用于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用
技术领域t
本发明属于环境污染物检测领域，尤其是涉及一种用于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用。t
背景技术t
邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（DEHP）作为目前使用最普遍的塑化剂，是一种环境荷尔蒙，具有稳定性极强，难降解的特性。随着塑料制品的大量生产和使用，在造成环境“白色污染”的同时，DEHP也不断进入水域环境。包括DEHP污染物在内的大量的有机污染物通过各种途径进入海洋环境，并最终迁移至海洋生物体内或富集于底质和悬浮物中，对海洋环境和海洋生物造成极大的危害。DEHP对海洋生物的毒性作用主要包括富集及降解作用和水生生物遗传毒性作用、繁殖生长发育及免疫系统的影响。t
双壳贝类一直是被国际上普遍接受的生物指示物。菲律宾蛤仔以其地理分布广、是沿海海区的优势种、生物体能累积污染物、能对多种环境污染物产生响应等特点被人们广泛的应用于污染物检测和预警研究中。蛤仔拥有开放式的循环系统，当受到环境胁迫时，血淋巴细胞参与细胞免疫发挥防御作用，是研究环境毒理的理想组织，可研究通过对DEHP胁迫下菲律宾蛤仔血细胞中免疫基因差异表达结果的筛查，得到了对DEHP响应灵敏的生物标记物。t
对于海洋环境中的污染物有精度较高化学方法，但是在应对突发的污染事故仍不够高效，以基因芯片为载体，利用生物标记的生物监测方法具有快速、高效的特点，是理想的检测工具。生物监测不仅能够在一定程度上反应环境中污染物的水平，更能够反应污染物的生物效应，克服了化学方法的局限性，不需要仪器维护等工作，扩大了使用范围。但是，目前国内外还没有公开任何关于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用的相关研究报道。t
发明内容t
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、检测快速的用于检测环境污染物DEHP的基因芯片及其制备方法和应用。t
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：t
1、一种用于检测环境污染物DEHP的基因芯片，包括点制在玻片上的探针，所述的探针包括探针1、探针2和探针3，所述的探针1核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的探针2核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的探针3核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。t
用于扩增探针1的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；用于扩增探针2的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；用于扩增探针3的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。t
2、一种用于检测环境污染物DEHP的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：t
a、总RNA的提取：取蛤仔体腔液制备RNA提取液；t
b、cDNA合成：取上述RNA提取液合成cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；t
c、PCR扩增：50μL扩增体系：10×Buffer10.0μL，dNTPmix4.0μL（终浓度200μM），TqDNA聚合酶（5U/μL）0.4μL，10μM的正反向引物各1μL，cDNA溶液1μL（10~100ng），ddH2O补充至50.0μL；扩增反应条件：95℃5min；94℃45s，55~58℃45s，72℃45s，35个循环；后延伸72℃10min；t
d、探针制备：将50μL异丙醇加入到PCR扩增产物中混匀，-20℃放置30min，4℃，12000g离心5min，取DNA沉淀，然后加入100μL体积浓度为75%的乙醇水溶液洗一次，12000g离心5min，小心去掉上清，干燥，加10μL无菌水溶解，得到探针溶液；t
e、芯片制备：取5μL探针溶液作为探针与5μL点样液混合，有序的点印在预制好的玻片上，设计阳性对照、阴性对照并以点样液为空白对照，即得到用于检测环境污染物DEHP的基因芯片。t
所述的探针溶液中包括包括探针1、探针2和探针3，所述的探针1核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的探针2核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的探针3核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。t
所述的引物溶液中包括t
用于扩增探针1的正向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示：t
5'-GGGACATATCCAATGGTGAC-3'，t
用于扩增探针1的反向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示t
5'-GCCCTCTTGCGTTCTAGTTT-3'；t
用于扩增探针2的正向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示：t
5'-TGCCCGTGCTTACTATTGAC-3'，t
用于扩增探针2的反向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示：5'-CCTTTCTTCCTCGTTATCCT-3'；t
用于扩增探针3的正向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示：t
