基于蛋白结合的FV文库及其制备方法
技术领域tt
本发明涉及构建基于蛋白结合的Fv文库的方法，用所述构建的Fv文tt库筛选需要的抗体的方法，通过所述筛选方法筛选的Fv抗体，以及通过所tt述Fv文库构建方法构建的Fv文库。tt
背景技术tt
抗体是通过免疫系统的B-淋巴细胞应答抗原、识别抗原和结合抗原所tt产生的蛋白。这类抗体被视为新的用于治疗疾病的蛋白质药物候选物。为了tt发现所需的功能性抗体，构建了各种抗体文库，并从抗体文库中筛选功能性tt抗体。使用基因重组技术构建这类抗体文库。具体地说，从人体的B-细胞tt中提取编码抗体蛋白的基因以构建抗体基因文库，从文库中筛选具有所需抗tt原结合特异性的抗体。抗体文库技术为构建诸如人类抗体的抗体带来了革tt命。如果抗原是不同于体内成分的外来物质，抗体免疫应答最突出的特征是tt在一周内抗体能特异性地与一种抗原或一种形态的抗原结合。抗体由B-淋tt巴细胞产生，一种单一的B淋巴细胞只产生一种类型的抗体。事实上，已tt知人体中存在无数的B淋巴细胞，每个B淋巴细胞表达在细胞膜上具有独tt特抗原结合特异性的抗体。通常已知在人体中大约有108种抗原结合多样性tt存在。当抗原侵入身体时，只有表达特异性结合该抗原的抗体的B淋巴细tt胞快速增殖从而产生大量的抗体，因此，血清中抗体的浓度快速增加从而迅tt速地清除入侵的抗原，因此，在人体中抗体多样性数以万计，这种抗体多样tt性被称为抗体谱(repertoire)。因此，当从人体通过血液收集到足够数量的ttB淋巴细胞之后，从细胞中分离mRNA并通过RT-PCR(反转录酶-聚合酶tt链反应)合成编码抗体的重链可变区和轻链可变区的cDNA，能以相对简tt单的方式在体外构建基因形式的人类抗体谱。抗体文库技术的关键是当通过tt任何介质(基因型-表型连接)拼接结合(paring)编码该抗体蛋白的基因tt时，都能将这种人类抗体基因谱表达(或展示)为蛋白，从而测试从抗体文tttttt库中筛选的与特定抗原结合的抗体并获得编码特异性抗体的基因。在此，不tt需要完全免疫，抗体谱或以具有抗原结合功能的抗体的Fab展示，或以名为ttscFv(单链可变片段)的抗体片段展示，所述scFv的重链可变区和轻链可tt变区(VH和VL)通过大概15个氨基酸的短肽接头相互连接。在此，根据tt用于基因型-表型连接介质的类型，将所述展示分为噬菌体展示、核糖体展tt示、酵母展示等等，并且不用通过给予抗原诱导的免疫应答就能获得具有所tt需的抗原结合特征的抗体。然而，抗体文库构建和抗体筛选所需的很多诀窍tt存在缺点，获得高亲和力抗体不容易，因此抗体筛选后频繁地进行诸如亲和tt力成熟的抗体优化步骤，因为诸如毒性问题不能进行哺乳动物细胞中的功能tt性分析，特别是在第一步筛选中。因为治疗性抗体不是简单地结合抗原还应tt该有治疗功能，此缺点成为治疗性抗体开发的障碍。tt
在抗体文库中，最频繁使用的是噬菌体展示抗体文库。实际上，阿达木tt单抗(Humira)(抗-TNF-alpha人单克隆抗体)是通过噬菌体展示技术制备tt的治疗性抗体，所述阿达木单抗是目前商业上可购买的类风湿性关节炎治疗tt制剂。理想的抗体文库包括巨大的抗体多样性，因此具有所需的抗原结合特tt异性的高亲和性抗体克隆可以从其中筛选。为了这个目的，应该构建具有大tt约1010-1011抗体文库的库。然而，通过抗体基因克隆构建具有这个规模的文tt库很困难，被看做是噬菌体展示抗体文库构建中最困难的问题。此外，因为tt噬菌体本身表现毒性，存在由于功能性分析不能直接进行的缺点。核糖体展tt示技术最大的优势是无细胞系统，因此理论上，能通过核糖体展示技术容易tt地构建具有1013大容量的文库。因此，核糖体展示技术有利于筛选高亲和tt力抗体(通常，抗体文库容量越大，文库中包括的高亲和力抗体的可能性越tt大)。此外，因为在核糖体展示技术进行PCR扩增，能使用易于出错的聚tt合酶等等，因此很容易引入人工诱导的突变。然而，核糖体展示技术也有毒tt性问题和不同的实验问题。为此，噬菌体展示技术主要用于原初起源tt(naive origin)的抗体文库的构建。在酵母展示技术中，因为需要将重组载tt体插入酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株的过程并且酵母细胞的细胞大，制备tt具有109或更多多样性的抗体文库有许多的技术限制。因此，酵母展示技术tt主要用于构建已建立的抗原特异性的抗体的突变文库和用于从突变文库中筛tt选高亲和力抗体。tt
然而，在这些抗体文库中，所有抗体没有单独地分开，而是混合在一tt起。这些抗体文库在筛选针对基于其功能(活性)的目标抗原的抗体有局限tt但不是不可能，只有筛选基于与抗体结合的抗体有可能。在随后步骤中检查tt这个过程获得的起始抗体候选物的功能来选择具有功能的抗体。大部分情况tt下，在选择步骤中获得能容易结合但不具有功能的抗体。因此，需要新的方tt法克服筛选方法的局限。换句话说，需要从一开始就基于抗体的功能来筛选tt抗体的方法。然而，现有文库处在不同抗体混合在一起的状态，不可能基于tt抗体的功能筛选单个抗体。因此，在特别分离的文库中，类似于低分子量化tt合物文库，如果有可能单个地纯化和储存所有抗体，则有可能基于抗体功能tt筛选抗体。然而，因为抗体是蛋白质，需要表达并纯化抗体的过程，因此，tt实际上不可能构建100,000或1,000,000种不同抗体的文库。换句话说，传tt统方法的缺点在于，由于当文库多样性被假定为1,000,000，就需要纯化tt1,000,000种蛋白质，随着多样性的增加，所需蛋白质纯化的个数呈指数增tt加。传统文库构建技术包括通过在DNA水平在载体中结合VH和VL构建文tt库的技术(U.S.Pat No.8,178,320)，在DNA水平构建抗体轻链和重链的文tt库技术(U.S.Pat No.7,858,559)等等。然而，这些文库构建技术的缺陷在tt于：要纯化所需数量的蛋白质以构建具有在DNA水平满足蛋白结合的多样tt性的文库，由于抗体的几何级数，不能立即分析在构建的文库中的抗体的功tt能，为此，需要减少抗体数目的附加步骤，所述抗体能通过结合抗原来筛选tt并分析它们的功能。在筛选过程中，会丢失真正重要的抗体。特别是，在传tt统文库构造方法中，Fv应在DNA水平组合表达，因此，需要与文库多样性tt相对应的蛋白质纯化。因此，在传统文库构建方法中，不可能构建一个包括tt单个地分开的抗体的文库。tt
在这种情况下，本发明人开展大量的工作来开发将抗体单个地分开从而tt能功能性地筛选它们的文库。因此，本发明人关注文库的构建，不同于传统tt文库构建中在DNA水平结合抗体结构域的技术，而是在蛋白质水平发生结tt合，并发现在蛋白质水平通过结合VH和VL能构建基于蛋白结合的Fv文tt库，从而完成本发明。tt
发明内容tt
