用于靶水平的计算的使用数据排除的多重数字分析
优先权申请的交叉引用tt
本申请基于下列专利申请并根据美国法典第35篇第119条e款要求下tt列专利申请的利益：2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号tt61/759,772、2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,930tt和2013年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/759,931。这些优先tt权申请中的每个为了所有目的通过引用被全部并入本文。tt
其它材料的交叉引用tt
本申请为了所有目的通过引用全部合并下列材料：2006年5月9日颁tt布的美国专利号7,041,481、2010年7月8日公布的美国专利申请公布号tt2010/0173394A1、2011年9月8日公布的美国专利申请公布号tt2011/0217712A1、2012年6月21日公布的美国专利申请公布号tt2012/0152369A1、2013年2月14日公布的美国专利申请公布号tt2013/0040841A1、2013年12月6日提交的美国专利申请序列号14/099,750tt以及JosephR.Lakowicz的“PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy”(1999tt年第二版)。tt
介绍tt
数字分析通常依赖于检测在样本中的分析物的单独拷贝的存在或活tt动的能力。在示例性数字分析中，样本分成通常具有相等体积的一组分块，tt每个分块平均包含分析物的少于大约一个拷贝。如果分析物的拷贝随机地tt分布在分块当中，则一些分块应不包含拷贝，其它分块只包含一个拷贝，tt以及如果分块的数量足够大，又一些其它分块应包含两个拷贝、三个拷贝tt和甚至更高数量的拷贝。通过泊松分布描述了基于在分块中的分析物的给tttttt定平均浓度来找到在分块中的确切地0、1、2、3或更多拷贝的概率。相tt反，可从找到在分块中的给定数量的拷贝的概率估计在分块中(和因而在tt样本中)的分析物的浓度。tt
可在数字分析中测量找不到拷贝和找到一个或多个拷贝的概率的估tt计。每个分块可被测试以确定分块是包含分析物的至少一个拷贝的阳性分tt块还是不包含分析物的拷贝的阴性分块。找不到分块中的拷贝的概率可由tt阴性的被测试的分块的分数(“阴性分数”)近似，以及找到至少一个拷贝tt的概率由阳性的被测试的分块的分数(“阳性分数”)近似。阳性分数或阴tt性分数于是可用于例如使用泊松统计来确定分块中的分析物的浓度。tt
数字分析频繁地依赖于分块中的核酸靶的扩增以使分析物的单个拷tt贝的检测变得可能。可经由聚合酶链反应(PCR)进行扩增以实现数字PCRtt分析。所扩增的靶可以是分析物本身或在分块的形成之前或之后产生的分tt析物的替代物。可以可选地从包括在反应中的荧光探针检测靶的扩增。特tt别是，探针可包括提供指示靶是否被扩增的荧光信号的荧光团。tt
数字PCR分析可以是多重的以允许在每个分块内的两个或两个以上tt不同的靶的检测。可通过利用靶特异性探针来区分靶的扩增。然而在具有tt较高浓度的靶的多重分析中，其中两个或两个以上靶可一起存在于同一分tt块中，在分析内的不同分块群体常常产生重叠的信号振幅。这些分析的数tt据解释可能很难，所计算的靶浓度是不准确的。tt
需要用于提高多重数字分析例如其中数据没有被很好地分辨的分析tt的新方法。tt
概述tt
本公开提供了用于计算一个或多个靶的水平的多重数字分析系统，包tt括方法和装置。在示例性方法中，可从分块收集用于包括第一靶的多个靶tt的扩增的数据。可以从根据靶内容排除分块的数据的仅仅子集来计算第一tt靶的水平。tt
附图的简要说明tt
图1是根据本公开的方面的在包含通用报告物的分块中的靶上执行多tt重数字分析的示例方法的流程图，可选地，至少一个靶是至少部分地掩蔽tt在包含模糊靶和被掩蔽靶的分块中的另一靶的存在的模糊靶。tt
图2是根据本公开的方面的用于执行图1的多重数字分析的示例性系tt统的示意图。tt
图3是根据本公开的方面的可在单个检测通道中从共同包含与较高振tt幅信号相关的模糊靶(H)和与较低振幅信号相关的被掩蔽靶(L)的分块tt例如液滴收集的多重分析数据的示意性图表。tt
图3A是根据本公开的方面的可如在图3中的被收集的多重分析数据tt的示意性图表，但双-阳性分块(HL、HLL等)的群体展示在只包含靶Htt的分块的群体上的信号振幅的小的可检测到的增加，信号振幅的增加不足tt以分辨来自彼此的两个较高振幅群体，使得靶L仍然至少部分地由靶H的tt存在掩蔽。tt
图4是根据本公开的方面的通常可如在图3中的被收集的多重分析数tt据的示意性图表，但模糊靶(L)就具有比被掩蔽靶(H)低的振幅信号。tt
图5是根据本公开的方面的可在单个检测通道中从共同包含根据掩蔽tt等级结构连续地掩蔽彼此的K个靶的分块例如液滴收集的多重分析数据的tt示意性图表。tt
图6是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的示例性多重数tt字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有不同的长度tt的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可以用同一对正向(F)和tt反向(R)引物扩增且可经由同一探针(P)检测。tt
图7是根据本公开的方面的来自能够产生图4的数据的示例性多重数tt字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有不同的长度tt的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可用同一对正向(F)和反tt向(R)引物扩增且可经由扩增子(例如嵌入染料)的相同的通用报告物tt检测。tt
图8是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的另一示例性多tt重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有相同的tt长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在不同的效率下可用同一对正向(F)tt和反向(R)引物扩增且可经由同一探针(P)检测。tt
图9是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的又一示例性多tt重数字分析的分块的示意图，分块包含掩蔽靶(H)的拷贝和具有相同的tt长度的被掩蔽靶(L)的拷贝，每个在相同的效率下可用同一对正向(F)tt和反向(R)引物扩增且可在不同的效率下经由同一探针(P)检测。tt
图10是根据本公开的方面的来自能够产生图3的数据的再一示例性tt多重数字分析的分块的示意图，分块包含模糊靶的拷贝和被掩蔽靶的拷tt贝，每个在不同的效率下可用不同对的正向和反向引物(FH和RH或FL和ttRL)扩增且可经由不同的探针(PH和PL)检测。tt
图11是根据本公开的方面的来自使用单个检测通道执行的示例性多tt重数字分析的分块的示意图，分块包含靶A和靶B的拷贝，每个可用不同tt对的正向和反向引物(FA和RA或FB和RB)扩增且可经由通用报告物(例tt如嵌入染料)检测。tt
图11A是根据本公开的方面的可为图11的多重数字分析在单个检测tt通道中从五组分块(线道1-5)收集的荧光振幅数据的示意性图表，每组tt包含相同浓度的靶A和B、正向引物A和反向引物A和B以及靶B的可tt变浓度的正向引物B。tt
图12是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的示例性多tt重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶A的拷贝和掩蔽靶B的拷tt贝，每个在不同的效率下可用不同对的正向和反向引物(FA和RA或FB和ttRB)扩增且可经由具有不同荧光团标签的不同的探针(PA和PB)检测。tt
图12A是根据本公开的方面的可从图12的多重数字分析收集的扩增tt数据的示意性散布图，分块的三个不同的簇被顺序地编号并根据靶内容被tt识别。tt
图13是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的另一示例tttttt性多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶(A)的拷贝和掩蔽tt靶(B)的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(FA和RA或FB和RB)tt扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)和特异性探针(PB)检测。tt
图14是根据本公开的方面的可从图13的多重数字分析收集的扩增数tt据的示意性散布图，分块的三个不同的簇被顺序地编号并根据靶内容被识tt别。tt
图14A是根据本公开的方面的来自使用单个检测通道执行的示例性tt多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶(A)的拷贝和掩蔽靶tt(B)的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(FA和RA或FB和RB)tt扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)和特异性探针(PB)检测。tt
图14B是根据本公开的方面的可为图14A的多重数字分析在单个检测tt通道中从五组分块(线道1-5)收集的荧光强度数据的示意性图表，每组tt包含相同浓度的靶A和B和两对引物以及靶B的可变浓度的探针(PB)。tt
图15是根据本公开的方面的来自使用两个检测通道执行的另一示例tt性多重数字分析的分块的示意图，分块包含被掩蔽靶(A)、第二靶(B)tt和掩蔽靶(C)的拷贝，每个可用不同对的正向和反向引物(FA和RA、FB和RB或FC和RC)扩增且可经由通用报告物(例如嵌入染料)和特异性探tt针(PB和PC)检测。tt
图16是根据本公开的方面的可在检测靶A和C的扩增的第一通道中tt和在检测靶B的扩增的第二通道中从图15的多重数字分析收集的扩增数tt据的示意性散布图，靶阳性分块的五个不同的簇被顺序地编号并根据靶内tt容被识别。tt
图17是可从图15的多重数字分析收集的并如在图16中绘制的扩增tt数据的另一示意性散布图，除了图16的两个簇((A)和(AB))不再被tt分辨并形成具有异质靶内容的异质簇以外。tt
图18是根据本公开的方面的可从图15的多重数字分析收集的扩增数tt据的另一示意性散布图，但具有检测靶A和C的扩增的第一通道和检测靶ttA和B的扩增的第二通道，靶阳性分块的四个不同的簇被顺序地编号并根tttttt据靶内容被识别。tt
图19是根据本公开的方面的来自确定库的质量的示例性多重数字分tt析的分块的示意图，分块包含空库成员(没有插入物的适应物-适应物反向tt重复)的拷贝和包含插入物的库成员的拷贝，每个库成员可用同一引物(F)tt的两个拷贝扩增且可使用适应物特异性探针(P)探测。tt
图20是从在液滴中执行的图19的多重分析收集的扩增数据的图表。tt
图21是根据本公开的方面的来自量化样本中的拼接和未拼接物种的tt示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含未拼接物种(外显子-内含tt子-外显子)和拼接物种(外显子-外显子)，每个物种可用同一对正向和反tt向引物(F和R)扩增并可经由通用报告物检测。tt
图22是从在液滴中执行的图21的多重分析收集的扩增数据的图表。tt
