用于检测FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV的基因芯片及其检测方法
技术领域t
本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法。t
背景技术t
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)、水疱性口炎(Vesicular stomatitis，VS)、猪水疱病(Swine vesicular disease，SVD)、小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)和蓝舌病(Bluetongue disease,BT)分别由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、猪水疱病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)和蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的急性、烈性病毒性传染病。FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV五种病毒广泛流行于世界各地，宿主范围广，发病率高，均为妨碍畜牧业发展的重要疫病。世界动物卫生组织(OIE)将其均列为法定报告疫病，我国也将其列为一类传染病。口蹄疫、水疱性口炎和猪水疱病均可感染猪，且以蹄部、口腔、乳房等出现疱疹为主要临床症状。蓝舌病和小反刍兽疫主要感染山羊、绵羊、牛等，患病动物的乳房和蹄部也出现病变。五种病毒感染易感动物可出现相似的临床症状，因此不能通过临床症状进行区分，必须进行病原学鉴别诊断。因而在动物及其副产品的进出口检疫时，对相应病毒的检测有着重要的意义。t
近年来，随着全球一体化的加快，不断扩大的国际贸易为动物疫病的扩散增加了机会。传统的病原分离鉴定和血清学方法，耗时长，需要专业的操作人员，已不能完全满足进口动物疫病的快速、准确、高通量检测要求。随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应(PCR)广泛应用于动物疫病的检测，但目前缺乏可区分几种病毒的PCR方法。此外，FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV五种病毒均为RNA病毒，RNA易降解、不稳定性一定程度上增加病原诊断的难度。基因芯片(Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾 病检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。结合基因芯片的优势，建立一种快速检测鉴别口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒和小反刍兽疫病病毒的基因芯片技术，可满足进出口动物疫病的快速、准确诊断，有效防止动物疫病通过国际贸易扩散传播。t
发明内容t
本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的基因芯片。t
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的基因芯片检测装置，包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH2O、检测芯片、芯片探针的点样分布、口蹄疫病毒A型一条检测探针的核苷酸序列、口蹄疫病毒亚洲I型一条检测探针的核苷酸序列、口蹄疫病毒O型一条检测探针的核苷酸序列、口蹄疫病毒通用型一条检测探针的核苷酸序列、水疱性口炎病毒一条检测探针的核苷酸序列、猪水疱病病毒一条检测探针的核苷酸序列、蓝舌病病毒一条检测探针的核苷酸序列、小反刍兽疫病毒一条检测探针的核苷酸序列、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒。t
采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：t
点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针:SEQ ID NO.9；t
杂交阳性质控分区P2，包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQ ID NO.10；t
杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；t
所述待测样品探针区内设置下述包括至少一个待测样品探针的分区：t
口蹄疫病毒A型探针分区， t
口蹄疫病毒亚洲I型探针分区， t
口蹄疫病毒通用型探针分区，t
口蹄疫病毒O型探针分区， t
水疱性口炎病毒探针分区，t
猪水疱病病毒探针分区，t
蓝舌病病毒探针分区，t
小反刍兽疫病毒探针分区；t
各个探针序列如下：t
口蹄疫病毒A型探针：SEQ ID NO.1；t
口蹄疫病毒亚洲I型探针：SEQ ID NO.2；t
口蹄疫病毒通用型探针：SEQ ID NO.3t
口蹄疫病毒O型探针：SEQ ID NO.4；t
水疱性口炎病毒探针：SEQ ID NO.5；t
猪水疱病病毒探针：SEQ ID NO.6；t
蓝舌病病毒探针：SEQ ID NO.7；t
小反刍兽疫病毒探针：SEQ ID NO.8。t
利用上述基因芯片检测口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的检测方法，具体步骤如下：t
(1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待检组织或病毒的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备待测样品cDNA；t
(2)PCR扩增：25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix 7.8μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水1.7μL；t
其中，所述引物Mix含有：t
20μmol/L口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO.11 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO.12 0.2μL，t
20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO.13 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO.14 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.15 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.16 0.2μL,t
20μmol/L水疱性口炎病毒特异上游引物SEQ ID NO.17 0.2μL,t
20μmol/L水疱性口炎病毒特异下游引物SEQ ID NO.18 0.2μL,t
20μmol/L猪水疱病病毒特异上游引物SEQ ID NO.19 0.2μL,t
20μmol/L猪水疱病病毒特异下游引物SEQ ID NO.20 0.2μL,t
20μmol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.21 0.2μL,t
20μmol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO.22 0.2μL,t
20μmol/L小反刍兽疫病毒特异上游引物SEQ ID NO.23 0.2μL,t
20μmol/L小反刍兽疫病毒特异下游引物SEQ ID NO.24 0.2μL,t
20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.25 4μL，t
20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.26 1μL；t
按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃10min；t