本发明的一个目的是提供一种基于蛋白结合构建Fv(可变片段)文库tt的方法。tt
本发明的另一个目的是提供一种通过上述基于蛋白结合构建Fv文库的tt方法所构建的Fv文库筛选所需抗体的方法。tt
本发明的又一个目的是提供通过上述筛选方法筛选的所需Fv抗体。tt
本发明的再另一目的是提供通过上述基于蛋白结合构建Fv文库的方法tt构建的Fv文库。tt
为了实现上述目的，一方面，本发明提供基于蛋白结合的Fv(可变片tt段)文库和构建该Fv文库的方法。tt
更具体地说，本发明提供基于蛋白结合的Fv文库，所述Fv文库包括tt与VL结构域蛋白连接的VH结构域蛋白。tt
本发明也提供基于蛋白结合构建Fv文库的方法。该方法包括步骤：tt(a)制备重链可变区(VH)结构域蛋白和轻链可变区(VL)结构域蛋白：tt和(b)将步骤(a)制备的VH结构域蛋白和VL结构域蛋白相互拼接结合tt(paring)。tt
附图说明tt
图1示意性示出融合蛋白，每个融合蛋白包括靶标-LPETG-连接肽tt(linker)(具有任何一种不同长度)-转肽酶-组氨酸标签。(A)：由7个tt氨基酸组成的连接肽，(B)：由18个氨基酸组成的连接肽，(C)：由tt20个氨基酸组成的连接肽。tt
图2示意性示出通过配对结合来连接以构建根据本发明的基于蛋白结合tt的Fv文库。(A)：野生型之间的配对结合；(B)：通过二硫键的配对；tt和(C)通过卷曲螺旋的配对。tt
图3示意性示出简单的蛋白质纯化过程。tt
图4示出纯化的VL和VH突变体的SDS-PAGE结果。tt
图5示出为无Flag标签的VH结构域蛋白VH-G44C的表达、在N-端具tt有Flag标签的Flag-VH-G44C的表达、在N-端和C-端具有Flag标签的Flag-ttVH-G44C-Flag蛋白的表达，其随着Flag标签的存在而增加。tt
图6示出存在和不存在转肽酶以及存在和不存在Flag的情况下，重组tttttt蛋白的表达和纯化产率的对比。tt
图7是示出分析通过配对而连接的VH-VL的方法的示意图。tt
图8示出分析VH-VL配对的ELISA结果。tt
图9示出分析Flag-VH和Flag-VL配对的ELISA结果。tt
图10示出引入半胱氨酸突变的VH-VL配对的SDS-PAGE结果。tt
图11示出SDS-PAGE结果，表明Flag-VH和Flag-VL的配对增加VH和ttVL的配对。tt
图12示出VL-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和组装的Fv的SEC-ttHPLC结果。tt
图13示出VL、VH和组装的Fv野生型的MALDI-TOF分析结果。tt
图14示出VL-Q100C、Flag-VH-G44C-Flag和组装的Fv的MALDI-TOFtt分析结果。tt
图15示出VL-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和组装的Fv的MALDI-ttTOF分析结果。tt
图16示出通过CCK8测定法(Dojjindo)分析4D5Fv抗体对BT-474增殖tt的影响的结果。tt
图17示出通过FACS监测4D5IgG、VH结构域、VL结构域和组装的FV抗tt体与BT-474细胞的Her2-表达细胞表面结合特征的结果。tt
图18示出根据氨基酸残基的长度分布用于CDR设计的VH CDR3和VLCDR3的选择方案。tt
图19示出引入VH CDR和VL CDR多样性的高频分析结果。tt
图20示出根据本发明的实施例而设计出具有多样性的文库的结果。tt
图21示出通过5VH与5VL结合构建的25FV的SEC-HPLC分析结果。tt
图22示出通过4D5VH与5个合成VL结合制备的组装的Fv的FACStt和SEC-HPLC分析结果。tt
图23示出文库筛选过程。tt
图24示出通过alpha测定法筛选单个Fv和10种混合抗原的相互作用tt的结果。tt
图25示出将与混合抗原结合的Fv和单个抗原的相互结合进行第二次筛tt选的结果。tt
图26是示出主要与CSF1R结合的Fv的alpha测定法结果图。tt
图27示出在alpha测定法中被确认主要与CSF1R结合的Fv的相互作tt用的ELISA结果。tt
图28示出在alpha测定法中被确认主要与CSF1R结合的Fv的相互作tt用的Western印迹结果。tt
图29是示出主要与c-MET结合的Fv的alpha测定法结果图。tt
图30示出在alpha测定法中被确认主要与CSF1R结合的Fv的相互作tt用的ELISA结果。tt
图31示出在alpha测定法中被确认主要与CSF1R结合的Fv的相互作tt用的Werstern印迹结果。tt
具体实施方式tt
这里使用的术语“Fv(可变片段)文库”指具有多样性的若干Fv的集tt合。这里使用的术语“Fv(可变片段)”指作为抗体的Fab(抗原结合片段)tt区域的一部分的最小抗体片段，由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。tt为了本发明的目的，Fv(可变片段)文库可以是基于蛋白结合的Fv文库。tt
为了满足具有抗体多样性的抗体基因谱，传统的文库通过在DNA水平tt结合抗体来构建。通常，抗体由B-淋巴细胞产生，一个B淋巴细胞只产生tt一种类型的抗体。已知人体中存在许多B淋巴细胞，每个B淋巴细胞在细tt胞膜上表达具有独特抗原结合特异性的抗体。同时，通常已知在人体中存在tt大约108的抗原结合多样性。因此，在体内存在数以万计的抗体多样性。为tt了形成这样的抗体多样性的抗体谱，要构建数以万计的DNA组合，并且应tt该从其中制备抗体。例如，当要构建多样性为108的文库时，要合成tt100,000,000DNA，并进行100,000,000次蛋白纯化来构建分离的蛋白抗体的tt文库，但是这实际上几乎不可能。然而，根据本发明的基于蛋白结合的Fvtt文库，通过10,000个VH结构域和10,000个VL结构域的表达和纯化可以构tt建分离的Fv文库，即是，仅有20,000个结构域的表达和纯化。这种根据本tt发明的基于蛋白结合的构建Fv文库的方法是首先由本发明人开发的。根据tt本发明基于蛋白结合构建Fv文库的方法，其特征在于，通过在细胞外而不tt是细胞内配对纯化的VH结构域和VL结构域，可以构建基于所需蛋白结合tttttt的Fv文库。tt
优选地，该Fv文库能够进行其中单个成员的功能性分析。tt
优选地，单个成员的功能性分析可以包括基于与靶标结合的预筛选步tt骤，或者更优选地可以不包括基于与靶标结合的预筛选步骤。tt