图23是根据本公开的方面的来自量化样本中的拼接和未拼接物种的tt另一示例性多重数字分析的分块的示意图，分块包含未拼接物种(外显子tt-内含子-X-内含子-外显子)和两个不同的拼接物种(外显子-X-外显子和外tt显子-外显子)，每个物种可用同一对正向和反向引物(F和R)扩增并可tt经由通用报告物检测。tt
图24是从图23的多重分析收集的扩增数据的图表。tt
图25是根据本公开的方面的来自量化分块中的一对靶(靶A和B)tt的示例性多重数字分析的分块的示意图，所描绘的分块包含每个靶的拷贝tt和结合到靶中的仅仅一个(靶A)的仅仅单个报告物。tt
图26是根据本公开的方面的可在一对光学通道中从图25的多重数字tt分析收集的扩增数据的示意性图表，只有一个通道检测单个报告物，且图tt表具有顺序地编号(0、1和2)并根据靶内容识别的分块的三个不同的簇。tt
详细描述tt
本发明提供用于计算一个或多个靶的水平的多重数字分析系统，包括tt方法和装置。在示例性方法中，可从分块收集包括第一靶的多个靶的扩增tttttt的数据。可从根据靶内容排除分块的数据的仅仅子集计算第一靶的水平。tt
提供了执行多重数字分析的示例性方法。在该方法中，可提供混合物。tt混合物可包括多个靶和足以用于每个靶的扩增的试剂，多个靶包括第一tt靶。可形成分块，每个分块包括混合物的一部分。可在分块中扩增多个靶。tt可从多个分块收集用于多个靶中的每个靶的扩增的数据。可从数据的仅仅tt一部分计算第一靶的水平。多个靶也可包括第二靶。数据的该部分可以或tt可以不排除对第二靶为阳性的每个分块测试。tt
在一些实施方式中，可在数据中识别分块群体，每个分块群体具有多tt个靶的不同靶内容。可从多个分块的仅仅子集收集数据的该部分，且分块tt的子集可以排除两个或两个以上分块群体。两个或两个以上排除的分块群tt体可包括不在数据中分辨开彼此的至少一对排除的分块群体。至少一对排tt除的群体可相对于第一靶是异质的。tt
在一些实施方式中，数据可以是可绘制的以形成数据点的三个或三个tt以上簇。每个数据点可代表分块。每个簇可具有多个靶的不同内容。可以tt从排除数据点的至少一个簇的数据的仅仅一部分计算第一靶的水平。至少tt一个被排除簇可包括由代表至少两个被排除的分块群体的数据点的重叠tt集合组成的异质被排除簇。至少一个被排除的分块群体对于第一靶可以是tt阳性的，且至少一个被排除的分块群体对于第一靶可以是阴性的。tt
本公开的数字分析可具有很多优点，例如较高水平的多重性、单独地tt或结合至少一个特异性报告物使用通用报告物的多重性、对在数据中不可tt区别的和/或未很好地分辨的分块群体的靶水平(例如浓度)的确定、使用tt在分块内的竞争性分析的靶水平的确定或其任何组合等。tt
在下面的章节中介绍本公开的另外的方面：(I)使用通用报告物的多tt重数字分析的概述，(II)被掩蔽靶的浓度的确定，(III)具有靶掩蔽的示tt例性分析配置，(IV)使用特异性报告物和通用报告物的多重分析，以及tt(V)实例。tt
I.使用通用报告物的多重数字分析的概述
本章提供了使用通用报告物执行的多重数字分析的概述，其中分块中tttttt的靶的存在至少部分地被同一分块中的不同靶的存在掩蔽；见图1和2。tt数字分析可利用如在第II章和本文的其它地方描述的数据排除来计算一个tt或多个靶的水平。tt
图1示出使用通用报告物、可选地使用靶掩蔽来执行多重数字分析的tt示例性方法50的流程图。可以按任何适当的顺序和在任何适当的组合中tt执行对方法50提出的步骤。此外，步骤可与本公开的任何其它适当的步tt骤、方面和/或特征——包括在通过引用并入本文的交叉引用下在上面列出tt的专利文档中描述的那些——组合，和/或由这些步骤、方面和/或特征修tt改。tt
样本制备。样本可被制备用于分析，在52指示。样本的制备可包括tt样本的任何适当的操纵，例如收集、稀释、集中、纯化、冻干、冰冻、提tt取、与一个或多个分析试剂组合以形成混合物(也被称为含样本混合物、tt体相或反应混合物)、至少一个预备反应的执行以为在分析中的一个或多tt个反应制备样本或其任何组合等。制备可隔离分析物，例如包括一个或多tt个核酸靶的拷贝的核酸，和/或可改性和/或分解分析物。样本的制备可包tt括使样本变得能胜任一个或多个反应例如一个或多个酶催化反应和/或结tt合反应的随后执行。tt
在一些实施方式中，样本的制备可包括组合样本与试剂以产生含样本tt混合物用于执行对每个靶的反应(例如扩增反应)和用于报告每个反应的tt程度(例如是否反应出现在阈值水平之上或在一范围内)。用于扩增的试tt剂可包括靶的引物、dNTP和/或NTP、至少一种酶(例如多聚酶、连接酶、tt逆转录酶、限制酶或其组合等，其中每个可以或可以不是热稳定的)和/tt或类似物的任何组合。相应地，混合物可具有用于(即能胜任)在适当的tt环境条件(例如在升高的温度下的培养或温度的调节(例如通过热循环))tt下每个靶的扩增的一组完整的试剂。混合物可能能够扩增一个或多个靶中tt的每个，如果存在于样本(或其分块)中。用于报告的试剂可包括至少一tt种通用报告物和/或至少一种特异性报告物。通用报告物可对每个靶的扩增tt敏感，且特异性报告物可对靶的仅仅子集例如仅仅一个靶的扩增特别敏tt感。混合物可以或可以不包括待分析的每个靶的不同报告物。混合物的制tttttt备可使得样本能够在逐个靶的基础上，对诸如扩增的反应是否出现和可选tt地任何这样的反应的程度进行报告或被分析。tt
提供分块。可提供用于分析的分块，在54处指示。每个分块可包括tt同一混合物的一部分。在一些情况下，该部分可构成整个分块。混合物可tt包含每个靶(例如由同一样本提供)、每个报告物和/或一个或多个扩增试tt剂(例如用于每个靶的扩增的完整的一组试剂)。相应地，分块可共同包tt含多个靶，且每个分块可包含相同的通用报告物和可选地同一特异性报告tt物。靶可包括至少一个可掩蔽靶(可互换地被称为被掩蔽靶)和至少一个tt模糊靶(可互换地被称为掩蔽靶或优势靶)。当每个靶的拷贝存在于同一tt分块中时，模糊靶能够至少部分地掩蔽一个或多个可掩蔽靶的存在。tt
分块在被提供(例如当形成)时可包含在“不全占位”下的每个靶，tt这意味着分块的仅仅子集的每个分块包含待分析的每个靶(和/或模板)的tt至少一个拷贝。例如，在第一靶和第二靶上执行多重分析时，只有分块的tt第一子集包含第一靶，且只有分块的第二子集包含第二靶。分块的第一子tt集和第二子集可以是同一子集，如果当分块形成时第一靶和第二靶完全与tt彼此相关和/或链接到彼此。可选地，如果当分块形成时第一靶和第二靶不tt完全与彼此相关和/或链接到彼此，则分块的第一子集和第二子集可以是不tt同的。在一些情况下，如果靶不完全相关和/或链接，则分块的不同的第三tt子集的每个分块可包含每个靶的至少一个拷贝。相应地，在不全占位的情tt况下，一个或数个(例如多个)分块不包含第一靶的拷贝，一个或数个(例tt如多个)分块可包含第一靶的单个拷贝(仅仅一个拷贝)，且可选地，又tt一个或数个分块(例如分块的其余部分)可包含第一靶的两个或两个以上tt拷贝。类似地，在不全占位的情况下，一个或数个(例如多个)分块不包tt含第二靶的拷贝，一个或数个(例如多个)分块可包含第二靶的单个拷贝tt(仅仅一个拷贝)，且可选地，又一个或数个分块(例如分块的其余部分)tt可包含第二靶的两个或两个以上拷贝。tt
术语“不全占位”并不限于在任何分块中有感兴趣的特定模板/靶的不tt多于一个拷贝的情况。在不全占位下包含模板和/或靶的分块在分块被提供tt或形成时可例如每分块包含模板/靶的多于或少于、大约一个拷贝、两个拷tttttt贝或三个拷贝等的平均。模板(和/或靶)的拷贝可具有在分块当中的随机tt分布，其可被描述为泊松分布。在一些情况下，相当大数量的分块(例如tt分块的至少大约1％、2％、5％、10％或20％等)可包含至少两个靶中的每tt个的拷贝，和/或多个分块每个可包含所有靶的至少一个拷贝。tt
当分块形成时，靶可以是未链接的、部分链接的或完全链接的。链接tt的靶可共价地或通过碱基配对附着到彼此。tt
每个靶可以是感兴趣的分析物(例如感兴趣的核苷酸序列)或对此的tt替代物(例如结合到和/或相应于感兴趣的核苷酸序列的核酸)。靶可以是tt包括核苷酸序列的核酸。靶如果是核酸则可以是单链的或双链的等。核酸tt靶可由模板提供，靶形成模板的至少一部分或全部。靶可相应于通过扩增tt产生的扩增子。扩增子可以是单链的或双链的等。在一些情况下，靶可以tt是或相应于不是核酸的分析物，例如小分子、多肽、脂质、氨基酸、离子tt等。tt
可通过将含样本体相的部分分配或分离成分块来提供分块。包括多达tt所有体相的任何适当的分数可被分配到分块。每个分块可以是和/或包括与tt其它分块的流体体积隔离的流体体积。分块可通过流体相例如乳剂的连续tt相、通过固体相例如容器的至少一个壁或其组合等与彼此隔离。在一些实tt施方式中，分块可以是布置在连续相中的液滴，使得液滴和连续相共同形tt成乳剂。tt
分块可通过任何适当的程序以任何适当的方式形成且具有任何适当tt的特性。例如，分块可用流体分配器例如吸液管形成、用至少一个液滴发tt生器、通过样本的搅动(例如摇动、搅拌、超声处理等)而形成和/或类似tt地形成。相应地，分块可连续地、并行地或批量地形成。分块可具有任何tt适当的一个或多个体积。分块可具有实质上均匀的体积或可具有不同的体tt积。具有实质上相同的体积的示例性分块是单分散液滴。分块的示例性体tt积包括小于大约100、10或1μL、小于大约100、10或1nL或小于大约tt100、10或1pL等的平均体积。tt
分块当最初形成时可胜任在分块中的一个或多个反应的执行。可选tt地，一个或多个试剂可被添加到分块——在它们形成之后，以提供能胜任tttttt反应的分块。可通过任何适当的机制例如流体分配器、分块/液滴的融合等tt添加试剂。tt
反应的执行。可在分块中执行相应于每个靶的反应，在56处指示。tt反应可以是酶催化反应。反应可产生可在反应期间线性地或指数地等增加tt的产物。tt
每个靶的反应可以是扩增存在于单独的分块中的靶的拷贝的扩增反tt应。每个靶的扩增可选择性地出现在包含靶的至少一个拷贝(例如包含包tt括靶的模板的至少一个拷贝)的分块中。扩增可以是线性地或指数地等。tt
扩增可以或可以不等温地执行。在一些情况下可通过在一个或多个周tt期期间加热分块和/或在高于室温的温度下例如在变性温度、退火温度和/tt或延展温度下培养分块来激励在分块中的扩增。在一些例子中，分块可热tt循环以促进聚合酶链反应和/或连接酶链反应。可以是适当的示例性等温扩tt增方法包括基于核酸序列的扩增、转录介导扩增、多重置换扩增、链置换tt扩增、滚环扩增、DNA的环介导扩增、赖解旋酶扩增和单引物扩增等。tt
数据收集。可从分块中的报告物收集数据，在58处指示。分块可以tt包含仅仅一个报告物或具有任何适当的结构和特征的多个不同的报告物。tt每个报告物可以是特异性报告物(例如探针)或通用报告物(例如嵌入染tt料)。在一些情况下，至少一个特异性报告物可就仅仅一个特定的反应和tt因而在多重分析中的仅仅一个靶的出现提出报告。在其它情况下，特异性tt报告物可就两个或两个以上反应和因而两个或两个以上靶的出现提出报tt告。每个报告物可互换地可被称为反应报告物和/或扩增报告物。tt
特异性报告物基于产物的同一性以相当大的特异性结合到反应的产tt物(例如扩增子)，实质上排除与产物同一类别的其它结构上不同的物质。tt例如，每个特异性报告物可结合到特定序列或部位，实质上排除其它序列tt或部位。特异性报告物可包括或可以是包括至少一个核酸(例如至少一个tt寡核苷酸)的探针，其特别结合到存在于靶和/或相应于靶的扩增子中的互tt补核苷酸序列。探针可包括与寡核苷酸(例如共价地附着或非共价地结合tt等)相关的标签。标签可以是直接或间接地光学地可检测的。因此，标签tt可以是发光基团(例如光致发光部分(例如荧光团或磷光粉)、酶(例如tttttt过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶等)、特定的结合对tt的成员(例如生物素或抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白)或表位标签等。tt包括发光基团的探针可以或可以不也包括发光基团的能量转移伙伴，例如tt淬熄剂或另一发光基团(例如以产生发光共振能量转移(例如FRET))。tt探针可以或可以不也起在分析中扩展的引物的作用。示例性标记的探针包tt括探针、探针/引物、探针、探针、tt分子信标探针、引物、当相邻于彼此结合在扩增子上时展示FRET的tt杂化探针的接近相关对、引物等。tt