(3)杂交:首先配制杂交液：杂交缓冲液7.8μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.2μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后采用15μL杂交液进行杂交；其中杂交缓冲液每1000μL包括20×SSC 500μL、10％SDS 10μL及无核酸酶灭菌水490μL。t
(4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。t
本发明具有如下优点:t
(1)成功地构建了FMDV&VSV&SVDV&BTV&PPRV检测基因芯片：本发明所制备的基因芯片采用的各条筛选探针可与对应病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。t
(2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。t
(3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段，为今后出入境动物检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫工作的需要，控制口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。t
附图说明t
图1芯片探针分布示意图；t
图2口蹄疫病毒A型杂交结果示意图；t
图3口蹄疫病毒亚洲I型杂交结果示意图；t
图4口蹄疫病毒O型杂交结果示意图；t
图5水疱性口炎病毒杂交结果示意图；t
图6猪水疱病病毒杂交结果示意图；t
图7蓝舌病病毒杂交结果示意图；t
图8小反刍兽疫病毒杂交结果示意图。t
图中：P1-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；1-口蹄疫病毒A型探针分区；2-口蹄疫病毒亚洲I型探针分区；3-口蹄疫病毒通用型探针分区；4-口蹄疫病毒O型探针分区；5-水疱性口炎病毒探针分区；6-猪水疱病病毒探 针分区；7-蓝舌病病毒探针分区；8-小反刍兽疫病毒探针分区；N-杂交阴性质控分区；t
杂交说明：P1：探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；t
P2：杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性；t
N：杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；t
口蹄疫A型病毒c DNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，1号探针亮；t
口蹄疫亚洲I型病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，2号探针亮；t
口蹄疫O型病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，4号探针亮；t
水疱性口炎病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，5号探针亮；t
猪水疱病病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，6号探针亮；t
蓝舌病病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，7号探针亮；t
小反刍兽疫病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，8号探针亮。t
具体实施方式t
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下实施例。t
实施例1，本发明是基于对口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的细胞增殖，提取病毒基因组。选取不同的特异保守序列设计了8条寡核苷酸探针，可与相应的病毒cDNA的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩增时，通用上游引物5′端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在50℃下进行杂交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来鉴定口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒。根据Genbank网站上公布的口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒基因序列利用Primer Premier 5.0生物软件设计PCR引物SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26。克隆基因序列，并进行测序、比对分析，选取差异性序列在利用Primer Premier生物软件设计所述8条特异性寡核苷酸探针，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。通过上述引物和探针，可快速、特异、敏感的鉴别7种病毒。t
每条探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列如下：t
口蹄疫病毒A型探针SEQ ID NO.1为：t
5'-NH2-T15-ATGACAGTGGCTCGAATCGCACCGAAGTTGAAAGAAG；t
口蹄疫病毒亚洲I型探针SEQ ID NO.2为：t
5'-NH2-T15-GTAAGGGAGTGCCAGGCGGGTAATGGGTTG；t
口蹄疫病毒通用型探针SEQ ID NO.3为：t
5'-NH2-T15-AAGACACTTCCACATGGACTATGGAACTGGG；t
口蹄疫病毒O型探针SEQ ID NO.4为：t
5'-NH2-T15-CCGGGACGTACTGTCCTCGGCCCCTCTTGGCTGTTCA；t
水疱性口炎病毒探针SEQ ID NO.5为：t
5'-NH2-T15-GCATCATCAACAAGAGTCTAGCAAATGTCCCAAAATA；t
猪水疱病病毒探针SEQ ID NO.6为：t
5'-NH2-T15-GGATGATGTGATAGCTTCATACCCGTGGCCC；t
蓝舌病病毒探针SEQ ID NO.7为：t
5'-NH2-T15-GATACGATTTCACAACCACCGAGATATGCTCCGAG t
小反刍兽疫病毒探针SEQ ID NO.8为：t
5'-NH2-T15-CGACTCTCCCTCATCTGTTTTATGCAGGAGGAAGGA；t
点样位置质控探针SEQ ID NO.9为：t
5'-NH2-T15-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-TAMRA；t
杂交阳性质控探针SEQ ID NO.10为：t
5'-NH2-T15-GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATT。t
实施例2，参见图1，用于口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒检测的基因芯片，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成7行 ×8列的微阵列。微阵列上探针分布从上到下依次为：点样位置质控分区P1：1行×8点，杂交阳性质控分区P2：1行×4点，口蹄疫病毒A型检测探针分区1：1行×4点，口蹄疫病毒亚洲型检测探针分区2：1行×4点，口蹄疫病毒通用型检测探针分区3：1行×4点，口蹄疫病毒O型检测探针区分4：1行×4点，水疱性口炎病毒检测探针分区5：1行×4点，猪水疱病病毒检测探针分区6：1行×4点，蓝舌病病毒检测探针分区7：1行×4点，小反刍兽疫病毒检测探针分区8：1行×4点，杂交阴性质控分区N：1行×4点，点样位置质控分区P1：1行×8点。每张芯片上有至少一个上述微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。t
杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液，点样缓冲液为博奥生有限公司生产的市售产品。其余各分区包括对应的检测探针和质控探针。t
图2～8为采用本发明的基因芯片进行检测时，分别对8种病毒基因组cDNA经PCR扩增产物的杂交结果。t