如上所述，传统文库是基于DNA的文库。在这种情况下，从DNA表tt达并分离抗体蛋白质需要许多表达和纯化过程，因此在文库中，抗体没有单tt个分离，而是在文库中混合在一起。为此，为了检验蛋白抗体的功能，需要tt分离和纯化蛋白抗体的步骤。然而，如上所述，这个步骤几乎不可能。为tt此，首先基于抗体与靶标物如抗原的结合来筛选抗体，然后在第二个筛选步tt骤中，只检验与靶标物结合的抗体的功能。然而，如上所述，当基于抗体与tt靶标物结合来筛选它们时，会丢失具有所需功能的抗体。然而，本发明的ttFv文库的成员能被单个分离，因此可以不用基于与靶标结合的预筛选步骤tt而单个地分析。根据本发明的Fv文库，具有实际功能的Fv抗体可以被筛tt选出来而不会丢失。tt
为了本发明的目的，Fv文库可以是包括VH结构域和VL结构域，并通tt过重链可变区(VH)结构域蛋白和轻链可变区(VL)结构域蛋白的结合构建的Fvtt文库，但是可以包括抗原结合形式的抗体，所述抗体包括具有抗原结合能力tt的含CH的片段(如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv和rIgG)，也包括全长抗体。或tt者，所述抗体可以包括重组单链Fv片段(scFv)、二价或双特异性分子、tt双体、三体和四体。所述二价和双特异性分子，例如，描述于Kostelny et al.tt(1992,J.Immunol.,148:1547)，Pack和Pluckthun(1992,Biochemistry,tt31:1579)，Hollinger et al.(1993,Supra)，Gruber et al.(1994,J.Immunol.,tt5368)，Zhu et al.(1997,Protein Sci.,6:781et al.)，Hu et al.(1996,Cancer Res.,tt56:3055)，Adams et al.(1993,Cancer Res.,53:4026)和McCartney et al.(1995,ttProtein Eng.,8:301)。全长抗体包括IgA、IgD、IgE、IgM和IgG，IgG被再tt分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。Fab有轻链和重链可变区、轻链恒定tt区和第一重链恒定区(CH1)，且包括一个抗原结合位点。Fab'不同于Fabtt在于Fab'具有铰链区，该铰链区至少包括在重链CH1结构域的C末端的半tt胱氨酸残基。当Fab'的铰链区的半胱氨酸形成二硫键时，产生F(ab')2抗体。tt
步骤(a)的制备重链可变区(VH)结构域蛋白和轻链可变区(VL)结构域tttttt蛋白可优选地通过向VH结构域蛋白和VL结构域蛋白引入所需的多样性进tt行。多样性的引入可通过任何已知的突变方法进行。此外，VH结构域蛋白tt和VL结构域蛋白能通过任何已知的方法制备。为了构建包括VH结构域蛋tt白和VL结构域蛋白的Fv文库，可以使用包括人类蛋白质所有三级结构的数tt据库来选择蛋白质序列，诸如PDB(Protein Data Bank)和SCOP(Structural ttClassification of Protein)。此外，用于构建文库的蛋白质序列也可以通过包tt括已知的人类或非人类蛋白质序列的不同数据库来选择，但是本发明的范围tt不由此限定。此外，VH和VL序列可以从已知的可变区序列中选择，诸如那tt些可使用的Kabat抗体数据库(www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)和NCBI数tt据库(www.ncbi.nlm.nkh.gov)，并从蛋白质数据库如UniProttt(www.ebi.uniprot.org)和PRF/SEQDB(www.prf.or.jp)选择来设计VH和VL序tt列的文库。此外，可以通过对来源于一个或多个个体供体的扩增的VH和VLmRNA直接测序，收集人类VH和VL序列来补充这些蛋白序列。可以考虑tt将结构域的各种结合用于VH和VL结构域蛋白质的设计。在序列的选择tt中，可以通过已知的方法选择不包括T细胞受体的抗体结构域序列或其它ttIg序列。在本发明的一个实施例中，在PISEC服务器中使用HMMER程序tt选择抗体结构域序列(实施例6)。tt
VH结构域蛋白和VL结构域蛋白可以是人源或非人源的。tt
优选地，可在VH结构域蛋白或VL结构域蛋白中的CDR(互补决定区)tt中引入突变。CDR可以是从CDR1、CDR2和CDR3中选择的一个或多个。tt优选地，CDR可以是从CDR1、CDR2和CDR3中选择的一个、两个或三tt个，但不局限于此。更优选地，可以是CDR3，但是根据所需抗体的种类，tt可以没有限制地向CDR引入突变。在本发明的实施例中，通过在CDR3中tt引入突变而CDR1和CDR2不变来改变多样性(实施例8)。tt
优选地，可在VH结构域蛋白或VL结构域蛋白的框架中引入突变。tt
优选地，步骤(b)中将步骤(a)制备的VH结构域蛋白和VL结构域蛋tt白随机相互拼接的蛋白-蛋白拼接(paring)，可选自：(i)野生型结构域tt之间拼接；(ii)通过向结构域蛋白中引入的半胱氨酸之间的二硫键拼接；tt(iii)通过卷曲螺旋结构域之间的融合拼接；(iv)通过蛋白质-蛋白质相互tt作用拼接；和(v)上述的结合。在此，(i)至(iv)中包括但不限于任何tttttt已知拼接方法。例如，蛋白质-蛋白质拼接可通过(i)至(iv)单独或两个tt或多个(i)至(iv)步骤的结合进行。tt
优选地，(i)野生型结构域之间的拼接可通过已知的野生型VH结构域tt蛋白和VL结构域蛋白质之间的配对进行。在本发明的一个实施例中，确证tt了野生型拼接(配对)(实验实施例2)。tt
优选地，在(ii)中通过半胱氨酸之间的二硫键的拼接，可以通过已知tt方法向每个VH结构域蛋白和VL结构域蛋白中引入半胱氨酸从而VH结构域tt蛋白和VL结构域蛋白能通过引入其中的半胱氨酸之间的二硫键配对。在本tt发明的一个实施例中，确证了二硫键拼接(配对)(实验实施例1至4)。tt
优选地，在(iii)中通过卷曲螺旋结构域之间的融合的拼接，可向每个ttVH结构域蛋白和VL结构域蛋白中引入卷曲螺旋结构域从而VH结构域蛋白tt和VL结构域蛋白能通过卷曲螺旋键之间配对。这种卷曲螺旋结构域能从已tt知数据库或类似地方获得，并可使用Katja M.Arndt et al.(J.Mol.Biol.(2001)tt312,221-228)公开的方法制备。此外，可优选地使用Jennifer R.et al.tt(J.Biol.Chem.(2002)277,37272-37279),J.R.Litowski(J.peptide Res.(2001)58,tt477-492),Jesus Fern和ez-Rodriguez et al.(protein science(2012)21,511-591),ttKatja M.Arndt et al.(Structure(2002)10,1235-1248),Katja M.Arndt et al.tt(J.Biol.Chem.(2000)295,627-639)等公开的序列，但是本发明可使用所有具tt有规律性的卷曲螺旋结构域。本发明使用的卷曲螺旋结构域不限于上述论文tt中公开的序列。在本发明的一个实施例中，确证了用卷曲螺旋结合配对(实tt验实施例1至4)。tt