特异性报告物可具有不同的形式或状态。特异性报告物可具有初始/tt完整的形式或状态和一个或多个降解/改性的形式或状态。可在第二靶的扩tt增期间从初始/完整的形式或状态产生一个或多个降解/改性的形式或状tt态。形式或状态可以是光学地可区分的。例如，降解/改性的形式可以是比tt初始/完整的形式更光致发光的或更不光致发光的。tt
通用报告物(可互换地被称为非特异性报告物)在没有相当大的特异tt性的情况下结合到反应的产物(例如扩增子)，使得与该产物相同类别的tt其它结构上不同的物质(例如不相关的序列的其它扩增子)也可由报告物tt结合。非特定结合可以不取决于报告物和产物(例如靶和/或扩增子)中的tt一个或两个的原子的布置的唯一特征。通用报告物的多个拷贝可能能够结tt合到反应产物的单个拷贝，例如所结合的拷贝的数量与反应产物的数量或tt长度直接相关例如成比例。例如，通用报告物可以是相对非特异地结合到tt核酸的光致发光染料。染料可以不附着到赋予相当大的序列结合特异性的tt寡核苷酸。染料可以是大沟结合剂、小沟结合剂、嵌入剂或外部结合剂等。tt相对于单链核酸，染料可以优先结合到双链和/或相对于单链核酸，可在结tt合到双链时展示在光致发光特性(即发射强度)中的较大变化。可以是适tt当的示例性染料包括发光花青、菲啶、吖啶、吲哚、咪唑等，例如DAPI、tt33258染料、吖啶橙等。可以是适当的示例性嵌入染料包括菲啶tt溴红、碘化吡啶、染料、绿染料、金染料和7-tt氨基放线菌素D(7-AAD)等。tt
可在多重分析中分析R个靶，且可在少于R个光学通道中(例如在不tttttt同的波带中)收集数据。换句话说，被分析的靶的数量(R)可以大于用tt于检测靶特定反应的光学通道的数量。在一些情况下，可以在仅仅一个或tt两个光学通道中或在至少两个、三个或三个以上光学通道中等收集数据。tt在一些情况下，可从与在分析中的靶相同数量的光学通道收集数据。光学tt通道可互换地可被称为检测通道。tt
光学通道可代表特定的检测体系，发射光使用该检测体系被产生和检tt测。该检测体系可以以用于发射光的检测的频谱内容(即波长体系)为特tt征。如果脉冲激发光在检测体系中用于引起光发射，则检测体系可以以用tt于使用激发光照亮的频谱内容(波长或波段)和/或时间间隔(在其期间，tt光发射关于每个光脉冲被检测到)为特征。相应地，彼此不同的光学通道tt可关于激发光的频谱内容(波长/波段)、关于被检测到的发射光的频谱内tt容(波长/波段)和/或关于时间间隔(在其期间，发射光相对于激发光的tt每个脉冲被检测)等不同。tt
数据收集可包括产生代表检测到的光的一个或多个信号。信号可代表tt在来自两个或两个以上不同的靶的一个或多个报告物的相同光学通道中tt检测的光的方面，例如光的强度。信号可选地可包括在两个或两个以上不tt同的光学通道中(例如在不同的波长和/或不同的波长范围(波段)和/或tt颜色体系下)从相同和/或不同的靶的报告物收集的数据。从每个报告物检tt测的光可以是从发光基团(例如荧光团)发射的光。在给定通道中检测的tt光可被检测，使得来自不同的报告物的光被合计或累积而没有对特异性报tt告物的贡献。因此，给定通道的信号可以是代表两个、三个、四个或更多tt个报告物和/或分析以及两个、三个、四个或更多个靶的复合信号。tt
可基于由通用报告物发射的检测到的光和可选地从分块中的一个或tt多个其它报告物来创建信号。一个或多个其它报告物可报告由信号表示的tt两个或两个以上特定的扩增反应中的至少一个是否出现在分块中，以及因tt此相应于两个或两个以上特定扩增反应的两个或两个以上特定靶中的至tt少一个的至少一个拷贝是否存在于分块中。相应于报告物的信号的水平或tt振幅可被分析以确定是否至少一个特定反应出现以及一个特定靶的至少tt一个拷贝存在。信号的水平或振幅可根据是否至少一个特定反应出现以及tttttt至少一个特定靶在每个分块中存在或缺乏而在分块当中改变。例如，对特tt定靶为阳性的分块可产生在给定阈值之上和/或在给定范围之内的信号水tt平或振幅。分块被分析，并且可在任何适当的时间创建信号。示例性时间tt包括分析的末尾(端点分析)，当反应运行到完成且数据不再改变时或在tt某个更早的时间，只要数据被足够和可靠地分离。tt
可在任何适当的条件下从多个分块(即分块的仅仅子集或全部)收集tt数据。可在大约相同的温度下从多个分块、在低于每个扩增子的熔化温度tt的温度下和/或在大约50摄氏度之下等收集所有数据。可在对每个靶到达tt扩增的端点之后收集扩增数据。tt
可识别每个对零、一或多个靶的至少一个不同的组合是阳性的分块tt簇。通常，如果掩蔽出现，则所有可能的组合的仅仅子集可被识别，且一tt些簇可包含具有不同的靶成分的两个或两个以上群体。可由数据处理器使tt用算法(例如识别数据中的模式(例如分块簇)的算法)、由用户或其组tt合执行识别。在一些情况下，数据处理器可产生并输出(例如显示)所收tt集的数据的图表(例如2D散布图或柱状图，或使用用于检测的三个或三tt个以上光学通道、具有不同对的轴的两个或两个以上2D散布图或柱状图)。tt用户可接着基于图表来界定每个簇的边界，例如通过图形用户界面来界定tt群体边界和/或通过输入值(例如代表强度范围)来界定每个簇的边界。每tt个簇边界可由值的一个或多个范围、围绕簇的几何形状(例如多边形、椭tt圆形等)等界定。下面在第II-V章中提出簇识别的另外的方面。tt
本文公开的任何多重分析的反应成分和/或条件可被调节以提高在数tt据中的不同分块群体的分辨率。通过在多重分析内改变特定分析物的浓tt度，特定靶的反应效率可被影响，这可导致在允许使用相同的报告物和/tt或不同的报告物检测的群体彼此区分开的信号水平中的差异。通过改变反tt应成分/条件，额外的靶可在同一多重反应中被检测到。在一些情况下，可tt通过改变靶的一个或两个引物的浓度来调节靶的信号振幅。改变引物浓度tt而不改变报告物浓度可能在分析中是有用的，其中相同的报告物(例如探tt针或通用报告物)用于检测两个或两个以上靶，但这两个靶中的每个使用tt至少一个不同的引物被扩增。在一些情况下，可通过改变用于热循环的退tttttt火温度、dNTP的总浓度、单独的dNTP相对于彼此的数量(例如，如果tt这两个靶具有实质上不同的基本成分)等来调节一个或多个靶的信号振tt幅。tt
可得到每个分块簇的分块计数。分块计数可以是代表构成特定分块簇tt的分块的数量的值。tt
可从所收集的数据确定对每个靶为阳性(或阴性)的分块的数量。从tt每个分块检测的信号和分块本身可被分类为对促成信号的每个反应/靶是tt阳性的或阴性的。分类可基于信号的强度(和/或其它适当的方面)。例如，tt分类可基于在信号光学通道中或在两个或两个以上光学通道中从分块检tt测的光的强度。如果信号/分块对于给定靶被分类为(测试)阳性的(+)，tt则相应于那个靶的反应被认为出现且靶的至少一个拷贝被认为存在于分tt块中。相反，如果信号/分块对于给定靶被分类为阴性的(-)，则相应于那tt个靶的反应被认为没有出现且靶没有拷贝被认为存在于分块中(即靶被认tt为从分块缺乏)。tt
包括靶的所有组合(即每个靶的存在或缺乏的所有组合)的数据将通tt常代表2R个群体，每个具有不同的靶内容，其中R是不同靶的数量。例tt如，在三个靶(A-C,R＝3)的情况下，有八个群体：()、(A)、(B)、(C)、tt(AB)、(AC)、(BC)和(ABC)，每个具有不同的靶内容。如果靶掩蔽出现，tt则一些群体将重叠和/或将彼此不区分开为很好地分辨的簇。替代地，一些tt群体可彼此重叠以形成具有一个或多个靶的异质靶内容的至少一个异质tt群体。相应地，使用靶掩蔽和/或使用如在本公开的其它地方描述的其它分tt析配置可产生少于2R个很好地分辨的簇。tt
靶浓度的确定。可确定每个靶的浓度，在60处指示。可从所收集的tt数据的子集确定至少一个靶的浓度。例如，可从数据的仅仅子集确定至少tt一个被掩蔽靶的浓度。数据的子集可以选择性地排除对至少部分地使在包tt含两个靶的拷贝的分块中的被掩蔽靶的存在模糊的模糊靶为阳性的分块。tt
可排除分块的任何适当子集，用于计算给定靶的浓度，而不使所确定tt的浓度偏移，如果排除的基础独立于靶的存在/缺乏。例如，在靶A和Btt的分析中，可从靶A的浓度的计算中排除所有B阳性分块(或其任何适当tttttt的子集)，如果对B为阳性独立于A的存在或缺乏。(例如，当分块形成时tt没有在靶A和B之间的相当大的关联或联系)。相应地，如果所有B阳性tt分块存在于同一簇(两个或两个以上簇)中，则可从靶A的浓度的计算排tt除整个簇(或两个或两个以上簇)，而不使结果偏移。作为另一例子，在tt未链接的靶A、B和C的分析中，可确定靶A的浓度，所有B阳性和所有ttC阳性被排除，只有B阳性或只有C阳性被排除，或独立于A的存在/缺tt乏的B阳性和C阳性的任何组合被排除(例如所有BC阳性，而不考虑Att阴性或A阳性)。在同一分析中，可从所有数据确定靶B(或靶C)的浓tt度，如果从缺乏靶B(靶C)的拷贝的所有其它群体分辨所有B阳性(或tt所有C阳性)。可选地，可从排除独立于B(或C)的存在/缺乏的分块的tt数据的仅仅子集确定靶B(或靶C)的浓度。tt
靶浓度的确定可以(或可以不)基于具有在分块当中的泊松分布的每tt个靶。每个浓度可以例如是代表每分块靶的拷贝的平均数量的值。分块数tt据还可以用于使用任何适当的算法来(例如直接地和/或作为浓度数据)估tt计拷贝数(CN)和拷贝数变化(CNV)。tt
可使用泊松统计来确定每个靶的水平例如浓度。可通过假设靶的拷贝tt(在扩增之前)在分块当中具有泊松分布来从对靶为阳性的分块的分数tt(或同样地，对靶为阴性的分块的分数)计算在分块中的靶的浓度。使用tt这个假设，具有靶的k个拷贝的分块的分数f(k)由下面的等式给出：tt
在这里，λ是在分块中的靶的浓度，其被表示为每分块靶拷贝的平均数量tt(在扩增之前)。简化的泊松等式可从上面的更一般的等式得到并可用于tt从阳性分块的分数确定靶浓度。可被使用的示例性泊松等式如下：tt
其中N+是对给定靶为阳性的分块的数量(即分块计数)，且其中Ntot是对tt靶为阳性或阴性的分块的总数。Ntot等于(a)靶的N+和(b)对靶为阴性tt的分块的数量或N–的和。N+/Ntot(或N+/(N++N–)等于f+，其是对靶为阳tttttt性的分块的分数(即f+＝f(1)+f(2)+f(3)+…)(见等式1)，且其是分块具有tt靶的至少一个拷贝的概率的所测量的估计。可被使用的另一示例性泊松等tt式如下：tt
其中N–和Ntot如上定义。N–/Ntot等于f0，其是阴性分块的分数(或1–f+)，tt是分块没有靶的拷贝的概率的所测量的估计，且λ是如上所述的靶浓度。tt
上面的等式2和3可重新布置以产生下式：tt
λ＝ln(Ntot)-ln(Ntot-N+)(4)tt
上面的等式2和3可重新布置以产生下式：tt
λ＝ln(Ntot)-ln(N-)(5)tt
可例如对每个靶使用对Ntot和N–或N+得到的值(即分块计数)使用tt等式2-5中的任一个来在多重分析中确定每个靶的浓度。在一些情况下，tt用于Ntot(总分块计数)的值对于每个靶可以是相同的。在其它情况下，tt用于Ntot的值可改变，例如，如果一些群体由于群体重叠(靶掩蔽)而从tt总计数排除。在一些实施方式中，Ntot可以等于所有群体的组合，即对所tt识别的所有群体的分块计数的和。tt
用于N–或N+的值通常对于每个靶是不同的，且可从合计来自多个分tt块群体的计数产生，每个分块群体包含在多重分析中测试的靶的不同组tt合。例如，在多重分析中的三个靶(A、B和C)的情况下，对靶A为阳tt性的分块的数量N+A可被计算为来自单(仅仅A)、双(AB和AC)和三tt(ABC)阳性群体的计数的和，用于在等式2或4中使用。同样，可计算tt对靶A为阴性的分块的数量N–A，用于在等式3或5中使用，作为在Ntot和N+A之间的差异。可选地，对A为阴性的分块的数量可被计算为来自对tt靶A为阴性的每个分块的计数的和，即在这个例子中的三阴性(“空”)群tt体、两个单阳性群体(B和C)和一个双阳性群体(BC)。可使用来自群tt体的适当子集的分块计数对每个其它靶重复相同的过程。tt
