一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库的多重PCR引物和方法
技术领域tt
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于高通量测序构建白血病tt微小残留病灶BCR文库的多重PCR引物和方法。tt
背景技术tt
白血病(leukemia)是以骨髓和/或外周血中幼稚细胞增多为特征的血液系tt统恶性克隆性疾病。在初诊时，病人体内白血病细胞总数约为1012，经化疗取得tt形态学的完全缓解(CompleteRemission，CR)后，残留的白血病细胞总数低于tt109，这种形态学方法难以检测、且体内仍残存着少量白血病细胞的状态称为白tt血病微小残留病(minimalresidualdisease，MRD)。体内残留的MRD使急性ttT淋巴白血病患者有>50％复发率。因此要定期检测MRD，对设计个体化的治疗tt方案显得更为重要。tt
B细胞基因座上大量V、J基因片段在受体的合成中会产生各种多样重排，tt在V-J，V-D和D-J接合体之间的核苷酸不依赖模板插入或删除，与高频变异tt类似，这进一步增加了受体潜在的多样性。受体的这种潜在多样性很难随机产tt生相同的CDR3序列，从而使每个CDR3序列有效地成为一个B细胞克隆的tt唯一标签。因此对于B淋巴细胞IGH基因CDR3区域的序列组成进行测序可以tt很好的反映BCR免疫组库的组成及应答状况。tt
目前临床上MRD的主要检测方法是：多参数流式细胞术(multiparametricttflowcytometry，mpFC)和实时定量PCR技术。虽然mpFC对于复发疾病的检tt测灵敏度为10-4，但是复杂的多维数据依赖于实验人员分析，人为因素影响大，tttttt不利于临床标准化检测。此外，在化疗后白血病抗原的表达水平对MRD的ttmpFC检测具有干扰作用。依赖于分子手段可以提高检测MRD的灵敏度，可tt以达到10-5；然而，实时定量PCR需根据患者设计特殊的引物将多样性丰富的tt重排序列扩增出来，其检测费用昂贵、劳动力密集、很难形成标准化实验流程。tt
得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序tt平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。因此，提供一种基于高通tt量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库的多重PCR引物和方法。tt
发明内容tt
鉴于此，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCRtt文库的多重PCR引物和方法。tt
第一方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶ttBCR文库的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQttIDNO:1～SEQIDNO:13所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成tt的上游引物组；tt
所述下游引物为比SEQIDNO:14～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列多或少tt0～3个碱基的核苷酸序列组成的。tt
如本发明所述的，“碱基”可代表核苷酸，比如，计数时，用1bp代表1个tt核苷酸。tt
如本发明所述的，“多或少0～3个碱基”，优选为在对应引物的3’端多或少tt0～3个碱基。tt
本发明通过针对人BCR的可变区V区(variable)设置至少13条上游引物序tt列，针对BCR的连接区(joining)J区设置至少4条下游引物序列，通过多重ttPCR扩增目的片段，获得多重PCR产物构建BCR高通量测序文库。tt
优选地，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:13所示的核苷酸序列组tt成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:14～SEQIDNO:17所示的核苷酸tt序列组成的下游引物组。tt
如本发明所述的，所述比SEQIDNO:1～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列tt多出的1～3个碱基为与目的BCR互补的碱基。tt
如本发明所述的，本领域技术人员可以理解的，所述的“比SEQIDttNO:1～SEQIDNO:13或SEQIDNO:14～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列多或少tt0～3个碱基的核苷酸序列”为本领域技术人员在设计PCR引物时，在如“SEQIDttNO:1～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列”的基础上，适当的延长或截短PCR引tt物长度即可获得(延长部分仍然与相应的目的片段互补)；tt
本领域技术人员可以理解的，若摸索的多重PCR引物组(“SEQIDNO:1～ttSEQIDNO:17所示的核苷酸序列”)获得了较佳的扩增效果，在可预测范围内，tt适当的将各条引物延长或截短0～3个碱基后所得多重PCR引物组，也可以获得tt较佳的多重PCR扩增效果。tt
优选地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述tt标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至tt少有一个核苷酸不同。tt
本发明提供的带标签序列的引物可以给待测样品中的每个RNA分子或ttDNA分子都加上了一个标签序列，所述标签序列由ATCG四种基本碱基随机组tt合，且所述标签序列互不相同，例如，标签序列的碱基个数是八个时(本发明tt实施例中表示为8N标签序列)，可以获得109个不同的标签序列组合；标签序tt列的碱基个数是七个时，可以获得108个不同的标签序列组合；标签序列的碱tt基个数是六个时，可以获得107个不同的标签序列组合，所述标签序列的碱基tt个数是八个，或者七个，或者六个。tt