优选地，(iv)通过蛋白质-蛋白质相互作用的拼接包括通过已知蛋白tt质-蛋白质相互作用的拼接。例如，蛋白质-蛋白质拼接可使用诸如亮氨酸-拉tt链，如JUN结构域和FOS结构域。此外，可使用各种已知的相互作用，包tt括非共价相互作用、工程改造的CH结构域和工程改造的相互作用表面。tt
在一个实施方式中，步骤(b)的拼接可通过随机配对或靶标配对完tt成。tt
优选地，基于蛋白结合构建Fv文库的方法可进一步包括识别给予单个tt区室(compartments)的(ID)号码的步骤(c)，所述区室中储存所需的组装tt的Fv。可通过随机配对或靶标配对获得组装的Fv。在靶标拼接的情况下，tttttt该方法可包括用使得信息已知的VH结构域和VL结构域不重叠的方式来构tt建文库。优选地，在靶标配对的情况下，该方法可包括进行已知VH和VL的配对以获得组装的Fv，回收组装的Fv，在给予了ID号码的单个区室中tt储存回收的Fv，和确证在给予了ID号码的单个区室中的VH和VL结构域的tt信息。tt
因为本发明Fv文库的成员能被单个地分离，本发明能提供带有可以在tt单个区室中储存的成员的文库。提供给予了ID号码的单个区室可以以不同tt的装置提供，包括但不限于孔板、试管、阵列等等。此外，区室可进一步包tt括缓冲液、蛋白质稳定剂等等。tt
在另一方面，本发明提供了筛选所需Fv抗体的方法，该方法包括步tt骤：(a)根据上述Fv文库构建方法构建基于蛋白结合的Fv文库；和(b)tt为了所需的性质、特征或活性，使用该Fv文库进行单个功能性分析。tt
构建Fv文库的方法如上所述。tt
优选地，所需的性质、特征或活性可为细胞增殖、分化或细胞死亡。所tt需的性质、特征或活性可为蛋白质-蛋白质聚集、蛋白质稳定性的提高、蛋tt白质溶解性的增加、糖基化位点的引入、共轭结合位点的引入、免疫原性的tt降低、蛋白质表达的增加、抗原亲和力的提高、抗原亲和力的降低、亲和力tt的改变、免疫原性的改变或特异性的提高，但是不局限于此。tt
优选地，筛选方法可进一步包括(c)：识别区室的识别(ID)号码的步tt骤，所述区室其中储存有所需的Fv抗体。tt
优选地，筛选方法可包括步骤：(c)识别区室的ID号码，所述区室其tt中储存有所需的Fv抗体；和(d)鉴定已被识别的区室的Fv抗体的VH结tt构域蛋白和VL结构域蛋白。tt
如果已鉴定出被识别的区室的Fv抗体的VH结构域蛋白和VL结构域蛋tt白，只会扩增包括VH结构域蛋白和VL结构域蛋白的结合的所需Fv抗体。tt
优选地，筛选方法可进一步包括步骤：(c)识别区室的ID号码，所述tt区室其中储存有所需的Fv抗体；和(d)鉴定Fv抗体的DNA序列。tt
如果从被识别的区室中鉴定出Fv抗体，其DNA序列或氨基酸序列会tt很容易分析，只会扩增所需的Fv抗体。tt
在另一方面，本发明提供通过该筛选方法筛选的所需Fv抗体。tt
在另一方面，本发明提供通过基于蛋白结合构建Fv文库的方法构建的tt基于蛋白结合的Fv文库。tt
实施例tt
在下文中，参照实施例，进一步详细地描述本发明。对于本领域的技术tt人员很明显的是，这些实施例仅是起说明作用而不应被诠释成限制或改变本tt发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同形式定义。tt
实施例1：表达载体制备tt
1-1：BAP-转肽酶-LPETG-靶标(BAP-sortase-LPETG-target)(VL)制tt备tt
本发明实施例1中使用的PCR条件如下：tt
PCR混合物由31.5μl蒸馏水，10μl 5X PrimeSTAR缓冲液，5μl dNTPtt(2.5mM)，1μl正向引物(100μM，1μl反向引物(100μM)，1μl模板(100ttng/μl)和0.5μl PrimeSTAR聚合酶(2.5u/μl)组成。进行30个PCR循环，每个tt循环由98℃10秒和68℃1分钟组成，PCR产物贮存在4℃。tt
合成并使用BAP、转肽酶、靶标序列作为模板。tt
具体地说，使用的引物如下：tt
首先，使用引物1_sfi(5'-ccgt ggcccaggcggcc GCA AGCAGC GGC CTG ttAAC GAC ATC TTC GAG GCC-3':SEQ ID NO:1)或引物1(5'-ATGT ttCATATG GCA AGCAGC GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC-3':SEQ ttID NO:2)和引物2(5'-ttCTGCATTTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATGTCGTT-3':ttSEQ ID NO:3)通过PCR扩增编码BAP(生物素受体肽)的DNA序列。tt
使用引物3(5'-ATC GAG TGG CAC GAA ATG CAG GCT AAG CCG ttCAG ATT CCG-3':SEQ ID NO:4)和引物4(5'-ttGCCGGTCTCGGGAAGCTTCTTGACCTCGGTAGCGACAAA-3':SEQ ID ttNO:5)通过PCR扩增编码包括SrtA(GenBank Accession No.AF162687)的60tt到206位氨基酸的氨基酸序列的DNA序列。tt
使用引物5(5'-CAG TAA GCT TCC CGA GAC CGG CGAT ATC CAG ttttttATG ACT CAG AGC-3':SEQ ID NO:6)，引物6(5'-ttACTCGAACCCGCCGTACGTTTTATCTCTACCTTTGT-3':SEQ ID NO:7)和tt模板靶标(VL)通过PCR扩增编码LPETG-靶标(VL)的第二个DNA序列。tt
接下来，将三个PCR产物相互混合，然后使用引物1_sfi或引物1和引tt物7(5'-taat ggccggcctggcc GC GGC CGC ttTTAAAGATCTTCTTCACTAATTAACTT-3':SEQ ID NO:8)通过PCR扩增tt编码在SrtAc-LPETG和靶标-编码序列之间具有HindIII位点的融合蛋白ttBAP-SrtA-kLPETG-靶标(VL)的DNA序列。tt