在一些实施方式中，可直接从阳性分数得到靶的水平的估计，而不使tttttt用泊松统计。特别是，当浓度降低时，阳性分数和浓度(每分块拷贝)收tt敛。例如，在0.1的阳性分数的情况下，浓度使用等式2被确定为大约0.105，tt只有5％的差异；在0.01的阳性分数的情况下，浓度被确定为大约0.01005，tt只有0.5％的更小10倍的差异。然而，泊松统计的使用可提供浓度的更准tt确的估计，特别是使用相对更高的阳性分数，因为该等式解释每分块多个tt靶拷贝的出现。tt
图2示出用于执行图1的数字分析的示例性系统70。系统70可包括tt分配组件，例如液滴发生器72(“DG”)、热培养组件例如热循环器74tt(“TC”)、检测组件(检测器)76(“DET”)和数据处理组件(数据处理tt器)78(“PROC”)或其任何组合等。数据处理组件可以是或可包括在控tt制器中，控制器可与组件的任何适当组合通信并控制组件的任何适当组合tt的操作。在组件之间的箭头指示材料例如流体(例如乳剂的连续相)和/tt或分块(例如液滴)或信号/数据在组件之间的运动或传送。组件的任何适tt当组合可操作地连接到彼此，和/或一个或多个组件可以不连接到其它组tt件，使得例如材料/数据被手动地传送。tt
检测器76可提供多个光学通道，其中数据可被收集。检测器对每个tt光学通道可具有不同的传感器或检测单元。tt
系统70可如下操作。液滴发生器72可形成布置在连续相中的液滴。tt液滴可用热循环器74热循环以促进在液滴中的靶的扩增。可使用检测器tt76从液滴检测信号。信号可由处理器78处理以确定液滴的数量和/或靶浓tt度等。系统可包括可选地存在于计算机可读存储介质上并包括用于使数据tt处理器和/或控制器执行和/或控制在本文例如在图1中公开的步骤的任何tt适当组合的指令的程序。tt
在第II-V章中和在上面在通过引用并入本文的交叉引用下识别的参tt考资料中描述了可适合于本公开的系统的样本制备、分块形成(例如液滴tt产生)、数据收集、群体识别和/或簇分配、得到分块计数和靶水平确定等tt的另外的方面。tt
II.被掩蔽靶和掩蔽靶的浓度的确定
本章描述确定当靶掩蔽出现时和/或当分块群体在所收集的数据中彼tt此重叠时的靶浓度的示例性方法；见图3-5。tt
在使用用于检测的两个或两个以上光学通道执行的一般双重(两靶)tt分析中，在相同的分块中的不同靶的存在导致在不同通道中的信号。然而tt在一些情况下，只有一个检测通道可由双重分析利用，这可使一个靶掩蔽tt另一靶的可检测性。例如，当明显不同的扩增效率的两个扩增子在同一液tt滴中产生并可经由同一通用报告物例如从得到的染料检测时，掩tt蔽可出现。更慢地累积的扩增子的存在可由更快地累积的扩增子掩蔽(例tt如见实例2)。可在下一代序列(NGS)库形成中找到另一实例。只包含一tt对适应物而没有插入物的产物可在竞争中胜过完全形成的物种且因此在tt单通道分析中掩蔽它们(例如见实例1)。本公开使产生靶掩蔽的一对竞争tt的靶的浓度的鲁棒计算变得可能。tt
在单通道分析中，可能准确地测量所提供的多个竞争物种的浓度：(1)tt物种产生不同的信号水平，(2)物种的等级次序掩蔽或抑制存在，以及(3)tt信号分离成条带模式，允许在带中的分块的计数。在实践中这样的情况的tt例子包括可变尺寸扩增子，例如mRNA相对于前体RNA、具有小插入或tt删除的基因座、NGS库定量等。tt
图3示出可在单个检测通道中收集的扩增数据的示意性图表。该图表tt绘制作为检测到的事件数的函数的信号振幅(例如光致发光强度，例如荧tt光强度)。每个事件代表由检测到的分块90(例如流经检测区的液滴92)tt引起的在信号强度中的尖峰信号或波。对每个分块/事件绘制的振幅可以是tt相应的尖峰信号或波的最大信号值、平均信号值或积分信号值等。图3的ttx轴可选地可被标记为时间或分块数等。tt
由图3的数据表示的分块共同包含产生相应的典型的更高和更低振幅tt信号的掩蔽靶94(“H”)和被掩蔽靶96(“L”)。当靶H的至少一个拷贝tt存在于分块中时，更高振幅信号占优势，如在98由一组H阳性分块例示tt的。从每个H阳性分块检测更高振幅信号，而不管靶L的拷贝是否也存在tt于分块中。换句话说，通过靶H的扩增产生的信号掩蔽来自靶L的扩增tt的信号，因为相比于只通过靶H的扩增产生的信号，靶L不明显增加(或tttttt降低)信号振幅。相反，当只有靶L的一个或多个拷贝存在于分块中时(即tt在缺乏靶H的任何拷贝的情况下)，从分块检测较低振幅信号，如在100tt由一组L阳性、H阴性分块例示的。单独的分块例如不包含任一靶(“空”tt或“阴性”；缩写的“E”)的拷贝的分块102产生甚至更低的基线信号。tt相应地，分块的三个带104、106、108在图表中是可见的。(带可互换地tt被称为簇。)带104代表H阳性分块(±L)，带106代表是H阴性的L阳tt性分块，以及带108代表H和L阴性分块。tt
可确定在每个带中的分块的数量(可互换地被称为计数)，且例如使tt用第I章的等式5来计算每个靶的浓度。然而，使用这种方法将低估被掩tt蔽靶L的浓度，如果在计算中包括所有分块。相应地，只有数据的子集可tt用来确定靶L的浓度。tt
用于计算特定因子(例如单个物种或靶、物种或靶的组合等)的浓度tt值(每分块拷贝(cpp))的通用公式如下：tt
λ因子＝ln(Ntot)-ln(N非因子)(6)tt
其中λ因子是因子的以cpp单位的浓度，Ntot是所观察的分块的总数，以及ttN非因子是不展示因子的分块的数量(其在等式3和5中被写为N-)。tt
因为所有H阳性分块是可检测的，下面的等式成立：tt
λH＝ln(NE+NL+NH)-ln(NE+NL)(7)tt
其中λH是掩蔽靶H的浓度，NE是空分块的数量，NH是更高振幅分块的数tt量，以及NL是更低振幅分块的数量。tt
被掩蔽靶L的存在独立于在分块中的掩蔽靶H的存在。相应地，H阳tt性分块相对于靶L是不偏的。换句话说，可从被掩蔽靶L的浓度计算排除ttH阳性分块。换句话说，从较低带106、108计算的靶L的浓度应是与从tt所有三个带计算的浓度相同的缺乏统计变化(如果L靶未被掩蔽)。解释tt这种方法的另一方式是，如果由于某个原因更高振幅分块变得不可见，且tt只有更低振幅和空(阴性)带是可见的，则靶L的浓度仍可被准确地计算tt如下：tt
λL＝ln(NE+NL)-ln(NE)(8)tt
总靶浓度(即L或H的浓度)可以用两种不同的方式被计算。第一种tt方法如下：tt
λL或H＝ln(NE+NL+NH)-ln(NE)(9)tt可选地，可将被单独地计算的靶L和H的两个浓度求和：tt
λL或H＝λH+λL(10)tt用来自等式7和8的项代入产生下式：tt
λL或H＝[ln(NE+NL+NH)-ln(NE+NL)]+tt
[ln(NE+NL)-ln(NE)](11)tt
等式11简化到下式：tt
λL或H＝ln(NE+NL+NH)-ln(NE)(12)tt
因此，这两种方法给出相同的答案。在任何情况下，更一般地，可从tt分块的仅仅子集计算每个被掩蔽靶的浓度，该子集选择性地排除对至少部tt分地使被掩蔽靶的存在模糊的模糊靶为阳性的分块的每个群体。tt
图3A示出可如在图3中的收集的数据的另一示意性图表。在这里，tt双阳性分块(H+L)的群体112展示在只包含靶H的单阳性分块的群体114tt之上的信号振幅中的小的可检测到的增加。然而，在由群体112中的L靶tt的拷贝产生的信号振幅中的增加不足以完全分辨来自彼此的两个更高振tt幅群体。换句话说，每种类型的分块H+L和仅H不能可靠地区分开彼此；tt在分块中的靶H的存在至少部分地掩蔽靶L的存在。相应地，可通过从用tt于计算的分块的集合排除群体112和114来更准确地确定靶L的浓度，如tt在上面的等式8中的。tt
图4示出可通常如在图3中的收集的数据的另一示意性图表。然而在tt这里，掩蔽靶是靶L，其具有更低振幅信号，且被掩蔽靶是靶H，其具有tt更高振幅信号。作为结果，在分块的同一带或簇中，可检测的H阳性分块tt120不包含靶L的拷贝，而L阳性分块122可不包含拷贝或包含靶H的一tt个或多个拷贝。tt
可以通过从在计算中使用的分块计数中排除L阳性分块用类似于上面tttttt的等式8的方式计算在图4中的被掩蔽靶H的浓度：tt
λH＝ln(NE+NH)-ln(NE)(13)tt
可以用类似于上面的等式7的方式计算在图4中的靶L的浓度，因为tt靶L未被掩蔽且所有L阳性分块是可检测到的：tt
λL＝ln(NE+NL+NH)-ln(NE+NH)(14)tt
图5示出可在单个检测通道中从分块例如液滴收集的数据的示意性图tt表，分块共同包含根据掩蔽等级结构顺序地掩蔽彼此的k个靶。更具体地，ttk个靶可以从1到k按等级排序，使得在分块中的等级i的靶的存在掩蔽具tt有更低等级(即i-1,i-2,…,1)的每个靶的存在。在这里，来自等级i的靶tt的信号比来自更低等级的每个靶的更强，但信号振幅的任何可分配的顺序tt可以是适当的。例如在一些情况下，更高等级的每个连续靶的信号振幅可tt相对于更低等级的每个靶降低(使得靶k具有最接近空分块的信号振幅)，tt或信号振幅可以不根据等级顺序单调地增加或降低。tt
分块的数据分布在k个靶阳性带(B1,B2,…,Bk)当中加上最低振幅tt(B0)的空/阴性分块的带。对于等级i的每个靶阳性带，只有包含具有等tt级i或更低，即i-1,i-2,…的靶的分块存在于带中(否则，这样的分块将移tt动到更高等级的带)。tt
可使用归纳法来计算所有靶的正确浓度。每个靶的浓度可以使用下面tt的表达式被“脱掉”，其中Ni是在带Bi中的分块的数量：tt
λ1＝ln(N0+N1)-ln(N0)(15)tt
λ2＝ln(N0+N1+N2)-ln(N0+N1)(16)tt
且对于第i种情况：tt
λi＝ln(N0+N1+…+Ni)-ln(N0+N1+…+Ni-1)(17)tt
这种方法可如在上面的等式9到12中的被证实：tt
λ1+λ2+…+λk＝ln(N0+N1+…Nk)-ln(N0)(18)tt
λtot＝ln(Ntot)-ln(N0)(19)tt
这里介绍的单通道实例可扩展到在两个或两个以上检测通道中收集tttttt的数据(例如通过在通道中的发射光的两个或两个以上不同的波带的检tt测；见第III和IV章)。在一些情况下，如果从通道特异性报告物收集数tt据，数据可“收缩”到两个或两个以上靶的单个通道内，这些靶在那个通tt道中通过忽略由在其它检测通道中的振幅差异产生的可区别的群体而被tt多重化。tt
III.使用靶掩蔽的示例性分析配置
本章描述示例性的其中靶掩蔽可出现的多重分析配置和/或在数据中tt的不同靶内容的分块群体；见图6-17。可使用数据排除如在第II章中所述tt的来处理来自任何多重分析的数据用于计算靶的至少一个水平。tt
靶掩蔽可通过任何适当的机制出现。在一些情况下，掩蔽可从在同一tt分块中的两个(或多个)不同的靶的扩增的不同效率产生，更有效地扩增tt的靶(优势靶)掩蔽更不有效地扩增的靶(可掩蔽靶)。在同一分块中的tt优势和可掩蔽靶的分析之间的竞争可减弱或消除在优势靶缺乏的情况下、tt通常为在分块中的可掩蔽靶的分析而检测的信号变化。换句话说，竞争可tt防止可掩蔽靶分析到达它的一般端点。通过在竞争中胜过可掩蔽靶，优势tt靶可耗尽或垄断这两个靶的分析所需的限制试剂。限制试剂可以是用于这tt两个靶的扩增的引物、结合到这两个靶的扩增子的报告物、一个或多个ttdNTP(和/或NTP)、在分析期间失去相当大的活动的扩增酶等。可选地或tt此外，通过在竞争中胜过可掩蔽靶，优势靶可在足够的浓度下产生抑制产tt物例如核酸(例如扩增子)以抑制扩增，以防止可掩蔽靶分析到达它的一tt般端点。在一些情况下，掩蔽可出现而没有在靶之间的相当大的竞争。tt
图6示出来自能够产生图3的数据的示例性多重数字分析的分块140。tt多重分析配置成执行对两个靶，即优势靶H和被掩蔽靶L的单独分析。分tt块140包含每个靶的拷贝，每个拷贝由可以是单链的或双链的相应的模板tt142、144提供。(在分析中的其它分块将包含仅仅靶H、仅仅靶L或不包tt含这两个靶。)模板具有与彼此相同的序列，如由具有相同的线粗的区指tt示的，这允许这两个模板特别由同一对正向和反向引物(F和R)和由同tt一探针(P)结合。相应地，来自两个靶分析的信号可在同一检测通道中tt被检测。在这里，探针包括用发光基团148(或荧光团)标记的核酸146tttttt(或寡核苷酸)以产生发光信号。探针也可包括熄灭来自发光基团的光致tt发光的淬熄剂，直到淬熄剂和发光基团更远地间隔开(例如通过探针的降tt解和/或探针到扩增子的杂化等)。tt