第二方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶ttBCR文库的多重PCR方法，包括如下步骤：tt
取待测样品；tt
采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，多重PCR反tt应采用的引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物为3’端比SEQIDttNO:1～SEQIDNO:13所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的tttttt上游引物组；tt
所述下游引物为3’端比SEQIDNO:14～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列tt多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。tt
优选地，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。tt
当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通PCR体tt系进行配置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，tt再合成第二链DNA，此时，逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCRtt(只采用上游引物组或下游引物组)，合成第二链DNA的步骤也相当于一个循tt环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组)。tt
优选地，所述待测RNA样品为(优选采用RNA试剂盒)提取人外周血单tt个核细胞获得的总RNA。tt
优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测tt样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以下游引物组为反转录引物合成cDNA；tt然后以合成的cDNA为模板，加入上游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，tt获得多重PCR产物。tt
优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测tt样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以上游引物组为反转录引物合成cDNA；tt然后以合成的cDNA为模板，加入下游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，tt获得多重PCR产物。tt
优选地，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:13所示的核苷酸序列组tt成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:14～SEQIDNO:17所示的核苷酸tt序列组成的下游引物组。tt
优选地，所述多重PCR反应的体系中，13条上游引物组成的上游引物组中，tt各上游引物等摩尔混合；4条下游引物组成的下游引物组中，各下游引物等摩尔tt混合。tt
优选地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述tt标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至tttttt少有一个核苷酸不同。tt
优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为1～3ug/50ul体系。tt
优选地，所述多重PCR反应的程序为：tt
上述程序具体为：95℃预变性15min，94℃变性15s，65℃退火90s，72℃tt延伸30s，循环25～30次，最后72℃后延伸10min。tt
优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为100-150bptt的DNA片段。tt
本发明提供的BCR高通量测序文库能获得的长度和数量丰富的BCR序tt列，有利于BCR序列的多态性程度分析及BCR高克隆CDR3区长度多态性分tt布分析。tt
优选地，将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，并通过生物信tt息学分析高通量测序结果。tt
在高通量测序平台的基础上，通过对人BCR基因CDR3区域进行全面的tt生物信息学分析，获得了BCR在VDJ重组时的基因偏好性(usagepatterns)，tt基因组合、连接多样性信息，以及CDR3序列中氨基酸的偏好性(usagepatterns)、ttCDR3氨基酸序列的长度多样性以及连接处N端碱基的特性。正是这些因素形tt成数量庞大且种类多样的BCR受体库。tt
第三方面，本发明提供了一种检测白血病微小残留病灶BCR多样性的试剂tt盒，包括如第一方面所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库tt的多重PCR引物。tt
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的基于高通量测序构建白血tt病微小残留病灶BCR文库的多重PCR引物或第二方面所述的基于高通量测序构tttttt建白血病微小残留病灶BCR文库的多重PCR方法在检测白血病微小残留病灶ttBCR多样性中的应用。tt
本发明提供的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库的多重ttPCR引物及方法的有益效果为：1)获得了人BCR序列；2)获得了人特异性的ttBCRCDR3序列，尤其提高了低拷贝数B细胞克隆的检出率。tt
附图说明tt