将产生的DNA片段用NdeI和NotI消化，连接到pET23a载体tt(Novagen)，用SfiI消化，然后连接到表达融合蛋白BAP-SrtA-kLPETG-tttarget的载体pCom3x。tt
1-2：靶标(VL)-kLPETG-其它连接肽-转肽酶-H10(target(VL)-kLPETG-ttother linker-Sortase-H10)制备tt
使用引物8(5'-ATGT CATATG GAC ATT CAG ATG ACA CAG AGT-3':ttSEQ ID NO:12)和引物9(5'-ttggaaccaccgccggtctcgggaagAAGATCTTCTTCACTAATTAAC-3':SEQ ID NO:tt13)通过PCR扩增编码结合有连接肽(7a.a.)(GGSSRSS:SEQ ID NO:9)的靶tt标-LPETG-连接肽的DNA序列。tt
使用引物8，引物10(5'-GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ttACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GGA TGA GCC GGT CTC GGG ttAAG AAG AT-3':SEQ ID NO:14)和PCR产物靶标-LPETG-连接肽(7a.a.)，tt通过PCR扩增编码与连接肽(18a.a.)(SSGGGGSGGGGGGSSRSS:SEQ ID ttNO:10)连接的靶标-LPETG-连接肽(18a.a.)的DNA序列。tt
使用引物11(5'-gag acc ggc ggt ggt tcc tct aga tct tcc cag gct aag ccg cag ttatt-3':SEQ ID NO:15)和引物12(5'-taat GC GGC CGC tta ttatgatggtgATGGTGATGATGATGATGGC-3':SEQ ID NO:16)通过PCR扩增tt编码连接肽(7a.a.)-SrtA(60-206)的DNA序列。tt
使用引物13(5'-gtggttcctctagatcttcc tcg aag gtc gcg gga tat att-3':SEQ ID ttNO:17)和引物14(5'-taat ggccggcctggcc tta atgatggtgatggtgatgatgatgatggc-3':ttSEQ ID NO:18)通过PCR扩增编码连接肽(18a.a.)-SrtA(60-206)的DNA序tttttt列。tt
使用引物15(5'-ggt tcc tct aga tct tcc gga agc cag gct aag ccg cag att-3':ttSEQ ID NO:19)和引物14通过PCR扩增编码与连接肽(20a.a.)tt(SSGGGGSGGGGGGSSRSSGS:SEQ ID NO:11)连接的连接肽(20a.a.)-SrtAtt(60-206)的DNA序列。tt
最后，使用引物8，引物12和PCR产物(靶标-LPETG-连接肽(7a.a.)tt和连接肽(7a.a.)-SrtA)的混合物通过重叠PCR扩增靶标(VL)-LPETG-连接肽tt(7a.a.)-Sortase-H10(图1A)。tt
使用引物8，引物14和PCR产物(靶标-LPETG-连接肽(18a.a.)与连接肽tt(18a.a.)-SrtA的混合物通过重叠PRC扩增编码靶标(VL)-LPETG-连接肽(18tta.a.)-Sortase-H10的基因(图1B)。tt
使用引物8，引物14和PCR产物(靶标-LPETG-连接肽(18a.a.)与连接肽tt(20a.a.)-SrtA的混合物通过重叠PRC扩增编码(VL)-LPETG-连接肽(20a.a.)-ttSortase-H10的基因(图1C)。tt
将每个产生的DNA片段用NdeI和NotI消化，连接到表达融合蛋白靶tt标-LPETG-其他连接肽-Sortase-H10的pET23a载体(Novagen)。tt
融合蛋白靶标-kLPETG-连接肽(20a.a.)-Sortase-H10在靶标和编码ttkLPETG-连接肽(20a.a.)-Sortase-H10的序列之间有一个HindIII位点。接下tt来，为了表达，将所有构建的基因用NdeI和HindIII消化并连接到pET23a-ttkLPETG-连接肽(20a.a.)-Sortase-H10。tt
实施例2：表达分析tt
使用E.coli Origami2(DE3)进行所有的表达实验。将单个细菌菌落接种tt到含有100mg/L氨苄青霉素和0.5％(w/v)葡萄糖的dYT培养基(30ml)tt中，并在37℃过夜培养。接种预培养物到0.3L的DYT培养基(100mg/L的tt氨苄青霉素和50mM K2HPO4)并在37℃培养(带有挡板的1L烧瓶，tt200rpm)。当OD600值达到0.6，加入IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导表tt达。在18℃继续培养18小时。通过离心收集细胞(10,000rpm，10min，4tt℃)，以30ml的50mM Tris-HCl(pH 8.0)和150mM NaCl悬浮，通过超声裂tt解。离心分离粗提取物(10,000rpm，30min，4℃)，上清液通过0.2mm滤膜tttttt过滤，并直接应用于以下实施例3的Ni FF层析。tt
实施例3：Ni-NTA纯化tt
将裂解物的上清液上样到5ml的Ni-NTA柱(GE)，用20倍柱体积的缓tt冲液A(50mM Tris-Cl，pH 8.0，150mM NaCl，30mM咪唑和5mM BME)tt洗柱，然后用5倍柱体积的缓冲液B(50mM Tris-Cl，pH 8.0，150mM NaCl)tt洗柱。洗柱后，用消化缓冲液(缓冲液B，包括5mM CaCl2和5mM tri-ttGly)平衡蛋白结合树脂的分装份(aliquote)，然后在25℃下孵育1小时。tt
通过SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白纯度，通过MALDI-TOF MS(质谱tt法)分析蛋白质的分子量。计算得到的数值通过UV色谱法在280nm下定tt量蛋白质产率。tt
实施例4：VH和VL结构域抗体配对tt
通过混合相同体积的VH和VL进行VH和VL结构域结合成Fv异二聚的tt结合反应。配对条件是，将100μg/ml的VH蛋白和100μg/ml的VL蛋白在tt50mM Tris缓冲液(pH 8.0)中相互混合，并在室温下孵育1小时。tt
本发明中VH和VL结构域之间的结合是野生型结构域之间的拼接、通tt过二硫键的拼接或卷曲螺旋结合，每种结合方法的示意图如图2所示。tt
