一种cTnI半合成人源化单链抗体的制备及应用
技术领域t
本发明属于生物医药领域，涉及一种构建cTnI蛋白的单链抗体T突变体库的方法，由该抗体库获得的可与人cTnI蛋白特异结合的单链抗体及其该抗体的制备方法及应用。t
背景技术t
急性心肌梗塞(AMI)是临床常见的急性多发病，正确诊断及时救治对挽救濒死心肌，改善预后降低急性期病死率具有重要意义。在AMI的生化诊断方面，肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)是目前常用的指标，但是CK-MB并非心脏所特有，在正常人骨骼中也有少量存在。非心脏手术或骨骼肌损伤患者常有CK-MB增高，且CK-MB在AMI发病后4-8小时才开始升高，持续时间短(48-72小时)，因而临床应用受到限制。t
肌钙蛋白(Troponin，Tn)是横纹肌收缩的重要调节蛋白，由三个亚基组成：肌钙蛋白C(TnC)，肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白I(TnI)。TnC，是肌钙蛋白的Ca2+结合亚基。TnI是肌动蛋白抑制亚基。正常情况下TnI常与TnC或TnT形成复合物，AMI后cTnI的释放形式迄今为止还不完全清楚。TnT可能为不对称蛋白结构，是原肌球蛋白结合亚基。心肌肌钙蛋白(CardiacTroponinCTn)是心肌收缩的调节蛋白，存在于心肌收缩蛋白的细肌丝上。肌钙蛋白的作用之一是把原肌凝蛋白(Tropomyosin.Tm)附着于肌动蛋白(Action.A)上，三者共同组成细肌丝。肌钙蛋白I(TroponinITnI)为ATP酶的抑制性亚单位，分别定位于骨骼肌快肌，慢肌和心肌中，其中心肌肌钙蛋白(cTnI)在基因上有着独特的氨基酸序列，分子量24KD，以两种形式存在于心肌，少量以游离形式存在于细胞胞浆，大部分以结合形式存在于肌原纤维上。cTnI在胎儿及健康或疾病状态的成人骨骼肌中不表达，因此具有高度心肌特异性。t
50年代，医学上的一大进展就是动态测定酶活性的变化来诊断急性心肌梗塞。至今国内各试验室仍将激酸肌酶(CK)及其同工酶(CK-MB)，乳酸脱氢酶(LDH)，天冬氨酸转移酶(AST)和a-羟丁酸脱氢酶(HBDH)作为诊断AMI的生化指标。其中尤以CK和LDH及其同工酶CK-MB最有临床意义。文献上曾以系列测定CK-MB作为发病24小时内诊断AMI的金标准。但上述酶的测定存在着不足，如：诊断特异性差，早期诊断灵敏性不高，诊断窗口时间较短。因此国内外都在寻找更加敏感和特异的标志物。目前的研究多集中在心肌固有蛋白上，主要有肌钙蛋白，肌红蛋白(myoglobin)，肌球蛋白轻链(MLC)等，其中研究较多并得到广泛肯定的是肌钙蛋白复合物。t
19世纪80年代人们制备出抗cTnI多克隆抗体。其方法是用纯化的cTnI做为抗原免疫家兔或羊制备cTnI抗血清，再用硫铵沉淀法，离子交换层析法，亲合层析法纯化出抗血清中的IgG。多克隆抗体的最大特点是这些IgG分子可与cTnI分子上不同的抗原决定族结合，即该IgG具有不同结合位点的IgG分子的混合物，因此其特异性差，与sTnI显示一定的交差反应。这直接影响到抗原抗体反应的特异性。t
目前cTNI抗体的制备均采用小鼠杂交瘤技术，用杂交瘤技术分泌的抗体具有鼠源性，无法用于临床诊治，限制了该抗体的应用。同时用杂交瘤技术筛选的单克隆抗体一般只能保持其天然抗体的活性，制备工作异常繁琐和费时，杂交瘤细胞使用几代后就逐渐退化，产量变低，使得生产成本增加。t
发明内容t
本发明的目的在于提供一种抗cTnI半合成人源化单链抗体细菌表达株Autodisplay-cTnI-Anti-ScFv2A-2。t
本发明的另一目的在于提供由细菌表达株Autodisplay-cTnI-Anti-ScFv2A-2制备的半人源化抗cTnI单链抗体。t