5'-TGAGCGTTGAAGAAGGTTTG-3'，t
用于扩增探针3的反向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示：5'-CGGTTTACCGCAGTCTATCC-3'。t
3、用于检测环境污染物DEHP的基因芯片的应用，所述的应用是将基因芯片用于检测DEHP，具体步骤如下：t
（1）用于与基因芯片杂交的样品模板制备t
将菲律宾蛤仔暴露于预先设定终浓度的DEHP海水中，对照组暴露在相同体积的无水乙醇和海水中，胁迫36h后，取蛤仔体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞；将获得的血细胞立即用AxyPrep总RNA小量制备试剂盒进行总RNA的提取及纯化；将对照组进行Cy3荧光标记，处理组进行Cy5荧光标记；将获得的荧光标记过的cDNA用NucleoSpinExtractIIcDNA纯化试剂盒进行纯化；t
（2）检测芯片与样品杂交、洗片、扫描以及结果的鉴定t
a、杂交：将纯化、标记好的cDNA抽干，两处理组标记的DNA分别与对照组等体积混合后溶于30mL杂交液中，将之铺在基因芯片阵列上，轻轻盖上盖玻片，放入杂交盒内，于37℃下杂交16h；t
b、洗片：开启SlideWasher芯片洗干仪，进行仪器预热，将洗液I、洗液Ⅱ放置于42℃水浴锅中进行预热4min；芯片杂交结束后，将芯片对称放置到清洗架中，依次用洗液I、洗液Ⅱ进行清洗；芯片清洗后，将清洗架转移到芯片洗干仪的离心架上，离心除去芯片表明的液体后用于扫描；t
c、鉴定：样品与基因芯片杂交，探针2与探针3所对应的基因表达下调，探针1对应的基因表达变化不显著，则基因芯片对0.4mg/LDEHP响应灵敏；探针1与探针3所对应的基因表达上调，探针2对应的基因表达变化不显著，则基因芯片对4mg/LDEHP响应灵敏。t
所述的12μL杂交液体系，包括：1.8μL20×SSC；2.4μL1%SDS；1.2μL50×Denhart’s；3.0μL甲酰胺；3.6μL标记的样品。所述的洗液I由10倍稀释的20×SSC溶液，0.2%SDS；所述的洗液Ⅱ由100倍稀释的20×SSC溶液。t
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种用于检测海水环境中污染物邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（DEHP）的微阵列基因芯片及其制备方法和应用。本发明以双壳贝类菲律宾蛤仔（Venerupisphilippinarum）为研究对象，利用3个具有特异性响应的基因作为监测DEHP的生物标志分子，进行基因芯片的设计。其制备方法为总RNA的提取、cDNA合成、PCR扩增、产物片段回收、芯片制备及鉴定，鉴定快速、简便、特异和有效，若样品与基因芯片杂交，探针2与探针3所对应的基因表达下调，探针1对应的基因表达变化不显著，说明对0.4mg/LDEHP响应灵敏。探针1与探针3所对应的基因表达上调，探针2对应的基因表达变化不显著，说明对4mg/LDEHP响应灵敏。具有检测结果灵敏、快速、特异性强。本发明对DEHP污染的快速检测具有重要价值，初步建立了快速的DEHP检测方法。t
附图说明t
图1为本发明基因芯片点阵设计图（阳：阳性对照；Y：外标；阴：阴性对照；1：探针1；2：探针2；3：探针3）；t
图2为本发明0.4mg/LDEHP模板芯片扫描结果；t
图3为本发明4mg/LDEHP模板芯片扫描结果。t
具体实施方式t
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。t
具体实施例1t
一种用于检测环境污染物DEHP的基因芯片，包括点制在玻片上的探针，所述的探针包括探针1、探针2和探针3，其中t
探针1具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，片段长度为125bp，扩增探针1所用正向引物核苷酸序列是：5'-GGGACATATCCAATGGTGAC-3'，扩增探针1所用反向引物核苷酸序列是：5'-GCCCTCTTGCGTTCTAGTTT-3'；t
探针2具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，片段长度为200bp，扩增探针2所用正向引物核苷酸序列是：5'-TGCCCGTGCTTACTATTGAC-3'，扩增探针2所用反向引物核苷酸序列是：5'-CCTTTCTTCCTCGTTATCCT-3'；t
探针3具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，片段长度为179bp，扩增探针3所用正向引物核苷酸序列是：5'-TGAGCGTTGAAGAAGGTTTG-3'，扩增探针3所用反向引物核苷酸序列是：5'-CGGTTTACCGCAGTCTATCC-3'。t
具体实施例2t
一、DEHP生物标记物的发掘t
通过前期对菲律宾蛤仔不同组织中差异表达基因和蛋白时序表达变化的分析，获得了用于候选的分子标记物。t
二、基因芯片制备t
a、总RNA的提取：取蛤仔体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入RNAiso-plus试剂（购于Takara公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4°C，12000rpm，离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4°C，12000rpm，离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1mL，4°C，12000rpm，离心5min，去上清，沉淀静置5~10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液；t
b、cDNA合成：取3.0μg上述RNA提取液用PrimeScript?1stStrandcDNASynthesisKit（宝生物工程（大连）有限公司）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；t