通过ELISA和体积排阻色谱分析组装的Fv，通过MALDI-TOF MS分tt析蛋白质的分子量。此外，通过SDS-PAGE凝胶电泳法和ELISA分析由二tt硫键组装的Fv。tt
具体地说，用300ng抗原(Erbb2)包被微孔板(Nunc,Maxissorp)过夜，tt在4℃的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中捕获抗体。用0.05％PBS-T清洗tt板，然后用含3％的脱脂牛奶的PBS-T在37℃封闭1小时。将组装的Fvtt(1-0.5μg)加到板中并在37℃孵育1小时。用1:2500稀释的结合抗-HA的tt辣根过氧化物酶或在PBS-T中含有3％脱脂牛奶的myc抗体清洗和孵育。微tt孔板在37℃孵育1小时后，清洗，然后用TMB(Sigma)/过氧物酶底物溶液tt显色，用2N H2SO4终止反应，在450nm读取吸光率。tt
实施例5：HPLC分析tt
用具有二极管阵列的Agilent 1260系列HPLC系统进行体积排阻HPLCtt(高效液相色谱)。色谱柱(7.80X 300mm BioSep-SEC-s2000)从ttPhenomenex购买。使用50mM KH2PO4和100mM KCl(pH 6.5)作为流动tt相。tt
实施例6：抗体序列收集tt
使用PDB entry 1Q9R中的抗体结构的可变结构域区域，用PSI-BLASTtt搜索了PDB(在PISCES网站上可使用的非-冗余序列文件pdbaanr)的所有tt序列数据库。只保留同一性在35％以上且E-值超过1.0x 10-20的序列，从而tt只保留抗体结构域(如，排除了T-细胞受体和其它Ig序列)。使用ttPISCES服务器以90％同一性收集产生的重链和轻链序列。用Clustal W分tt别确定重链序列的多序列比对和轻链序列的多序列比对，并手动收集和编tt辑。这些比对然后用HMMER程序产生重链和轻链特定的隐藏Markov模tt型。HMM谱是蛋白质家族的多序列比对的数据统计模型，包含位置特异性tt插入的可能性。这使得它们非常适合于确定CDR的位置，所述CDR在可tt变区序列内明确定义的位置产生并且长度不同。这些HMM用于搜素pdbaatt(PDB中一组所有蛋白质序列，包括冗余)，可从PISCES服务器获得tt(http://dunbrack.fccc.edu/PISCES.php)。选择HMMER分数和E-值的截断值以tt使得当搜索pdbaa蛋白质序列时，只有分数高于截断值的抗体重链序列和轻tt链序列。通过HMM发现的序列被指定给具有更高分数和更小E-值的那个tt序列。κ和λ轻链的得分都高于轻链HMM的截断值。将这些HMM谱，一tt个是对重链的、一个是对λ轻链的，进一步用于鉴定在每个CDR之前和之tt后的特异性的保守框架(conserved framework)位置。tt
实施例7：CDR分析tt
将重新比对的抗体VH和VL序列的经比对的集合(aligned collection)tt用于分析CDR长度和组成。每个比对中的CDR根据CDR长度分组。根据ttChothia et al.,Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature.tt1989；342:877-883，将单个的组分类为标准结构。使用Excel进行所有的分tt析。tt
实施例8：通过蛋白结合验证有效的Fv抗体的形成和活性tt
通过使用众所周知的HERCEPTIN作为模型向VH和VL蛋白引入突tt变，验证通过蛋白结合的有效的Fv抗体的形成和活性。tt
实验实施例1：通过融合蛋白自身切割的简单纯化的确证tt
已确认能通过上述实施例1至3的方法将靶蛋白VH结构域或VL结构域tt从融合蛋白中简单分离。tt
具体地说，对于Flag-VH-连接肽-卷曲螺旋-HA-Flag-LPETG-连接肽(7、tt18或20a.a.)-SrtA-His10，使用下述序列。tt
具体地说，使用Flag(DYKD:SEQ ID NO:20)，VH(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVttARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRttWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS:SEQ ID NO:21)，连接肽tt(SLEGTGGTSGSTSGTGGSSRSSST:SEQ ID NO:22)和HA(YPYDVPDYAK:ttSEQ ID NO:23)，并使用以下表1所示的卷曲螺旋序列。tt
表1tt
[表1]tt
具体地说，对于VL-连接肽-卷曲螺旋-myc-LPETG-连接肽(7、18或20tta.a.)-SrtA-His10，使用接下来的序列。tt
使用ttVL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIttYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQttGTKVEIK:SEQ ID NO:32)，连接肽(ALEGTGSSTGSSTGPGGSSRSSST:ttSEQ ID NO:33)和myc(EQKLISEEDLKLPET:SEQ ID NO:34)，并使用以下tt表2所述的卷曲螺旋序列。tt
表2tt
[表2]tt
除了下表3所示的VH外，具有引入半胱氨酸突变的Flag-VH(H-G44C ttor H-Q105C)-HA-Flag-LPETG-连接肽(7、18或20a.a.)-StrA-His10序列与上tt述相同。tt
表3tt
[表3]tt
除了下表4所述的VL外，具有引入半胱氨酸突变的VL(L-A43C or L-ttQ100C)-MYC-LPETG-连接肽(7、18或20a.a.)-StrA-His10序列与上述相tt同。tt
表4tt
[表4]tt
图3示意性示出这个简单纯化方法。tt
图4示出用图3方法纯化的VL和VH的SDS-PAGE结果。此外，图5tt示出通过Flag标签的纯化产率。此结果在图6中总结。tt
图4中示出的序列信息是从BLAST数据库tt(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获取的。通过向4D5的tt重链可变区和轻链可变区之间引入半胱氨酸，将图3和4所示的序列随机突tt变以形成异二聚体。tt
结果是，非融合体系中VL的纯化产率是10mg/L，VH的纯化产率是tt0.2mg/L。因此当使用本发明人设计的简化转肽酶融合方法时，纯化产率增tt加了3-6.5倍(图6)。此外，当使用Flag标签时，表达水平增加了2-55倍tt(图6)。tt