由于位于引物结合部位之间且不存在于模板142中的额外序列150的tt存在，模板144比模板142更长。(序列150由更粗的线段表示。)作为结tt果，靶H相对于靶L的扩增产生更短的扩增子，这使靶H的扩增比靶Ltt的扩增更有效地继续进行。在分块中掩蔽靶L的存在。来自分析的数据可tt如在第II章中所述的被处理。tt
图7示出来自能够产生图4的数据的示例性多重数字分析的分块160。tt多重分析配置成执行对两个靶，即优势或掩蔽靶L和被掩蔽靶H的单独分tt析。分块160类似于图6的分块140，除了探针(P)用当结合到双链核酸tt(例如扩增子)时更强地光致发光的通用报告物162例如嵌入染料代替以tt外。(报告物162可互换地可被称为染料。)可在单个光学通道或两个或两tt个以上光学通道中检测来自染料162的光发射。tt
染料162的拷贝/分子可以用长度相关方式结合到扩增子，使得报告物tt的更多拷贝相对于从模板142产生的更短扩增子的拷贝结合到从模板144tt产生的更长扩增子的拷贝。作为结果，来自模板144的靶的扩增在模板142tt缺乏的情况下产生比来自模板142的扩增更高强度的荧光信号(即模板144tt现在相应于靶H且模板142相应于靶L(与图6比较))。然而，更短的靶tt掩蔽更长的靶，如对图6描述的，所以靶H是在这个分析配置中的被掩蔽tt靶。(也见第V章的实例2。)tt
图8示出来自能够产生图3的数据的另一示例性多重数字分析的分块tt180。分块包含优势靶H的模板182的拷贝和可掩蔽靶L的模板184的拷tt贝。模板182和184具有相同的序列，除了在反向引物(R)的相应引物tt结合部位中的序列变化186例如单核苷酸差异以外。更具体地，反向引物tt与模板182形成完美双螺旋和与模板184形成失配双螺旋。作为结果，靶ttH比靶L更有效地被扩增，这在这两个靶存在于同一分块中时掩蔽了靶Ltt的存在。由失配反向引物引起的扩增低效在缺乏靶H的情况下也引起靶Ltt的更低检测到的信号。tt
图9示出来自能够产生图3的数据的又一示例性多重数字分析的分块tt200。分块包含优势靶H的模板202的拷贝和可掩蔽靶L的模板204的拷tt贝。模板202和204具有相同的序列，除了在探针(P)的相应探针结合tt部位中的序列变化206例如单核苷酸多态以外。更具体地，探针与靶H的tt扩增子形成完美双螺旋和与靶L的扩增子形成失配双螺旋。作为结果，靶ttH和L以相同的效率被扩增，但探针相对于靶L的扩增子更有效地结合到tt靶H的扩增子，这在这两者都存在于同一分块中时掩蔽了靶L的存在。由tt失配探针引起的扩增低效在缺乏靶H的情况下也引起靶L的更低信号。tt
图10示出来自能够产生图3的数据的示例性多重数字分析的分块tt220。分块220包含靶H的模板222的拷贝和靶L的模板224的拷贝。靶ttH和L由如更厚的模板222和更薄的模板224代表的不同序列组成。相应tt地，靶H和L由不同对的引物(FH和RH或FL和RL)扩增，扩增由不同tt的探针(PH和PL)报告。靶H比靶L短，并实质上更有效地被扩增，这tt给予靶H更高端点信号并可使靶H对靶L是优势的。tt
图11示出来自使用单个检测通道执行的示例性多重数字分析的分块tt230。根据反应条件(例如反应引物浓度和/或引物杂化的退火温度等)，分tt块包含可以是可掩蔽的靶A的拷贝和可至少部分地掩蔽靶A的存在的靶Btt的拷贝，反之亦然。靶由如靶的更厚模板232和更薄模板234所代表的不tt同的序列组成。靶被以不同的相应对的正向和反向引物(FA和RA或FB和ttRB)扩增。扩增由同一通用报告物162(例如嵌入染料)对这两个靶报告。tt
图11A示出可为图11的多重数字分析在单个检测通道中从五组分块tt(线道1-5)收集的荧光强度数据的示意性图表。每组包含相同浓度的靶Att和B、正向引物A和反向引物A和B以及靶B的可变浓度的正向引物B。tt
线道1代表从只结合到靶A的扩增子的通用报告物162检测的信号；tt由于正向引物B的缺乏，靶B展示在线道1中没有扩增。只包含靶A的tt分块群体(在这里，带(A))具有增加的信号振幅且与阴性分块充分分离，tt由()指示。tt
线道2和3代表使用较低浓度的正向引物B检测的信号。三个靶阳性tt带(A、B和AB)形成单个簇，组成群体不彼此分辨开。由于与靶B的竞tttttt争，靶A的带的位置可以(或可以不)改变(例如在振幅上降低)。然而，tt靶A的带在这里被显示在所有线道中有相同的位置，以简化演示。tt
线道4和5示出与靶A的带分辨开的B阳性带。在线道4中，两个Btt阳性群体重叠。来自线道4的数据可用来确定如上面对图3描述的两个靶tt的浓度。特别是，线道4的所有数据可用于计算靶B的浓度，且只有最低tt的两个带用于计算靶A的浓度。在线道5中，所有四个群体被分辨，这允tt许靶5的所有数据用于计算每个靶的浓度。在其它情况下，至少一对引物tt(例如靶B的FB和RB)的浓度、退火温度和/或类似物可被调节以提供来tt自至少一个其它靶阳性群体的仅仅A群体的足够分辨率。tt
图12示出来自使用两个检测通道执行的示例性多重数字分析的分块tt240。分块包含被掩蔽靶A的拷贝和掩蔽靶B的拷贝。靶由如靶的更厚模tt板232和更薄模板234所代表的不同的序列组成。靶用不同对的正向和反tt向引物(FA和RA或FB和RB)扩增。扩增由使用不同的荧光团148、242tt标记的不同探针(PA和PB)报告。来自每个荧光团的荧光在不同的检测通tt道中可检测为发射光的不同波带。tt
图12A示出从图12的多重分析收集的扩增数据的示意性散布图。关tt于每个通道轴绘制在每个分块的每个通道中检测的荧光强度值。分别在通tt道1和2中实质上排他地检测荧光团148和242。分块的荧光强度数据创tt建三个不同的簇，其被顺序地编号(为0、1和2)并邻近每个簇根据靶内tt容进行标识。簇“0”代表空分块，即对这两个靶为阴性的分块，指示为tt()。簇“1”代表只对靶A为阳性的分块，指示为(A)。是A阳性的分tt块的信号强度相对接近于对这两个靶为阴性的那些靶，但准确的分块计数tt可从簇1得到。簇“2”代表对靶B为阳性的分块，即只包含靶B的分块tt的群体250，指示为(B)，以及包含靶A和B的分块的另一群体252，指tt示为(AB)。然而，群体250、252没有被很好地分辨且因此不能提供单独tt地对(AB)和(B)的准确分块计数。相应地，可以只使用计数N0和N1分别从簇0和1，即从排除所有B阳性分块(即排除来自簇2(N2)的所tt有计数)的数据的仅仅一部分计算靶A的浓度:tt
λA＝ln(N0+N1)-ln(N0)(20)tttttt另一方面可使用所有分块计数来计算靶B的浓度：tt
λB＝ln(N0+N1+N2)-ln(N0+N1)(21)tt
在其它情况下，具有特定靶内容的分块的每个群体可与具有不同的靶tt内容的其它群体分辨开。例如，图12A的AB和B群体可形成一对分辨的tt簇，其允许使用来自四个分块群体/簇中的每个的数据来计算每个靶A和Btt的浓度。更具体地，分块的总计数可基于来自所有群体/簇的分块。tt
IV.使用特异性报告物和通用报告物的多重分析
本章描述使用至少一个特异性报告物和通用报告物执行的两个或两tt个以上靶的示例性多重分析；见图13-18。在两个光学通道中检测在这里tt所示的分析。然而，检测可以在仅仅一个光学通道或三个或三个以上光学tt通道中。这里公开的任何多重分析——不管是否只使用一个或多个特异性tt报告物、只使用一个或多个通用报告物或特异性和通用报告物的组合被执tt行——都可受益于数据排除，如果具有不同的靶内容的分块群体不在数据tt中彼此分辨开。tt
嵌入染料例如绿染料和染料通常在PCR中用于检tt测扩增子的产生。基于作为报告物的嵌入染料的分析是普遍的，因为它们tt比基于探针的分析(例如使用探针、分子信标探针、引物等)更不昂贵。然而，由于至少两个原因，不普遍使用利用嵌入染料tt的分析。首先，这些分析完全依赖于引物的特异性来确保只有感兴趣的靶tt的扩增。对于某些基因座，只使用一对引物并不提供足够的特异性，且另tt外的特异性通过带标签的探针来实现。探针增加了靶检测的特异性，因为tt非特异性地由引物扩增的不想要的产物将不有助于检测到的信号，如果探tt针不结合到这些产物。其次，可能难以在使用嵌入染料作为两个靶的报告tt物时量化在同一井中的样本的这两个靶。然而，将感兴趣的靶的数据标准tt化到样本中的至少一个参考靶(例如持家基因)通常是合乎需要的。在没tt有在同一井中多重化的能力的情况下，样本必须分成用于单独的分析的多tt个井以量化感兴趣的靶和参考靶。这种方法可引入误差，例如在井之间的tt移液可变性。本公开使用嵌入染料作为报告物使多重分析变得可能。tt
可如下所述在数字分析中结合一个特异性报告物(例如至少一个带标tt签的探针)来使用通用报告物，用于准确的单井量化。这种方法是有吸引tt力的，因为它允许研究者实现相当大的成本节约，同时也减小实验误差，tt因为两个或两个以上靶可在单个井中被同时量化。tt
在本章中公开的多重分析允许执行基因表达分析的研究员为他们的tt参考基因购买基于探针的分析物，并为他们的感兴趣基因(GOI)使用利tt用通用报告物的基于引物的分析。如果研究员正研究很多基因，则可能有tt相当大的成本节约，因为只有一个或几个探针需要被购买且其它分析使用tt通用报告物被检测。可实现感兴趣的靶和参考模板的单井量化，从而消除tt当前阻碍嵌入染料用于基因表达或其它研究的移液可变性。通常，在同一tt多重分析中测量多于一个靶允许所装载的DNA的数量的自动标准化，如tt在拷贝数变化或其它应用中使用的。tt
图13示出来自使用两个检测通道执行的另一示例性多重数字分析的tt分块260。多重分析如图11中所示的被配置，除了靶A的特异性报告物用tt通用报告物162代替以外，通用报告物162能够结合到靶A和靶B的扩增tt子。分析具有特异性报告物——靶B的探针B(PB)。靶A至少部分地被tt靶B的存在掩蔽。然而，可如下面所示的确定这两个靶的浓度。tt
图14示出可从图13的多重数字分析收集的扩增数据的示意性散布tt图。对每个分块在每个通道中检测的荧光强度值相对于每个通道轴被绘tt制。报告模板A和B的扩增的染料162和只报告靶B的扩增的荧光团242tt实质上排他地分别在通道1和2中被检测。换句话说，在基于探针的化验tt物和嵌入染料之间有足够的频谱分离以区分单独的簇。分块的荧光强度数tt据创建三个不同的簇，其被顺序地编号(为0、1和2)并邻近每个簇根据tt靶内容进行标识，如在图12A中的。簇“2”代表对靶B为阳性的分块，tt即只包含靶B的分块的群体270和包含靶A和B的分块的另一群体272。tt然而，群体270、272没有被很好地分辨，且因而不能提供单独地对(AB)tt和(B)的准确分块计数。相应地，可分别使用等式20和21来计算靶Att和B的浓度。在示例性实施方式中，靶A是RPP30，而靶B是MRG。tt
在其它情况下，具有特定的靶内容的分块的每个群体可与具有不同靶tttttt内容的其它分块分辨开。例如，图14(或下面的图14A)的AB和B群体tt可形成一对分辨开的簇，这将允许使用来自四个分块群体/簇中的每个的数tt据来计算每个靶A和B的浓度。更具体地，用于计算每个浓度的分块的tt相同总计数可基于来自所有群体/簇的分块。tt
图14A示出来自使用单个检测通道执行的示例性多重数字分析的分tt块274的示意图。如图13所示的配置多重分析，除了靶B的探针B(PB)tt用荧光团148标记以外，这允许来自通用报告物162的荧光和探针B的荧tt光团148在同一通道中被检测。分块274包含靶A和靶B的拷贝，每个可tt用不同对的正向和反向引物(FA和RA或FB和RB)扩增。tt
图14B示出为图14A的多重数字分析在单个检测通道中从五组分块tt(线道1-5)收集的荧光强度数据的示意性图表。分块组1-5包含相同浓度tt的靶A和B和两对引物，但具有靶B特有的可变浓度的探针(PB)。tt