c、PCR扩增：50μL扩增体系：10×Buffer10.0μL，dNTPmix4.0μL（终浓度200μM），TqDNA聚合酶（5U/μL）0.4μL，10μM的正反向引物各1μL，cDNA溶液1μL（10~100ng），ddH2O补充至50.0μL。扩增反应条件：95°C5min；94°C45s，55~58°C45s，72°C45s，35个循环；后延伸72°C10min；其中引物溶液中包括用于扩增探针1的正向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示：t
5'-GGGACATATCCAATGGTGAC-3'，t
用于扩增探针1的反向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示t
5'-GCCCTCTTGCGTTCTAGTTT-3'；t
用于扩增探针2的正向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示：5'-TGCCCGTGCTTACTATTGAC-3'，t
用于扩增探针2的反向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示：5'-CCTTTCTTCCTCGTTATCCT-3'；t
用于扩增探针3的正向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示：5'-TGAGCGTTGAAGAAGGTTTG-3'，t
用于扩增探针3的反向引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示：5'-CGGTTTACCGCAGTCTATCC-3'；t
d、探针制备：向PCR扩增产物中加入50μL异丙醇混匀，-20°C放置30min，4°C，12000g离心5min，沉淀DNA；然后加入100μL体积百分比为75%的乙醇水溶液洗一次，12000g离心5min，小心去掉上清，干燥，加10μL无菌水溶解，得到探针溶液；t
e、芯片制备：5μL探针溶液作为探针与5μL点样液混合，有序的点印在预制好的玻片上。设计阳性对照、阴性对照并以点样液为空白对照。芯片点阵设计如图1所示。t
具体实施例3t
一、低浓度杂交模板制备t
a、样品获得：实验室条件模拟DEHP胁迫菲律宾蛤仔，DEHP胁迫实验是将菲律宾蛤仔暴露于终浓度为0.4mg/L的DEHP的海水中；对照组是暴露在相同体积的无水乙醇和海水中；胁迫36h后，取蛤仔体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞；t
b、总RNA提取：将获得的血细胞立即用AxyPrep总RNA小量试剂盒进行总RNA的提取及纯化；t
c、RNA样品的标记及cDNA的获得：对照组进行Cy3荧光标记，处理组进行Cy5荧光标记：t
总RNA20ug补足8μLt
Oligo（dT）18primer1μLt
外标（无同源性基因片段）1μLt
65oC变性5min，室温放置10min；t
后再加入5×1ststrandbuffer4μLt
0.1mol/LDTT2μLt
dNTPmix1μLt
Cy3-dCTP或Cy5-dCTP1μLt
SuperScriptⅡ（SSCⅡ200U/μL）1μLt
42oC反应2h，冰浴2min；加入5μL终止液，70oC10min消化RNA，加入1μL10mol/L乙酸，其中反应终止液的配制方法为：取0.5mol/LEDTApH8.0100μL，10mol/LNaOH200μL，加无菌水1100μL至1.5mL离心管中，4oC保存；t
d、cDNA纯化：将获得的荧光标记过的cDNA用NucleoSpinExtractIIcDNA纯化试剂盒进行纯化，具体纯化方法依试剂盒说明书进行（德国MN）；t
二、杂交t
将纯化、标记好的cDNA抽干，两处理组标记的DNA分别于对照组等体积混合后溶于30mL杂交液中，包括：4.5mL20×SSC（购自索莱宝生物科技有限公司）；6.0mL1%SDS；3mL50×Denhart’s（索莱宝生物科技有限公司）；7.5mL甲酰胺（索莱宝生物科技有限公司）；9mL标记的样品（3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart’s，50%甲酰胺），将之铺在上述具体实施例二制备得到的基因芯片阵列上，轻轻盖上盖玻片，放入杂交盒内，于37oC下杂交16h。t
三、清洗t
开启SlideWasher芯片洗干仪（北京博奥），进行仪器预热，将洗液I、洗液Ⅱ放置于42oC水浴锅中进行预热4min；芯片杂交结束后，将芯片对称放置到清洗架中，按照下列清洗条件进行清洗：所述的洗液I由10倍稀释的20×SSC（索莱宝）溶液和0.2%SDS组成；所述的洗液Ⅱ由100倍稀释的20×SSC（索莱宝）溶液；t
芯片清洗后，将清洗架转移到芯片洗干仪的离心架上，设定转速为1000rpm，离心2min，离掉芯片表明的液体，此时芯片可用于扫描。t
四、扫描t
芯片扫描使用LuxScan10K双通道激光扫描仪（北京博奥）。开启电脑中LuxScan3.0软件，打开红色、绿色两个激光器，进行10min预热，载入芯片，进行扫描区域和扫描参数的设定。实验中以Cy3标记处理组样品，Cy5标记对照组样品，设置Cy5和Cy3通道的激光强度分别为82和75。Cy5和Cy3通道的光电倍增系数（PMTGain）分别为800和720。t
五、鉴定t
样品与基因芯片杂交，探针2与探针3所对应的基因杂交结果呈现绿色荧光，表达下调，探针1对应的基因杂交结果呈现黄色荧光，表达变化不显著，说明对0.4mg/LDEHP响应灵敏，如图2所示。t
具体实施例4t
同上述具体实施例3，其区别在于：杂交模板制备步骤中DEHP胁迫实验是将菲律宾蛤仔暴露于终浓度为4mg/L的DEHP的海水中。其鉴定结果为：探针1与探针3所对应的基因的杂交结果呈现红色荧光，表达上调，探针2对应的基因杂交结果呈现黄色荧光，表达变化不显著，说明对4mg/LDEHP响应灵敏，如图3所示。t
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。t