实验实施例2：通过ELISA测定法在蛋白质水平分析VH-VL对tt
根据实施例4的方法通过ELISA分析VH-VL对。图7示出该ELISA方tt法。tt
具体地说，设计VH-HA标签和VL-myc标签，通过ELISA测定法分析tt总共16对，包括1对野生型(wt)、11对有卷曲螺旋结构域和4对有二硫tt键。VH-VL对的ELISA结果如图8所示。结果是，当确实与抗原结合时，所tt有的对都观察到类似的水平。当用没有抗原的抗-HA对-抗-myc HRP进行分tt析，野生型不显示信号，在有卷曲螺旋结构域的11对中，VH winzipA1/VLwinzipB2显示低信号，VH winzipA2/VL winzipB2不显示信号。在有二硫键tt的4对中，只有VH G44C/VL Q100C显示信号(图8，左条：抗-HA/Fv/抗-ttmyc HRP，右条：Erbb2/Fv/抗-myc HRP)。tt
此外，设计有Flag标签的VH和VL，用ELISA分析总计12对，包括8tt对有卷曲螺旋结构域和4对有二硫键。结果是，当确实与抗原结合时，观察tt到所有的对都相似。当用没有抗原的抗-HA-对-抗-myc HRP进行分析，有卷tt曲螺旋结构域的8对中，VH winzipA1/VL winzipB1和VH IAAL E3/VL IAAL ttK3显示高信号。此外，有二硫键的四对在ELISA中不显示信号，在其它测tttttt定法(SDS-PAGE，MALDI-TOF-MS等)中显示配对(图9)。tt
上述结果支持了本发明的蛋白VH和VL结构域能通过随机配对提供具tt有多样性的Fv文库。tt
实验实施例3：通过SDS-PAGE分析在蛋白质水平分析VH-VL对tt
根据实施例4的方法通过SDS-PAGE分析VH-VL对。图10示出在引入tt到VH和VL的半胱氨酸突变之间形成有二硫键的VH-VL对。结果显示VL-ttQ100C/VH-G44C、VL-A43C/VH-Q100C和VL-A43C/VH-G44C通过二硫键配tt对形成异二聚体(图10)。tt
同时，在有通过引入到VL和VH中的半胱氨酸突变形成的二硫键的VH-ttVL对中，在Flag-VH和VL之间有二硫键的VH-VL对的结果示于图11。结果tt显示，VLk1-Q100C/F-VH-G44C-F、VLk1-Q100C/F-VH-G44C和VLk1-ttQ100C/VH-G44C通过二硫键配对形成异二聚体并显示出提高的产率(图tt11)。tt
上述结果支持了本发明的蛋白质VH和VL结构域可以通过随机配对提tt供具有多样性的Fv文库。tt
实验实施例4：通过SEC-HPLC分析在蛋白质水平分析VH-VL对tt
根据实施例4和5的方法通过体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析VH-VL对。SEC-HPLC的条件如下：tt
色谱柱：7.80×300mm BioSep-SEC-s2000tt
流动相：PBS，pH 7.4tt
柱流速：0.5ml/mintt
柱温：25℃tt
UV吸收检测器：280nm，210nmtt
进样量：100μltt
图12示出VL-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和组装的Fv的体积排阻tt色谱结果。tt
具体地说，设计Flag-标记的VH-HA标签和VL-myc标签，通过体积排tt阻色谱分析总计16对，包括1对野生型(wt)、11对有卷曲螺旋结构域和tttttt4对有二硫键。图12示出VL-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和组装的Fvtt的体积排阻色谱的结果。结果显示以组装的Fv、Flag-VH-IAALE3-Flag和ttVL-IAALK3的顺序检测的结果。tt
在VL-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和组装的Fv(包括野生型对)tt的其它结果中没有检测到VH或VL，组装的Fv与VH或VL相比显示出分子tt量的大小移动，并在所计算的早期时间被检测出。由于已知作为抗体特征的tt高疏水性，难以分析VH或VL单个结构域抗体。当暴露到每个单个结构域tt抗体的高疏水性残基被组装的Fv隐藏并变为亲水性时，大部分组装的Fvtt被检测到。tt
上述结果支持了本发明的VH和VL结构域能通过配对提供具有不同多tt样性的Fv文库。tt
实验实施例5：通过MALDI-TOF MS分析VH-VL对的分子量tt
根据实施例4和5通过MALDI-TOF MS分析VH-VL对的分子量。tt
图13示出分析VL、VH和Fv分子量的结果，图14示出分析VL-ttQ100C、Flag-VH-G44C-Flag和Fv分子量的结果。图15示出分析VL-ttIAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和Fv分子量的结果。tt
结果显示，可以准确地确定每个VL和VH的分子量(wt)，而不能确tt定组装的Fv的分子量(图13)。基于VL-Q100C(13.6kDa)、Flag-VH-ttG44C-Flag(16.2kDa)和Fv(29.8kDa)的分子量可以确认配对(图14)。此tt外，基于VL-IAALK3(18.6kDa)、Flag-VH-IAALE3-Flag(21.2kDa)和Fvtt(39.8kDa)的分子量可以确认配对(图15)。tt
实验实施例6：在细胞水平验证组装的Fv的活性tt
通过CCK8测定法(Dojjindo)分析4D5Fv抗体对BT-474细胞生长的效tt果，分析结果如图16所示。如图16所示，人乳腺癌BT-474细胞在其表面tt过度表达HER-2，BT-474的生长被组装的4D5Fv减少到与由4D5IgG抗体tt引起的减少类似的程度。tt
在以间接免疫荧光标记以后，依次用4D5IgG和FITC-结合的抗-人-Fctt通过FACS分析细胞表面的Her2表达水平。通过用1μg的抗-c-Myc抗体标tttttt记细胞1小时，然后用Alexa 488-结合的抗-小鼠抗体标记细胞，接下来通tt过FACS，确认VH结构域、VL结构域和组装的FV抗体各自与BT-474细胞的tt结合。tt
通过FACS监测4D5IgG、VH结构域、VL结构域和组装的FV抗体与BT-tt474细胞的表达Her2的表面结合的特征谱，结果如图17所示。用商业购买tt的4D5IgG(阳性对照)的分析结果显示HER-2在BT-474细胞中过表达。tt
实验实施例7：文库设计tt