本发明提供一种抗cTnI半合成人源化单链抗体的制备方法，所得抗体能够与cTnI特异性结合。t
本发明提供的抗体与cTnI特异性结合，亲和常数为6.02×10-10mol/L。t
本发明所述抗体其氨基酸序列及核苷酸序列如序列表所示。所述抗cTnI蛋白单链抗体是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；重链可变区N端第36至162位所述氨基酸残基序列；轻链可变区N端第183位至248位所示氨基酸残基序列。t
进一步，本发明提供一种抗cTnI蛋白单链抗体突变体库，所述抗体突变体库含有抗cTnI蛋白抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区linker序列，以pRSF-Autodisplay为载体，库容量达到2×105。t
提供所述抗cTnI蛋白单链抗体突变体库的构建方法，包括以下步骤：t
1.构建竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。t
2.从文库中筛选出的scFv片段进行ErronPCR，扩增抗体重链和轻链可变区基因：设计含Sfil酶切位点的引物。t
3.单链抗体scFv突变体库的构建：双酶切scFv基因片段，并插入pRSFAutodisplay构建重组质粒，转化感受态E.coliTurbo，获得抗cTnI蛋白单链抗体突变体库。t
本发明的有益效果是：目前用杂交瘤技术筛选的单克隆抗体一般只能保持其天然抗体的活性，且制备工作异常繁琐和费时，杂交瘤细胞使用几代后就逐渐退化，产量变低，使得生产成本增加。本发明的单链抗体(ScFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到。采用erronPCR技术，使得获取比天然抗体亲和性更高的抗体成为可能。本发明提供的抗体与库中其它抗体相比，氨基酸序列突变5.2％，而抗体亲和力提高了一个数量级(数据未提供)。发明提供的抗体片段可在细菌中经济地大规模生产，从而使得免疫检测用抗体的生产变得非常容易、简便和经济，进而大大减少检测试剂的费用。t
附图说明t
图1为PCR扩增得到cTnI-Anti-ScFv2A-2片段t
图2为纯化的cTnI-Anti-ScFv2A-2的SDS-PAGE电泳图t
具体实施方式t
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。t
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。t
实施例1：cTNI单链抗体库的构建t
1.本发明将分别提取20名男性和女性成人脾脏及淋巴结mRNA，合并后将其逆转录成cDNA。利用针对抗体重链和轻链可变区的引物分别扩增VH和VL基因片段，将两种ErrorpronePCR产物进行纯化并测定浓度，再用含柔性连接肽的引物将VH和VL基因片段通过连接片段组装到一起形成单链抗体编码序列。将单链抗体编码片段ScFv纯化并与载体pPNL6连接，通过高效醋酸锂转化法转化进入EBY100酵母中，构建半合成抗体文库。t
2.用磁珠法和流式细胞术筛选结合进行筛选：t
A.体外大肠杆菌表达cTNI蛋白作为抗原；t
B.将磁珠与cTNI蛋白结合，借助抗原与抗体特异性结合，经过3轮“吸附-洗脱-扩增”循环，实现对单链抗体的富集筛选。t
C.cTNI蛋白用荧光素FITC标记，单链抗体会竞争性的与靶抗原进行结合，被流式细胞分选仪分选出来。t
D.流式细胞分选以后，随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。t
实施例2cTNI单链抗体突变体库的构建t
1.构建用于细菌中的竞争性表达载体pRSF-Autodisplay。t