线道1代表只从通用报告物162检测的信号(探针B不存在)。包含tt仅仅靶A(A)、仅仅靶B(B)或靶A和B(AB)的分块群体具有增加tt的信号振幅，且从阴性分块()充分分离。然而，这三个靶-阳性群体彼此tt不分辨开。tt
线道2-5代表从使用增加的浓度的探针B执行的分析检测的信号。靶ttA的带的位置可以不改变，但每个B阳性带在具有探针B的增加的浓度的tt曲线中向上迁移，以产生B阴性和B阳性群体的清楚分离。相应地，线道tt4或线道5的数据可用来准确地确定靶A和B的浓度。可使用等式20只tt从数据的子集、即从阴性带()的分块计数和仅A带(A)确定靶A的浓tt度。可使用等式21从在任一线道中的所有带的分块计数确定靶B的浓度。tt
图15是来自使用两个检测通道和三个未链接的靶(A-C)执行的示例tt性多重数字分析的分块280的示意图。图15的多重分析配置与图13的分tt析配置有关，除了对另一不相关的靶(C)的分析被执行以外(靶的模板tt282的拷贝存在于分块280中)。靶C用靶C特定引物(FC和RC)扩增，tt且扩增由用荧光团148标记的靶C特异性探针(PC)报告。簇的确切数量tt和布置将取决于各种参数，例如限制每个扩增反应的条件、用于检测的通tt道、每个报告物的有效浓度、每个报告物的频谱特征等。参数的任何适当tttttt组合可被调节以实现允许准确的浓度确定的簇布置。tt
图16是从图15的多重数字分析收集的扩增数据的示意性散布图。在tt每个分块的每个通道中检测的荧光强度(FL.INT.)值关于每个通道轴被tt绘制。染料162和荧光团148(靶C)实质上排他地在通道1中被检测到，tt且荧光团242(靶B)实质上排他地在通道2中被检测到。分块的荧光强tt度数据创建六个不同的簇，其顺序地被编号(为0、1、2、3、4和5)并tt邻近每个簇根据靶内容在括号中进行标识。簇2代表对靶C为阳性的分块，tt即只包含靶C的分块的群体290和包含靶A和C的分块的另一群体292。tt簇5代表对靶B和C为阳性的分块，即只包含靶B和C的分块的群体294tt和包含所有三个靶的分块的另一群体296。然而，群体290、292和群体tt294、296并不被很好地分辨，且因此不能提供每个单独群体的准确的分块tt计数。然而，可使用簇计数的适当组合和排除来计算靶A、B和C的浓度。tt
靶A的浓度可被计算如下：tt
λA＝ln(N0+N1)-ln(N0)(22)tt
可选地，可通过包括簇3和4并排除所有C阳性簇来计算靶A的浓度：tt
λA＝ln(N0+N1+N3+N4)-ln(N0+N3)(23)tt
可使用来自所有分块的计数如下计算靶B的浓度：tt
λB＝ln(Ntot)-ln(N0+N1+N2)(24)tt
可选地，可通过排除来自所有C阳性簇的计数(即通过排除N2和N5)来tt计算靶B的浓度：tt
λB＝ln(N0+N1+N3+N4)-ln(N0+N1)(25)tt
簇2和5可从计算排除，因为每个被预期与共同被考虑的所有分块具tt有A阳性分块的相同分数。然而，通常，使用更多的数据用于计算是合乎tt需要的，如果准确度不受损害。tt
可通过排除来自所有B阳性簇的计数(即通过排除N3、N4和N5)来tt计算靶C的浓度：tt
λC＝ln(N0+N1+N2)-ln(N0+N1)(26)tt
可选地，可使用来自所有分块的计数如下计算靶C的浓度：tt
λC＝ln(Ntot)-ln(N0+N1+N3+N4)(27)tt
图17示出从图15的多重数字分析收集并如在图16中的绘制的扩增tt数据的另一示意性散布图，除了簇3(B)和簇4(AB)合并以形成新簇3tt以外，且簇5被重命名为簇4。tt
在这里，再次，可计算所有靶的浓度。可使用等式22计算靶A的浓tt度。可使用来自所有分块的计数使用等式24来计算靶B的浓度。可选地，tt可通过排除来自所有C阳性簇的计数(即通过排除N2和N4)来计算靶Btt的浓度：tt
λB＝ln(N0+N1+N3)-ln(N0+N1)(28)tt
可使用等式26通过排除所有B阳性簇(即通过排除N3和N4)来计算tt靶C的浓度。可选地，可使用来自所有分块的计数如下计算靶C的浓度：tt
λC＝ln(Ntot)-ln(N0+N1+N3)(29)tt
图18示出从图15的多重数字分析收集的扩增数据的又一示意性散布tt图。关于每个通道轴绘制在每个分块的每个通道中检测的荧光强度(FL.ttINT.)值。通用报告物162在通道1和2中被检测到，荧光团148(靶C)tt实质上排他地在通道1中被检测到，而荧光团242(靶B)实质上排他地tt在通道2中被检测到。分块的荧光强度数据创建五个不同的簇，其顺序地tt被编号(为0、1、2、3和4)并邻近每个簇根据靶内容在括号中进行标tt识。图18的簇相应于图17的簇；用于计算靶A-C的浓度的图17的策略tt可应用于图18的簇计数。tt
V.实例
本章描述与多重数字分析有关的本公开的选定方面和实施方式。分析tt可涉及靶掩蔽的任何组合、用于至少一个靶水平的计算的数据排除、在同tt一多重分析中的至少两个靶的相同通用报告物的使用和/或同一多重分析tt的特异性报告物和通用报告物的使用等。这些实例仅为了说明而设计且不tt应限制或限定本公开的整个范围。tt
实例1.库质量的分析tt
这个实例描述在液滴中的多重数字分析的使用以测量库的空和填充tt成员的水平，其中在液滴中的空库成员的存在掩蔽在同一液滴中的填充成tt员的存在；见图19和20。tt
图19示出来自确定库例如Ion库的质量的示例性多重数字分tt析的分块300的示意图。库可以是通过将适应物(“A”)的拷贝附着到感tt兴趣的片段的群体的每端来在活体内构造的下一代基因测序(NGS)库。tt库的成员可包括由一对适应物拷贝在反转方向上结扎到彼此而产生的空tt成员302，而没有介入的插入物。空成员302不提供有用的序列信息，且tt因此是库的不希望有的组成部分。库构造的靶是产生填充成员例如成员tt304的高复杂性群体，每个包含感兴趣的片段之一作为以适应物的附着的tt拷贝作为侧面的插入物。tt
NGS库的质量特征可在于多重数字分析。库的成员可在分块例如液滴tt的不全占位下分布。液滴可包含使库的成员扩增的一个或多个引物(F)tt和报告扩增的适应物特异性探针(P)。在这里，相同的引物(F)可以起tt正向引物和反向引物的作用，用于通过特别结合到适应物的两个拷贝来扩tt增。tt
图20示出从在液滴中执行的图19的多重分析收集的扩增数据的图tt表。用FAM染料标记探针。从FAM染料测量的荧光强度被绘制为事件(或tt液滴)数的函数。非常短的空库成员(A-A)非常有效地扩增并产生比填tt充库成员强的信号，其掩蔽来自填充库成员的信号，如果存在于同一液滴tt中。相应地，空和填充库成员的浓度可以如对图3所述的被计算。特别是，tt可使用来自所有液滴的计数计算占优势/掩蔽的空库成员的浓度，且可通过tt排除空库成员的计数来计算被掩蔽的填充库成员的浓度。下面为四个库示tt出使用这种方法所获得的示例性浓度：tt
在通过引用被并入的2012年7月30提交的美国专利申请序列号tt13/562,198中描述了通过数字分析的库构造和特征化的另外的方面。tt
实例2.拼接和未拼接RNA水平的测量tt
这个实例描述在液滴中的多重数字分析的使用以测量在样本中的未tt拼接和拼接转录本的水平；见图21-24。tt
图21示出来自量化样本中的拼接和未拼接物种的示例性多重数字分tt析的分块320的示意图。分块320包含未拼接物种(外显子-内含子-外显tt子)和拼接物种(外显子-外显子)的拷贝。每个物种用同一对正向和反向tt引物(F和R)扩增。扩增经由来自染料162的光发射被报告，染料162tt非特异地结合到由来自两个模板的靶的扩增产生的扩增子。tt
图22示出从在具有引物到GAPDH的外显子7和8以及作为染料162tt的Green的液滴中执行的图21的多重分析收集的扩增数据的图tt表。预期扩增子尺寸对于内含子被移除的拼接物种是64bp。具有更高强tt度信号的额外液滴对可从不成熟的mRNA分子产生的257bp的扩增子尺tt寸是可见的，其中内含子还没有被切除。64bp物种在竞争中胜过257bptt物种并掩蔽它的信号。注意信号的反转，因为染料是嵌入的并产生与扩增tt子长度成比例的信号(也见图4和7)。为257bp物种计算的浓度使用内tt含子引物在分析中被确认以扩增内含子，而没有来自更短的拼接物种的竞tt争。tt
图23示出来自量化样本中的拼接和未拼接物种的另一示例性多重数tt字分析的分块340。分块包含未拼接物种342(外显子-内含子-内含子-外tt显子)和两个不同的拼接物种344、346(外显子-X-外显子和外显子-外显tt子)的拷贝。每个物种可用同一对正向和反向引物(F和R)扩增。每个tt物种的扩增由同一染料162报告。tt
图24示出从在具有引物到肌动蛋白的外显子3和4的液滴中执行的tttttt图23的多重分析收集的扩增数据的图表。在这里，不同长度(76bp、117ttbp和517bp)的三个扩增子是可见的。最短的扩增子在竞争中胜过较长的tt扩增子，且中间扩增子在竞争中胜过最长的扩增子。这三个靶的浓度可以tt如在第II章中所述的被计算。tt
在通过引用并入本文的2012年8月23日提交的美国临时专利申请序tt列号61/692,635中描述了对插入和删除的多重分析的另外方面。tt
实例3.使用报告物较少的靶的多重数字分析tt
本实例描述了在分块中执行以测量一对靶的水平并使用结合到靶中tt的仅仅一个的单个报告物的多重数字分析；见图25和26。tt
图25示出来自第一靶(靶A)和第二靶(靶B)的示例性多重数字分tt析的示例性分块360。分块360可以是具有随机地分布在分块当中的靶Att和靶B的拷贝的一组分块的成员。只有分块的子集每个包含靶A的至少一tt个拷贝。只有分块的不同子集每个包含靶B的至少一个拷贝。分块的又一tt不同的子集每个包含靶A的至少一个拷贝和靶B的至少一个拷贝，图25tt所示的分块360作为例子。tt
每个分块可包括或是混合物的隔离部分。混合物可包含靶A和B(例tt如分别由模板362和364提供)，并且也可包含足以在适当的环境条件或tt操纵(例如加热、循环加热和冷却等)下扩增每个靶的试剂。tt
任何适当的试剂可包括在混合物中且因此在每个分块360中。试剂可tt包括用于靶A的扩增的正向和反向引物(FA和RA)和用于靶B的扩增的tt正向和反向引物(FB和RB)。试剂也可包括特异性报告物(例如探针PA，tt包括标签、荧光粉366)。报告物特异地结合到靶A(和/或到由靶A的扩tt增形成的扩增子的区)。然而，混合物并不包含结合到靶B或对靶B的扩tt增敏感的报告物，除了间接地以外。更具体地，靶B的存在经由探针PA可检测，作为探针信号中的变化，只有当靶A和B都在同一分块中例如在tt包含每个靶的拷贝的分块360中被扩增时。在不存在分块中的靶A的情况tt下，靶B保持对分块是不可见的和检测不到的。tt
图26示出可从图25的多重数字分析中的分块收集的扩增数据(荧光tttttt强度)的示意性散布图。该图示出在两个通道中收集的数据，但探针A的tt荧光粉366只在通道1中可检测到。在其它情况下，数据可被绘制为相对tt于时间或事件数的强度。在任何情况下，分块的三个簇是可区分的并被顺tt序地编号(0、1和2)并邻近每个簇根据靶内容进行标识。tt
簇0具有在通道1中的最低强度，因为簇0的每个分块对靶A是阴性tt的。因为靶A不存在，未探测到的靶B的扩增变得未检测到。因此，关于tt被共同考虑的在所有簇中的分块，靶B在大约相同的平均浓度(每液滴拷tt贝)下分布在簇0的分块当中。簇0的任何给定分块对靶B可以是阳性的tt或阴性的。tt
簇2具有在通道1中的最高强度且只包含靶A。靶A的扩增出现的簇tt2的分块中而没有来自靶B的竞争，这导致靶A的更有效的扩增和因而来tt自探针的更强信号。tt
簇1具有在通道1中的中间强度。簇1的每个分块使靶A和靶B扩增。ttA和B扩增反应为了有限的试剂而彼此竞争，这导致靶A相对于簇2的分tt块的较不有效的扩增。作为结果，探针对簇1比对簇2产生更小强度的信tt号。tt
N0、N1和N2分别是簇0、1和2中的分块的数量(分块计数)。靶Att的浓度(每液滴拷贝)然后可如下被计算：tt
λA＝ln(N0+N1+N2)-ln(N0)(30)tt