图1为本发明实施例提供的基因组及PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；tt
图2为本发明实施例所得序列的VDJ重组分析结果。tt
具体实施方式tt
材料及试剂说明：tt
B淋巴细胞相关白血病患者：来源于深圳市人民医院，患者知情同意。非特tt殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库tt均为公开的在线数据库。tt
具体地，本发明引物如下(下划线部分为测序公司接头序列)：tt
表1.多重PCR引物序列tt
注，本领域技术人员可以理解的是，核苷酸缩写如下：tt
R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，ttV＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。tt
设计引物：针对BCR所有的V和J基因进行了比对分析，采用Oligo7.0tt和MFEprimer-2.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在BCR的CDR3区上tt游(即FR3区)设置了上游引物，针对J基因下游设计反向引物，扩增CDR3tt区域序列。tt
本实施例提供的引物组覆盖了大部分VDJ重组片段。由于很小的序列变化tt将导致引物扩增效果显著降低，发明人分别针对不同目的BCR区域的不同区段tt设计了3组多重PCR引物组，在经过3组预实验筛选后，本发明选取了扩增效tt果最佳的引物组，如上表所示。tt
实施例1tt
本发明实施例1提供了一种B淋巴细胞受体(BCR)DNA样品的制备方法，tt包括如下步骤：tt
(1)收集的新鲜外周血样本各10毫升(ml)，按LymphoPrep试剂盒tt(Axis-shield,Cat.No.AS1114544UK)说明书操作，获得相对较纯的PBMC；tt
(2)采用PureLinkGenomicDNAMiniKit(LifeTechnology,Cat.No:ttttttK1820-00)试剂盒提取步骤(1)所得细胞的基因组DNA，并用Nanodrop2000tt(Thermo)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。tt
DNA提取电泳结果如图1-a所示(基因组DNA片段参见泳道1-2；M是ttDNAMarker)。tt
实施例2tt
本发明实施例2提供了一种采用白血病微小残留病灶BCR文库的多重PCRtt引物构建白血病微小残留病灶BCR高通量测序文库的方法，包括如下步骤：tt
以实施例1所得基因组DNA为扩增模板，取BCR引物，再采用QIAGENtt公司MultiplexPCR试剂盒(货号：206143)，按试剂盒说明书配置多重PCR体tt系，其中，BCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDttNO:1～SEQIDNO:13所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为ttSEQIDNO:14～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列组成的下游引物组。tt
各上游引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，各下游引物等摩尔混合，tt引物总浓度是10微摩尔，模板量可以调整，本实施例中采用3ug。tt
为方便送测，若无特别说明，本发明实施例进行多重PCR时，分别在上游tt引物和下游引物加上测序接头，具体为：在上游引物的5’端分别接上illuminatt测序公司的上游引物接头序列(如SEQIDNO:18所示的核苷酸序列)，在下游tt引物的5’端分别接上illumina测序公司的下游引物接头序列(如SEQIDNO:19tt所示的核苷酸序列)，具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书；tt
再按下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR：tt
PCR结束后，4℃保存PCR产物并电泳检测，结果如图1-b所示，在紫外下tttttt切下约250bp左右的目的片段(目的片段参见泳道1-3；M是DNAMarker，横tt线是本发明为了让目的片段更突显添加的)。tt
挑选片段长度约为250bp的CDR3片段，割胶回收，得到纯化后的CDR3tt片段，胶回收步骤采用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒，按常规实验室tt操作进行；Nanodrop2000测试DNA浓度，并送公司进行高通量测序(采用ttIlluminahiseq2000测序，2*100pair-end)。tt
采用本发明的引物组以及多重PCR构库后，高通量测序得到大约百万条序tt列。将测序结果进行生物信息学统计分析(生物信息学分析采用南方科技大学tt在线软件ImmuneRepertoireAnalysisPipeline(iRAP，tthttp://www.sustc-genome.org.cn/irap/)，部分比对结果如下表2所示。其中，表2tt为CDR3unique克隆数量及分布，包括表2-1和表2-2。tt
表2-1.CDR3unique克隆数量及分布tt
表2-2.CDR3unique克隆数量及分布tt
通过比对和生物信息学分析，可以准确的知道每条CDR3序列的序列信息，tt氨基酸信息，条数以及所占比例。经过BCR比对分析，本发明获得了高通量测tt序序列CDR3代表性克隆的统计分析结果，结果如图2所示，图2为BCRCD3tt区V-J组合使用情况。由图2可知，通过本发明的引物获得近白万条的BCR序tttttt列中，unique的CDR3序列大于104条。tt
上述结果表明，利用本发明的方法构建白血病微小残留病灶BCR文库能够tt覆盖IGH基因的多样性信息。tt
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发tt明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明tt的保护范围之内。tt