2.初步筛选的阳性菌株进行PCR，获得阳性菌株pPNL6-ScFv的DNA片段。t
3.设计含Sfil酶切位点的引物，对该DNA片段进行ErronPCR，扩增抗体重链和轻链可变区基因。t
4.cTNI单链抗体scFv突变体库的构建：双酶切scFv基因片段，并插入pRSF-Autodisplay构建重组质粒，转化感受态E.coliTurbo细胞，获得抗cTnI蛋白单链抗体突变体库。t
5.利用磁珠法单链抗体突变体库进行富集筛选。t
6.随机挑取单菌落进行单链抗体的分泌表达，ELISA方法检测表达抗体的特异性，获得可表达特异性单链抗体的阳性菌株。t
实施例3抗体的制备t
1.对阳性菌株进行重复试验，确定稳定性最好的阳性菌株，将其命名为Autodisplay-cTnI-Anti-ScFv2A-2，提取该质粒DNA，序列测定得到其相应的核苷酸序列。该单链抗体由重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连接组成。重链可变区N端第36至162位所述氨基酸残基序列；轻链可变区N端第183位至248位所示氨基酸残基序列。编码所述cTnI蛋白单链抗体的基因，由重链可变区的编码序列、连接重链可变区的编码序列和轻链可变区的编码序列组成。重链可变区的编码序列自5’末端第106至486位所示核苷酸序列，轻链可变区的编码序列自5’末端第549至744位所示核苷酸序列(其后跟上3位编码基因TGA，作为终止子)。t
2.细菌表达抗体蛋白。t
1).以BL21(DE3)为宿主菌，将cTnI-Anti-ScFv2A-2进行转化，挑取单菌落于3mlLB培养基培养过夜；t
2).以1∶500比例将菌液转接至400mlLB培养基，恒温在37℃，230rpm培养至OD600＝0.4-0.6；t
3).加IPTG诱导，IPTG诱导终浓度为0.5mM，保持25℃条件下表达8小时后收菌。t
4).cTnI-Anti-ScFv2A-2蛋白的纯化：t
A.取400ml培养液3000rpm离心分离10分钟后收集菌体，菌体重悬于10ml蛋白提取缓冲液中(50mMNa-PO4，pH8.0，500mMNaCl，10mMImidazle)，15MPa高压破菌，12,000rpm，4℃离心10min，上清液与Ni-NTA冰上孵育1小时；t
B.过Ni-NTA亲和层析柱，用蛋白提取buffer洗涤，最后用250mMImidazle洗脱，收集洗脱液。t
C.蛋白洗脱液过G50柱去除Imidazle，这样可以得到90％以上纯度的cTnI-Anti-ScFv2A-2蛋白。t
D.收集上述纯化产物，进行12％SDS-PAGE电泳。t
3.cTnI-Anti-ScFv2A-2蛋白含量测定：t
实施例4：抗体的功能检测t
1.仪器与试剂t
BIAcore1000生物传感器由瑞典的PharmaciaBiosensorAB(Uppsala，Sweden)生产。pH值测定采用BECKMANpHMeter。二次水用MilliOll(MilliporeCo.，USA)除去离子。传感片(sensorchipsCM5)从PharmaciaBiosensorAB购得。t
氨基偶联试剂盒从PharmaciaBiosensorAB购得。主要包括以下成分：氮-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，氮-乙基-氮′(-二甲氨基丙基)碳二亚胺N-Ethyl-N′-dimethyaminopropyl)carbodiimide，EDC)，pH8.的1mol/L乙醇胺的盐酸溶液(ethanolaminehydrochloride)。缓冲溶液HBS(pH7.4)也是从PharmaciaBiosensorAB购得。其成分包括：10mmol/L4-(2-羟基)哌嗪-1-乙基磺酸(4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethane-sulfonicacid，HEPES)，150mmol/LNaCl，3.4mmol/LEDTA，0.005％(V/V)表面活性剂P20(surfactantP20)。HBS作为体系连续流动的缓冲溶液。t