实施例3、试剂准备t
1)芯片洗液t
根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ。t
洗液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2％。如500mL洗液Ⅰ＝440mL蒸馏水+50mL 20×SSC+10mL 10％SDS，或根据需要按比例配制。t
洗液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。如500mL洗液Ⅱ＝495mL蒸馏水+5mL 20×SSC，或根据需要按比例配制。t
若10％SDS产生白色絮状沉淀，请置于42℃水浴中溶解混匀后配制洗液。t
2)无水乙醇。 t
3)冰水混合物。 t
实施例4、病毒基因组RNA提取t
按照相应商品化RNA提取试剂盒使用说明书,提取待检组织或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA，进行反转录制备样品的cDNA，作为待测样品DNA。t
实施例5、PCR扩增病毒基因组cDNAt
1、PCR反应体系：在PCR配液区内，在冰上融化引物Mix及基因组cDNA，按如下体系配制反应液。PCR扩增：25μL PCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix 7.8μL、待测样品DNA 3μL、无核酸酶灭菌水1.7μL；t
其中，所述引物Mix含有：t
20μmol/L口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO.11 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO.12 0.2μL，t
20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO.13 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO.14 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.15 0.2μL,t
20μmol/L口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.16 0.2μL,t
20μmol/L水疱性口炎病毒特异上游引物SEQ ID NO.17 0.2μL,t
20μmol/L水疱性口炎病毒特异下游引物SEQ ID NO.18 0.2μL,t
20μmol/L猪水疱病病毒特异上游引物SEQ ID NO.19 0.2μL,t
20μmol/L猪水疱病病毒特异下游引物SEQ ID NO.20 0.2μL,t
20μmol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.21 0.2μL,t
20μmol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO.22 0.2μL,t
20μmol/L小反刍兽疫病毒特异上游引物SEQ ID NO.23 0.2μL,t
20μmol/L小反刍兽疫病毒特异下游引物SEQ ID NO.24 0.2μL,t
20μmol/L PCR通用上游引物SEQ ID NO.25 4μL，t
20μmol/L PCR通用下游引物SEQ ID NO.26 1μL；t
口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO.11：t
5′-AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC-3′；t
口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO.12：t
5′-GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCTTTGCAGGTGCAAT-3′；t
口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO.13：t
5′-AGGTGACACTATAGAATAACTGCCTACCAGAAGCAACC-3′；t
口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO.14：t
5′-GTACGACTCACTATAGGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC-3′；t
口蹄疫O型病毒特异上游引物SEQ ID NO.15：t
5′-AGGTGACACTATAGAATAGTGACTGAACTGCTTTACCGCAT-3′；t
口蹄疫O型病毒特异下游引物SEQ ID NO.16：t
5′-GTACGACTCACTATAGGGAGACATGTCCTCCTGCATCTG-3′；t
水疱性口炎病毒特异上游引物SEQ ID NO.17：t
5′-AGGTGACACTATAGAATATGATACAGTACAATTATTTTGGGA-3′t
水疱性口炎病毒特异下游引物SEQ ID NO.18：t
5′-GTACGACTCACTATAGGGAGAGACTTTCTGTTAGGGATCTGG-3′t
猪水疱病病毒特异上游引物SEQ ID NO.19：t
5′-AGGTGACACTATAGAATATTCAGAATGATTGCATATGGGG-3′t
猪水疱病病毒特异下游引物SEQ ID NO.20：t
5′-GTACGACTCACTATAGGGATCACGTTTGTCCAGGTTACC-3′t
蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO.21：t
5′-AGGTGACACTATAGAATAATGCTATCCGGGCTGATCCRA-3′t
蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO.22：t
5′-GTACGACTCACTATAGGGATCACRTCATCACGAAACGCTT C-3′t
小反刍兽疫病毒特异上游引物SEQ ID NO.23：t
5′-AGGTGACACTATAGAATA ACGAACCGTTAGAGGGACTGG-3′t
小反刍兽疫病毒特异下游引物SEQ ID NO.24：t
5′-GTACGACTCACTATAGGGATCCTTCCTTCGGACCCATTTGG-3′t
PCR通用上游引物SEQ ID NO.25：5′-cy3-AGGTGACACTATAGAATA-3′，t
PCR通用下游引物SEQ ID NO.26：5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′。t
2、扩增：将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行PCR反应。t
表1PCR反应程序t
PCR产物要避光放置。短期保存放置4℃冰箱。t
实施例6、判读t
1、洗片：杂交缓冲液在42℃融化，按下面体系配制杂交液，杂交体系混合液95℃变性8分钟，冰浴5分钟，备用。配制15μL杂交液：杂交缓冲液7.8μL、PCR扩增产物7μL、杂交阳性对照0.2μL。t
打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约200μL灭菌水。将芯片正面朝上(围栏面朝上，标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入50℃恒温水浴中，静置，杂交3小时。t
杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液Ⅰ中，42℃震荡清洗5分钟，再用42℃预热好的洗液Ⅱ，42℃震荡清洗5分钟，最后用42℃预热好的清水清洗一次，清洗后的芯片2000rpm离心2分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。t
2、扫描及结果判读t
洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪在晶芯LuxScanTM10K-A微阵列芯片扫描仪下进行扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。t
实施例7、弃物处理 t
按照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。t