在等式30中，通过将所有三个簇的分块数量求和来提供分块的总数，tt且只通过对在簇0中的分块的数量求和来提供对靶A为阴性的分块的数量tt(也见上面的等式5)。tt
靶B的浓度(每液滴拷贝)可如下被计算：tt
λB＝ln(N1+N2)-ln(N2)(31)tt在等式31中，通过将簇1和2的分块数量求和来确定分块的总数，且通tt过对在簇2中的分块的数量求和来确定对靶B为阴性的分块的数量(也见tt上面的等式5)。可从靶B浓度的计算中排除簇0，因为总体上看，在簇0tt中的靶B的浓度被预期与在簇1和2中的相同(没有统计误差)。tt
实例4.选定实施方式Itt
本实例描述被呈现为一系列编号的段落的多重数字分析的选定实施tt方式。tt
1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占tt位下包含第一靶和第二靶的分块，多个分块每个包含这两个靶的拷贝；(B)tt执行相应于分块中的每个靶的反应；(C)对于每个反应从至少一个报告物tt收集数据；以及(D)从选择性地排除对第二靶为阳性的分块的、所述数tt据的仅仅子集确定第一靶的浓度。tt
2.段落1的方法，其中分块是液滴，其中收集数据的步骤由检测组tt件执行，其中确定的步骤使用数据处理器来执行，或其任何组合。tt
3.段落2的方法，其中提供分块的步骤包括形成包含第一靶和第二tt靶的液滴的步骤。tt
4.段落1到3中的任一项的方法，其中提供分块的步骤包括形成包tt括包含第一靶和第二靶的样本的分块的步骤。tt
5.段落1到4中的任一项的方法，其中第一靶和第二靶每个包括核tt苷酸的序列。tt
6.段落1到5中的任一项的方法，其中当分块被提供时，多个分块tt每个包含第一靶的单个拷贝，且多个分块每个包含第二靶的单个拷贝。tt
7.段落1到6中的任一项的方法，其中相应于每个靶的反应扩增核tt酸。tt
8.段落1到7中的任一项的方法，其中相应于每个靶的反应由至少tt一种酶催化。tt
9.段落8的方法，其中至少一种酶包括多聚酶、连接酶或这两者。tt
10.段落8的方法，其中至少一种酶包括连接到特异地结合到靶之一tt的寡核苷酸的酶。tt
11.段落1到10中的任一项的方法，其中每个反应的至少一个报告tt物包括结合到核酸的报告物。tt
12.段落11的方法，其中至少一个反应的报告物是包括寡核苷酸的tt标记探针。tt
13.段落12的方法，其中执行反应的步骤产生相应于第一靶的第一tt扩增子和相应于第二靶的第二扩增子，其中相应于第一靶的反应的报告物tt结合到第一扩增子和第二扩增子。tt
14.段落13的方法，其中相应于第二靶的反应的报告物是相对于第tt一扩增子特异地结合到第二扩增子的特异性报告物，或其中数据从仅仅一tt个报告物收集。tt
15.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)扩增在不全占tt位下包含每个靶的分块中的第一靶和第二靶；(B)收集第一靶和第二靶的tt扩增的数据，对包含每个靶的拷贝的多个分块，在所述数据中，第二靶至tt少部分地掩蔽第一靶的存在；以及(C)从选择性地排除对第二靶为阳性tt的分块的数据的仅仅子集确定第一靶的浓度。tt
16.段落15的方法，其中分块是液滴。tt
17.段落15或16的方法，其中每个靶以每分块小于五个拷贝的平均tt数存在于分块中。tt
18.段落15到17中的任一项的方法，其中多个分块中的每个不包含tt任一靶的拷贝。tt
19.段落15到18中的任一项的方法，其中浓度是第一靶的每分块拷tt贝的平均数量。tt
20.段落15到19中的任一项的方法，其中确定的步骤基于由数据的tt子集表示的分块的总数的值。tt
21.段落15到20中的任一项的方法，其中确定的步骤基于表示对第tt一靶为阴性的数据的子集中的分块的总数的值或基于表示对第一靶为阳tt性的数据的子集中的分块的总数的值。tt
22.段落15到21中的任一项的方法，其中确定的步骤基于泊松统计。tt
23.段落15到22中的任一项的方法，还包括基于数据的至少子集来tttttt确定第二靶的浓度的步骤。tt
24.段落23的方法，其中扩增和收集的步骤对第三靶执行，以及其tt中第二靶的浓度从排除对第三靶为阳性的分块的数据的仅仅子集确定。tt
25.段落15到24中的任一项的方法，其中，在包含每个靶的拷贝的tt分块中，第二靶的扩增抑制第一靶的扩增。tt
26.段落15到25中的任一项的方法，其中至少一个相同的引物用于tt第一靶和第二靶的扩增。tt
27.段落26的方法，其中同一对正向和反向引物用于第一靶和第二tt靶的扩增。tt
28.段落26或27的方法，其中第一靶和第二靶的扩增产生相应的第tt一和第二扩增子，以及其中第一扩增子实质上比第二扩增子长，反之亦然。tt
29.段落28的方法，其中第二扩增子比第一扩增子长至少25％、50％tt或100％，反之亦然。tt
30.段落15到29中的任一项的方法，还包括从数据识别对第二靶为tt阳性的分块的至少一个簇的步骤，其中确定的步骤在至少一个簇被排除的tt情况下被执行。tt
31.段落30的方法，还包括产生数据的至少一个图表的步骤，其中tt识别的步骤基于至少一个图表来执行。tt
32.段落15到31中的任一项的方法，还包括基于比较每个分块的一tt个或多个信号值与一个或多个阈值或范围来识别数据的子集的步骤。tt
33.段落32的方法，其中一个或多个信号值表示发射光的检测到的tt强度。tt
34.段落15到33中的任一项的方法，其中第一靶和第二靶的扩增产tt生相应的第一和第二扩增子，以及其中每个分块包含结合到第一扩增子和tt第二扩增子的相同报告物。tt
35.段落34的方法，其中相同报告物是结合到双链核酸的染料。tt
36.段落34或35的方法，其中相同报告物结合到第一和第二扩增子tttttt而没有实质的序列特异性。tt
37.段落34的方法，其中相同报告物是特异地结合到第一和第二扩tt增子的探针。tt
38.段落15到37中的任一项的方法，其中扩增的步骤也扩增第三靶，tt其中所收集的数据也用于在分块中的第三靶的扩增，其中对包含第二和第tt三靶中的每个的拷贝的分块，第三靶至少部分地掩蔽第二靶的存在，该方tt法还包括从选择性地排除对第三靶为阳性的分块的数据的仅仅子集确定tt第二靶的浓度的步骤。tt
39.段落38的方法，其中，对包含第一和第三靶中的每个的拷贝的tt分块，在数据中，第三靶至少部分地掩蔽第一靶的存在。tt
40.段落38或39的方法，其中确定第一靶的浓度的步骤使用选择性tt地排除对第二靶为阳性的分块和选择性地排除对第三靶为阳性的分块的tt数据的仅仅子集来执行。tt
41.段落15到40中的任一项的方法，其中第一靶的浓度从其确定的tt数据的子集排除对第二靶为阳性的分块的至少大部分。tt
42.段落41的方法，其中数据的子集排除测试为对第二靶为阳性的tt所有分块。tt
43.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占tt位下包含第一靶和第二靶的分块，多个分块每个包含这两个靶的拷贝；(B)tt扩增分块中的靶；(C)收集用于第一靶和第二靶的扩增的数据，数据是可tt标绘的以产生数据点的三个或三个以上簇，每个簇代表分块中的靶的至少tt一个不同的组合；以及(D)从排除一个或多个簇的数据的仅仅子集确定tt第一靶的浓度。tt
44.段落43的方法，其中三个或三个以上簇之一代表对这两个靶为tt阴性的分块。tt
45.段落43或44的方法，其中三个或三个以上簇之一代表对第一靶tt为阳性和对第二靶为阴性的分块。tt
46.段落43到45中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一代tt表对第二靶为阳性的分块而不考虑分块对第一靶为阳性还是为阴性。tt
47.段落43到46中的任一项的方法，还包括标绘数据以形成簇的步tt骤。tt
48.段落47的方法，其中数据被标绘为作为事件数的函数的光致发tt光强度。tt
49.段落47的方法，其中数据被标绘以产生具有第一轴和第二轴的tt二维散布图，以及其中每个轴代表光的不同波段的强度。tt
50.段落43到49中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一包tt括代表靶的不同组合的一对子簇，以及其中子簇彼此重叠。tt
实例5.选定实施方式IItt
本实例描述被呈现为一系列编号的段落的多重数字分析的选定实施tt方式。tt
1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括多个tt靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物，其中多个靶包括第一靶；(B)tt形成分块，每个分块包括混合物的一部分；(C)扩增在分块中的多个靶；tt(D)从多个分块收集关于多个靶中的每个靶的扩增的数据；(E)识别数tt据中的分块群体，每个分块群体具有多个靶的不同靶内容；以及(F)从tt数据的仅仅一部分计算第一靶的水平，其中数据的该部分从多个分块的仅tt仅子集被收集，其中分块的子集排除两个或两个以上分块群体，以及其中tt两个或两个以上被排除的分块群体包括在数据中彼此不分辨开的至少一tt对被排除的分块群体。tt
2.段落1的方法，其中彼此不分辨开的至少一对被排除的分块群体tt包括对第一靶为阳性的第一分块群体和对第一靶为阴性的第二分块群体。tt
3.段落1或2的方法，其中识别分块群体的步骤包括标绘数据以形tt成数据点的三个或三个以上簇的步骤，其中每个簇代表至少一个分块群tt体，其中数据的部分排除一个或多个簇，以及其中一个或多个被排除簇包tt括由代表具有彼此不同的靶内容的分块群体的至少两组重叠的数据点组tttttt成的异质簇。tt
4.段落3的方法，其中每个数据点代表从多个分块的每个分块检测tt的光的一个或多个强度值，以及其中标绘数据的步骤包括关于至少一个强tt度轴标绘数据的步骤。tt
5.段落4的方法，其中标绘数据的步骤包括关于至少两个强度轴标tt绘数据的步骤。tt
6.段落1到5中的任一项的方法，其中收集数据的步骤包括得到多tt个分块中的每个分块的至少一个值的步骤，以及其中识别的步骤基于比较tt至少一个信号值与多个分块中的每个分块的至少一个阈值或范围。tt
7.段落1到6中的任一项的方法，其中多个靶包括第二靶，以及其tt中数据的部分排除测试为对第二靶为阳性的每个分块。tt
8.段落7的方法，其中扩增的步骤使用第一靶和第二靶的同一对引tt物被执行。tt
9.段落7或8的方法，其中多个分块的子集每个包含第一靶的至少tt一个拷贝和第二靶的至少一个拷贝，以及其中，在每个分块包含第一靶和tt第二靶的拷贝的分块中，第二靶的扩增减小第一靶的扩增。tt
10.段落7到9中的任一项的方法，其中多个靶包括第三靶，该方法tt还包括基于排除测试为对第三靶为阳性的分块的数据的仅仅一部分来计tt算第二靶的水平的步骤。tt
11.段落1到10中的任一项的方法，其中该水平是在分块的子集中tt的第一靶的每分块拷贝的平均数，以及其中，总体上看，在没有统计误差tt的情况下，平均数被预期与在两个或两个以上被排除的分块群体中的第一tt靶的每分块拷贝的平均数相同。tt
12.段落1到11中的任一项的方法，其中识别分块群体的步骤包括tt识别测试为对多个靶中的每个为阴性的分块群体的步骤。tt
13.段落12的方法，其中分块的子集不包括测试为对多个靶中的每tt个为阴性的分块群体。tt
14.段落1到13中的任一项的方法，其中识别分块群体的步骤包括tt识别在数据的图表中彼此不分辨开的至少一对分块群体的步骤。tt
15.段落14的方法，其中分块的子集不包括在数据的图表中彼此不tt分辨开的至少一对分块群体。tt
16.段落1到15中的任一项的方法，其中多个分块的仅第一子集每tt个包含第一靶的至少一个拷贝，其中多个分块的仅仅不同的第二子集每个tt包含多个靶的第二靶的至少一个拷贝，以及其中多个分块的第三子集每个tt包含第一靶和第二靶的至少一个拷贝。tt
17.段落1到16中的任一项的方法，还包括从分块的子集得到第一tt分块计数和第二分块计数的步骤，其中计算水平的步骤使用第一分块计数tt和第二分块计数来执行。tt