2、实验方法t
溶液的配制各醋酸缓冲液由醋酸(10mmol/L)-醋酸钠(10mmol/L)配制，Na+浓度小于10mmol/L。用超声波除气，于室温下保存，从而避免实验过程中因温度升高产生气泡。离子强度用1mol/L的NaCl溶液调节。t
cTNI的固定所要检测的生物分子间相互作用的特异性，主要取决于偶联在传感片表面的配体(Ligand)的特性。因此，配体在传感片表面的固定是至关重要的。我们所用的标准的传感片(sensorchipCM5)表面含有一层甲羧基化葡聚糖，可以提供配体偶联基地和为生物反应提供亲水环境。本文采用的是氨基偶联法。t
cTNI蛋白的固定步骤如下：在NHS，EDC融化及HBS缓冲溶液流过传感片表面几分钟使信号稳定后，使流速为5μL/min，开始蛋白质固定程序。(1)EDC和NHS各100μL转移到用于混合的小瓶中并混合均匀。(2)注射35μL的混合液(0.05mol/LNHS，0.2mol/LEDC)使其流过传感片表面，使传感片表面的羧基活化。(3)注射35μL蛋白质(CTNI)溶液，这时CTNI中的氨基与活化的酯基发生氨基偶联反应。(4)注射35μL乙醇胺的盐酸溶液，用于封闭残余的已活化的酯基。(5)注射10μL0.1mol/L的HCl洗去非键合的吸附的CTNI和乙醇胺。t
进行抗体活性检测时，把固定有CTNI的传感片插入仪器，通过微机控制使其压在微射流卡盘(IFC)上，从而形成4个相同的小流通池，体积为0.05mmX0.5mmX2.4mm。选定已固定CTNI的通道，即可进行抗体活性检测实验。首先让HBS缓冲溶液连续流过传感片表面10min左右使基线基本稳定。这时由微机控制自动进样。进样时间，进样量和进样速度均可通过指令由微机控制。采用仪器配带处理软件(BIAevaluationsoftware)进行数据处理。计算键合量时，读数在每次注射结束后30s时读取。t
3.单链抗体和cTNI的结合t
将40μl不同浓度cTNI单链抗体(156pM、312pM、625pM、1.25nM、2.50nM、5nM、10nM)以89μl/min的流速流过cTNI-CM5芯片表面，以空白通道作为参考背景，消除溶液特性、流速及cTNI的单链抗体在芯片表面非特异吸附对实验的影响。cTNI单链抗体和cTNI有特异结合作用，cTNI单链抗体与固定在芯片表面的cTNI结合并达到了平衡。进样结束后，缓冲溶液代替样品溶液流过芯片表面，结合在芯片表面cTNI单链抗体逐渐地被解离，但这一过程是很缓慢的过程，因此在传感图谱上表现为几乎水平的倾斜曲线。分析物的浓度对结合过程有着较大的影响，按着由高浓度到低浓度的顺序，结合曲线也是依次从上到下分布，其幅度和斜率均相应递减，最下面的一条结合曲线几乎和基线重合，代表作为对照的空白通道(图中未做标注。可以看出，cTNI单链抗体浓度在156pM～2.50nM范围时，SPR传感信号较低，cTNI单链抗体浓度变化引起的RU值变化甚微，由此可初步判断，浓度较低时，cTNI单链抗体有很少一部分与cTNI发生结合反应；当cTNI单链抗体浓度升高至5～10nM的范围时，RU值随时间增加而递增，并且随着浓度的增大，传感信号峰相应的增大，说明高浓度cTNI单链抗体可以更多地与cTNI结合。比较最高浓度下进样前后基线的差值可知，cTNI单链抗体结合量约为30RU，所以与芯片表面cTNI发生结合反应的cTNI单链抗体质量约为0.03ng/mm2。t