用众所周知的抗原-抗体结合物通过VH和VL蛋白的配对构建功能性组tt合的蛋白质文库。自然免疫谱可产生本质上以高特异性和亲和力识别任何抗tt原的抗体。抗原识别是由呈现用于与抗原接触的大表面的6个互补决定区tt(CDR)介导。CDR序列是高可变的，但是功能性CDR的整体组成偏向某tt种氨基酸类型。在本发明的文库中，将功能性多样性限制到官能团(功能tt组)的小亚基，所述官能团特别适合于介导分子识别。通过向为确保可靠的tt折叠和高表达产率的所选出的框架的每个关键抗体的重链和轻链CDR3中tt引入对形成抗原-抗体复合物重要的高频序列生成本发明的文库。从收集的tt抗体中将所有的CDR长度固定在高频率。用收集的抗体的最丰富残基设计ttCDR1和CDR2的组成。通过VH(100)和VL(100)配对，本发明的文库有104种抗体的结合复杂度。发现人类种系的VH3,VLk3和VLk1节段在抗体中非常tt高的频率重排并容易地表达和配对。tt
本发明人合成了VH3-66和VLk1框架中的CDR1、CDR2和CDR3的DNAtt序列，使用对形成抗原-抗体复合物重要的高频序列向CDR-H3和CDR-L3tt中引入多样性。tt
根据实施例6至8的方法进行文库的设计。对于框架，使用VH3-66和ttVLK3。大部分的异二聚体是HV3、HV1、HV4、KV3和KV1。tt
设定高频出现的CDR的长度。具体地说，CDR H1固定在10个氨基酸tt长度；CDR H2固定在10个氨基酸长度；CDR H3固定在11个氨基酸长tt度；CDR L1固定在11个氨基酸长度；CDR L2固定在7个氨基酸长度；ttCDR L3固定在9个氨基酸长度。图18示出高频出现的CDR H3和CDR L3tt的典型含量。tt
实验实施例8：文库构建tt
为了多样性设计，将CDR1和CDR2固定为最高频率的残基，用高频tt率残基设计CDR3，其中的一个例子如图19所示。将100个VH结构域和tt100个VL结构域结合来设计具有100X 100＝10000多样性的文库。结果如tt图20所示。在通过蛋白结合构建的10,000个FV中，通过SEC-HPLC分析tt了由5个VH和5个VL构建的25个Fv，分析结果如图21所示。tt
通过FACS和SEC-HPLC分析了4D5VH和5个合成的VL的结合，分tt析结果如图22所示。通过SEC-HPLC分析了由4D5VH和5个合成的VL结tt合构建的组装的FV。然而，结果表明组装的FV不结合BT-474细胞。tt
实验实施例9：文库筛选tt
为了文库筛选，选择10种抗原，包括Fc结合的CTLA4、41BB、ttTRAL R1、cMET、TRALI R2、CD40、卷曲受体7、CD30、IL-17R和ttCSF1-R。在第一个筛选步骤中，通过alpha测定法(光激化学发光免疫分析)tt分析了单个FV与10种混合的抗原的相互作用，在第二个筛选步骤中，筛选tt了已选出的抗体与单个抗原的相互作用。文库筛选过程如图23所示。tt
Alpha测定法是供体珠和受体珠的基于珠接近的测定法。在这个测定法tt中，用链霉亲和素包被的珠能捕获生物素化的抗原，而myc-标记的FV可与tt抗-myc-结合的受体珠结合。供体珠和受体珠通过抗原-FV相互作用彼此接tt近。供体珠由于单线态氧的发射在680nm被激发，从受体珠发射由单线态tt氧放大的荧光信号来检测alpha信号。tt
图24示出通过alpha测定法筛选单个Fv与10种混合的抗原的相互作用tt的结果。在图24中，Y-轴表示alpha信号，X-轴表示10000个筛选的FV。tt从中可见，筛选出从高信号至接近背景的低信号范围的各种抗体。tt
在第二个筛选步骤中，筛选了与混合的抗原结合的FV和单个的抗原之tt间的相互作用，筛选结果如图25所示。可发现显示出对CSF1R、MET、ttCD30和TRAIL-R1有特异性的抗体，且可发现对不同抗原的结合具有多-特tt异性的抗体。tt
图26示出了主要与CSF1R结合的Fv的alpha测定法结果。在图26tttttt中，可见不同抗体显示不同alpha信号。tt
通过ELISA分析了在alpha测定法中主要与CSF1R结合的Fv的相互作tt用，分析结果如图27所示。结果表明大部分的Fv确实与CSF1R和c-ttMET(HGFR)两者结合。此外，包括Fv#7197和#7195的一些Fv显示出多-tt特异性。tt
通过Western印迹分析了在alpha测定法中已被证实的主要与CSF1R结tt合的Fv的相互作用，分析结果如图28所示。结果表明大部分Fv确实与ttCSF1R和c-MET(HGFR)两者结合。tt
图29示出与c-MET结合的Fv的alpha测定法结果。在图29中，能看tt到不同抗体显示出不同alpha信号。tt
通过ELISA分析了在alpha测定法中已被证实的与c-MET结合的Fv的tt相互作用，分析结果如图30所示。结果表明大部分已被鉴定的Fv确实与ttCSF1R和c-MET两者结合。此外，包括Fv#724和#6900的一些Fv显示出tt多-特异性。tt
通过Western印迹分析了在alpha测定法中已被证实的主要与c-MET结tt合的Fv的相互作用，分析结果如图31所示。如图31所示，大部分的Fv确tt实与CSF1R和c-MET(HGFR)两者结合。tt
由上文可知，本领域所属的技术人员能理解本发明，以其它具体实施方tt式进行本发明且不改变其中的技术精神或基本特征。在这方面，应该理解上tt述实施例在所有方面为说明但不局限于此。本发明的范围应该被诠释为包括tt所附权利要求的意义和范围、所有来源于其中的等同的概念的改变和修改形tt式，而不是具体地描述。tt
工业实用性tt
本发明是构建新型Fv文库的平台。更具体地说，本发明能提供产生新tt抗体的平台，不同于传统方法在DNA水平结合抗体结构域，所述平台通过tt在蛋白质水平结合VH和VL，显著地减少纯化和筛选的时间和成本。由于这tt种技术特点，与传统方法相比，可在显著地短时间内筛选具有实际功能的治tt疗性抗体，显著地减少成本，并且也能开发抑制剂、调节剂等而不局限它们tt的靶标。tt
此外，不同于传统文库，本发明的文库没有毒性问题，因此可立即分析tt其功能从而筛选具有不同功能的抗体。此外，本发明的文库使得筛选设计细tt胞增殖、分化、细胞死亡等等的功能性抗体成为可能，或者使得用抗体区分tt正常和不正常(目标疾病、现象或症状)细胞或个体成为可能。换句话说，tt本发明的文库能用于产生抗体药物，也可用于不同应用，包括诊断不同疾tt病、分析干细胞分化能力、研究疾病机制、筛选抗体、开发抑制剂和调节tt剂、用于不同条件(分化和未分化，疾病组和正常组)的抗体图谱(指纹tt图)。tt
虽然本发明参照特定特征详细描述，对于本领域技术人员显而易见地tt是，这个描述只是针对优选的实施方式，并不局限于本发明的范围。因此，tt本发明的实质范围通过附加的权利要求和其等同定义。tt
序列目录Free Texttt
附电子文档。tt
