Invitrogen公司的蛋白荧光标记试剂盒（Microscale Protein Labeling Kit(A30006)），将蛋白1、蛋白2、及蛋白3分别标 记Alexa Fluor488，568和647三种荧光标记物。具体步骤参照Invitrogen蛋白的荧光标记试剂盒的说明书，包括： t
a.提供1M sodium bicarbonate溶液，溶液pH约为8.3。 t
b.提供3种1mg/mL的gp120蛋白溶液（其中蛋白质量约为20～100ug），分别置于三个1.5ml的EP管中，再加入1/10体积的(2–10ul)碳酸氢钠（1M）。 t
c.在三个EP管中分别加入适量的Alexa Fluor488、Alexa Fluor555、Alexa Fluor 647荧光反应试剂，混匀。 t
d.室温放置15分钟。 t
e.用超滤离心管离心，并洗脱，获得三种荧光标记的蛋白。 t
3、纯化回收已经荧光标记的蛋白。 t
二、构建HIV-1抗体酵母展示库： t
1、用淋巴细胞分离液从HIV-1阳性病人血液中分离外周血单个核淋巴细胞（PBMC），共获得5×106PBMC。Trizol提取总RNA，以随机六聚体为引物反转录合成第1链cDNA。 t
2、扩增ScFv抗体基因 t
多重PCR扩增抗体重链： t
a.提供第一轮PCR重链引物： t
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:1～9所示的DNA分子； t
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:10～13所示的DNA分子等摩尔混合； t
b.以所得cDNA为模板，取第一轮PCR重链引物的下游引物分别与上游引物进行多重PCR，得到4组第一轮重链PCR产物； t
c.再在每条上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示的Linker，在每条下游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示的Linker后进行第二轮多重PCR，得到4组第二轮重链PCR产物，混合产物得到2nd VH mix； t
多重PCR扩增抗体轻链： t
a.提供第一轮PCR轻链引物： t
上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:14～19所示的DNA分子等摩尔混合； t
下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:20～24所示的DNA分子； t
b.以所得cDNA为模板，取第一轮PCR轻链引物的下游引物分别与上游引物进行多重PCR，得到4组第一轮轻链PCR产物； t
c.再在每条上游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的Linker，在每条下游引物的5’端加上核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示的Linker后进行第二轮多重PCR，得到4组第二轮轻链PCR产物，混合产物得到2nd VLmix； t
重叠PCR扩增ScFv抗体基因 t
先以2nd VH mix和2nd VLmix为模板，无引物运行PCR2～3个循环，再加入VH上游引物的linker以及VL下游引物的linker作为上下游引物运行PCR25～30个循环，得到ScFv抗体基因；其中，VH上游引物的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，VL下游引物的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示； t
3、制备表达质粒pZAC-2，将所得ScFv抗体基因和pZAC-2用SfiI酶分别进行酶切，并分别回收目的片段，将线性化重组表达质粒pZAC-2和ScFv抗体基因，通过电穿孔的方法转染EB Y100酵母细胞并筛选后得到HIV病毒抗体酵母展示库。 t
三、流式细胞仪分选阳性酵母细胞： t
1、在SGCAA培养基中表达109酵母细胞，利用PBS溶液冲洗3次； t
2、用108的酵母细胞与1ug/ml的3种荧光标记的gp120蛋白同时混合，并在室温避光放置半小时； t
3、用PBS溶液冲洗3次，悬浮在适当体积的PBS中； t
4、利用BD的AriaIII细胞分选仪，根据手册设置参数,将标记好的细胞用进行 分离，选取三种荧光阳性的细胞区域，第一次分离选取0.5%的细胞群； t
5、收集的酵母细胞在SDCAA培养基中培养过夜，然后利用SGCAA培养基表达，并重复细胞分选，每次选取0.1%组分，重复分选2次；流式细胞仪分选的结果如图1所示，在图1中，每行对应一轮分选实验，每列对应随机组合的2种gp120蛋白荧光标记均为阳性的酵母细胞（第一列为蛋白1和蛋白3的组合；第二列为蛋白1和蛋白2的组合；第一列为蛋白2和蛋白3的组合），在第三轮分选实验后，选取出3种荧光均为阳性的细胞克隆； t
6、最后选取单克隆细胞株，提取质粒并测序。 t
四、抗体中和实验 t
为充分说明本发明筛选病毒广谱中和性抗体的方法的有益效果，本发明还提供了抗体中和实验验证本发明筛选的HIV病毒广谱中和性抗体的抗病毒活性，步骤如下： t
1、准备293T和Hos-35细胞 t
接种293T和Hos-35细胞，于37℃，5%CO2条件下置于培养箱培养过夜，待细胞铺满40～80%培养瓶时，用于转染； t
2、制备pNL4-3/Bal和pNL4-3/JRFL质粒 t
a.将浓度不小于0.1μg/μl的2μg的pNL4-3和4μg的Bal、2μg的pNL4-3和4μg的JRFL分别加入225μl无血清、蛋白质以及抗生素的细胞培养基中，混匀； t
b.在质粒混合液中分别加入40ul PolyFect Transfection Reagent转染试剂（QIAGEN），用移液枪吹打5次，室温孵育5～10分钟； t
c.轻轻从瓶底吸走培养基，并加入3ml含血清与抗生素的新的细胞培养基，得到转染质粒混合物； t
3、转染 t
a.在步骤2-c所得转染质粒混合物中加入1ml含血清与抗生素的新的细胞培养基，混匀，随即分别加入步骤1准备的293T细胞，进行转染，轻轻旋动细胞瓶使液体分布均匀； t
b.将转染后的细胞置于37℃，5%CO2条件下的培养箱中培养； t
4、中和实验 t
a.在步骤3培养得到的397T细胞的培养瓶中加入含2μM丁酸钠的DMEM(10%血清)；将Hos-R5细胞从25cm培养瓶转移到96孔培养板(Cat#3610,Corning)； t
b.采用DMEM(10%血清)在96孔培养板中将抗体梯度稀释，即分别稀释到1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml和0.1ng/ml和0.01ng/ml; t
c.再每孔分别加入50μl400μg/ml的3A2a和3A5a，以及150μg/ml的2F5IgG，1/3体积稀释，并设置平行孔； t
d.吸取293T细胞的培养液，并用0.45μM的过滤器过滤；滤液用1:1的体积和抗体混合，37℃孵育1小时，分别得到Bal病毒和抗体的混合物、以及JRFL病毒和抗体的混合物； t
e.将培养板中Hos-R5细胞的培养液吸走，分别加入2种病毒和抗体的混合物，孵育1～2天；并设置阳性对照组，该阳性对照组采用2F5中和抗体；所述2F5中和抗体为采用哺乳动物293fs细胞表达的人源中和抗体，特异针对HIV-1的gp41蛋白； t
f.取50μl孵育后的细胞培养基加入50μl的Luciferase试剂(Cat#E2610,Promega)，混匀孵育2分钟后，采用酶标仪进行检测，结果如图2和图3所示。 t
图2为加入Bal病毒和抗体的混合物的实验结果，图3为加入JRFL病毒和抗体的混合物的实验结果，由图2和图3可知，与阳性对照（图中阳性对照组组）相比，本发明提供的抗体（图中实验组）有较高的活性，其与病毒的亲和力高，中和能力强，病毒中和率高达到60%～65%。 t
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 t