18.段落17的方法，其中第一分块计数是在分块的子集中的分块的tt总数，以及其中第二分块计数是在分块的子集中对第一靶为阳性的分块的tt数量或在分块的子集中对第一靶为阴性的分块的数量。tt
19.段落1到18中的任一项的方法，其中形成分块的步骤包括形成tt液滴的步骤。tt
20.段落1到19中的任一项的方法，其中多个靶的每个靶包括核苷tt酸序列。tt
21.段落1到20中的任一项的方法，其中混合物包括至少一个报告tt物，以及其中收集数据的步骤包括检测来自至少一个报告物的光的步骤。tt
22.段落21的方法，其中至少一个报告物包括对多个靶的第一靶和tt第二靶的扩增敏感的相同报告物。tt
23.段落22的方法，其中相同报告物是通用报告物。tt
24.段落23的方法，其中通用报告物结合到双链核酸而没有实质的tt序列特异性。tt
25.段落21到24中的任一项的方法，其中至少一个报告物包括特异tt地仅结合到多个靶中的第一靶的标记探针。tt
26.段落1到25中的任一项的方法，其中计算水平的步骤包括计算tt第一靶的浓度的步骤。tt
27.段落26的方法，其中计算第一靶的浓度的步骤包括计算每分块tt第一靶的拷贝的平均数的步骤。tt
28.段落1到27中的任一项的方法，其中计算水平的步骤基于泊松tt统计。tt
29.段落1到28中的任一项的方法，其中扩增第一靶的步骤产生扩tt增子，以及其中分块不包括结合到第一靶、扩增子或第一靶和扩增子的报tt告物。tt
30.段落1到29中的任一项的方法，其中多个靶包括第二靶，以及tt其中分块包括相对于在分块中的第一靶和第二靶的扩增对分块中的第二tt靶的扩增有差别地敏感的报告物。tt
31.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括多个tt靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物，其中多个靶包括第一靶和第二tt靶；(B)形成分块，每个分块包括混合物的一部分；(C)扩增在分块中的tt多个靶；(D)从多个分块收集关于多个靶中的每个靶的扩增的数据，数据tt是可标绘的以形成数据点的三个或三个以上簇，每个数据点代表分块，以tt及每个簇具有多个靶的不同内容；以及(E)从排除数据点的至少一个簇tt的数据的仅仅一部分计算第一靶的水平，其中至少一个被排除簇包括由代tt表至少两个被排除的分块群体的数据点的重叠组组成的异质被排除簇，其tt中至少一个被排除的分块群体对第一靶是阳性的，以及其中至少一个被排tt除的分块群体对第一靶是阴性的。tt
32.段落31的方法，还包括标绘数据以形成数据点的三个或三个以tt上簇的步骤。tt
33.段落31或32的方法，还包括根据簇的靶内容识别每个簇的步骤。tt
34.段落33的方法，其中数据的该部分排除至少一对异质簇。tt
35.段落31到34中的任一项的方法，其中多个靶包括第二靶，以及tt其中数据的该部分排除测试为对第二靶为阳性的分块的数据点。tt
36.段落31到35中的任一项的方法，其中数据的该部分排除测试为tt对多个靶中的每个为阴性的分块的数据点。tt
37.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括第一tt靶、第二靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物；(B)形成分块，每个tt分块包括混合物的一部分；(C)扩增在分块中的第一靶和第二靶；(D)从tt多个分块收集关于第一靶和第二靶的扩增的数据；以及(E)从排除测试tt为对第二靶为阳性的每个分块的数据的仅仅一部分计算第一靶的水平。tt
38.段落37的方法，其中第一靶未链接到混合物中的第二靶，且当tt形成分块的步骤被执行时未链接到第二靶。tt
39.段落37或38的方法，其中数据收集自包括标记探针的至少一个tt报告物。tt
40.段落39的方法，其中标记探针具有完整的形式和一个或多个降tt解的形式，以及其中收集数据的步骤包括从探针的一个或多个降解的形式tt收集数据的至少部分的步骤。tt
41.段落37到40中的任一项的方法，其中，对于每个分块包含每个tt靶的至少一个拷贝的多个分块，在数据中，第二靶的存在至少部分地掩蔽tt第一靶的存在。tt
42.段落37到41中的任一项的方法，其中数据的该部分收集自多个tt分块的仅仅子集，其中计算水平的步骤基于在分块的子集中的分块的总数tt并基于分块的子集中对第一靶为阴性或对第一靶为阳性的分块的数量。tt
43.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)扩增在不全占tt位下包含每个靶的分块中的第一靶和第二靶；(B)收集关于第一靶和第二tt靶的扩增的数据，在每个分块包含每个靶的至少一个拷贝的多个分块的数tt据中，第二靶至少部分地掩蔽第一靶的存在，；以及(C)从选择性地排除tt测试为对第二靶为阳性的分块的数据的仅仅一部分计算第一靶的浓度。tt
44.段落43的方法，其中计算的步骤基于由数据的该部分代表的分tt块的总数的值。tt
45.段落44的方法，其中计算的步骤基于在数据的该部分中的测试tttttt为对第一靶为阴性的分块的数量的值或基于在数据的该部分中的测试为tt对第一靶为阳性的分块的数量的值。tt
46.段落43到45中的任一项的方法，还包括基于数据的至少一部分tt来计算第二靶的水平的步骤。tt
47.段落43到46中的任一项的方法，其中扩增和收集数据的步骤对tt第三靶执行，该方法还包括从排除测试为对第三靶为阳性的分块的数据的tt仅仅一部分计算第二靶的水平的步骤。tt
48.段落43到47中的任一项的方法，其中，在每个分块包含每个靶tt的拷贝的分块中，第二靶的扩增减小第一靶的扩增。tt
49.段落43到48中的任一项的方法，还包括从数据识别对第二靶为tt阳性的分块的至少一个簇的步骤，其中计算的步骤在至少一个簇被排除的tt情况下被执行。tt
50.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供包括多个tt靶和对每个靶的扩增足够的试剂的混合物，其中多个靶包括第一靶和第二tt靶；(B)形成分块，每个分块包括混合物的一部分，只有分块的第一子集tt包含第一靶，且只有分块的不同的第二子集包含第二靶，以及分块的不同tt的第三子集每个包含第一靶和第二靶中的每个的至少一个拷贝；(C)扩增tt在分块中的多个靶；(D)从多个分块收集关于多个靶中的每个靶的扩增的tt数据，数据是可标绘的以产生数据点的三个或三个以上簇，每个簇代表未tt由三个或三个以上簇中的任何其它簇代表的至少一个靶组合；以及(E)tt从排除一个或多个簇的数据的仅仅一部分计算第一靶的水平，其中一个或tt多个被排除簇包括相对于第一靶是异质的被排除簇(即只有簇的子集对第tt一靶是阳性的)。tt
51.段落50的方法，其中至少一个靶组合包括一种组合，其中多个tt靶中的每个缺乏。tt
52.段落50或51的方法，其中至少一个靶组合包括一种组合，其中tt多个靶中的仅仅一个靶存在。tt
53.段落50到52中的任一项的方法，其中至少一个靶组合包括一种tttttt组合，其中第一靶缺乏而第二靶存在。tt
54.段落50到53中的任一项的方法，其中从计算水平的步骤排除了tt包含第二靶的每个簇。tt
55.段落50到54中的任一项的方法，其中水平是浓度，其中浓度是tt每分块拷贝的平均数，以及其中总体上看，在没有统计误差的情况下，平tt均数被预期与在一个或多个被排除簇中的第一靶的每分块拷贝的平均数tt相同。tt
56.段落50到55中的任一项的方法，其中计算水平的步骤使用由数tt据的该部分表示的分块的总数的值，以及其中一个或多个簇的分块不包括tt在分块的总数中。tt
57.段落50到56中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一包tt括对第一靶和第二靶为阴性的分块的数据点。tt
58.段落50到57中的任一项的方法，其中三个或三个以上簇之一包tt括对第一靶为阳性和对第二靶为阴性的分块的数据点。tt
59.段落50到58中的任一项的方法，其中相对于第一靶是异质的被tt排除簇包括对第一靶为阳性的分块的数据点和对第一靶为阴性的分块的tt数据点。tt
60.段落50到59中的任一项的方法，还包括标绘数据以形成簇的步tt骤。tt
61.段落60的方法，其中数据被标绘为作为事件数的函数的光致发tt光强度。tt
62.段落60的方法，其中数据被标绘以产生具有第一轴和第二轴的tt二维散布图，以及其中每个轴代表光的不同波长或波段的检测到的强度。tt
实例6.选定实施方式IIItt
本实例描述被呈现为一系列编号的段落的用通用报告物执行的多重tt数字分析的选定实施方式。tt
1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占tttttt位下包含第一靶和第二靶的分块；(B)扩增分块中的靶；(C)从包括结合tt到代表这两个靶的扩增子的通用报告物的一个或多个报告物收集关于在tt分块中的第一靶和第二靶的扩增的数据；以及(D)基于数据确定第一靶tt和第二靶的浓度。tt
2.段落1的方法，其中多个分块每个包含这两个靶的拷贝。tt
3.段落1或2的方法，其中从选择性地排除对第二靶为阳性的分块tt的数据的仅仅子集确定第一靶的浓度。tt
4.段落1到3中的任一项的方法，其中至少一个相同引物用于这两tt个靶的扩增。tt
5.段落4的方法，其中每个靶的扩增使用同一对引物被执行。tt
6.段落1到3中的任一项的方法，其中每个靶的扩增使用一对引物tt被执行，其中只有一个引物结合到另一靶或这两个引物都不结合到另一tt靶。tt
7.段落1到6中的任一项的方法，其中通用报告物包括结合到双链tt核酸的染料。tt
8.段落7的方法，其中染料的多个拷贝与双链核酸的长度直接有关tt地结合到双链核酸。tt
9.段落7或8的方法，其中染料是嵌入染料。tt
10.段落7到9中的任一项的方法，其中当结合到双链核酸时染料变tt得更发光。tt
11.段落1到10中的任一项的方法，其中分块是液滴。tt
12.段落1到11中的任一项的方法，其中一个或多个报告物包括结tt合到第二靶而不是第一靶的探针。tt
13.段落12的方法，其中数据包括通过检测由探针发射的光创建的tt信号。tt
14.段落1到13中的任一项的方法，其中从数据的仅仅第一子集确tt定第一靶的浓度，以及其中从数据的仅仅不同的第二子集或使用所有数据tttttt确定第二靶的浓度。tt
15.段落1到14中的任一项的方法，其中一个或多个报告物包括第tt三靶的探针，以及其中数据包括用于在分块中的第三靶的扩增的数据。tt
16.段落15的方法，其中收集数据的步骤包括在同一光学通道中检tt测从通用报告物和从探针发射的光的步骤。tt
17.段落1的方法，其中所有数据代表由通用报告物发射的光。tt
18.段落1的方法，其中第一靶的扩增只被检测为由通用报告物发射tt的光。tt
19.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占tt位下包含第一靶和第二靶的分块，每个分块包含结合到代表这两个靶的扩tt增子的通用报告物，多个分块每个包含这两个靶的拷贝；(B)扩增分块中tt的靶；(C)从通用报告物收集关于在分块中的第一靶和第二靶的扩增的数tt据；以及(D)从选择性地排除对第二靶为阳性的分块的数据的仅仅子集tt确定第一靶的浓度。tt
20.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供在不全占tt位下包含第一靶和第二靶的分块，每个分块包含结合到代表这两个靶的扩tt增子的通用报告物和特异地结合到代表第二靶的扩增子的探针，多个分块tt每个包含这两个靶的拷贝；(B)扩增分块中的靶；(C)至少部分地通过检tt测由通用报告物和探针发射的光，收集关于在分块中的第一靶和第二靶的tt扩增的数据；以及(D)从选择性地排除对第二靶为阳性的分块的数据的tt仅仅子集确定第一靶的浓度。tt
21.段落20的方法，其中收集数据的步骤包括收集数据分块中的第tt三靶的扩增的数据，该方法还包括确定第二靶和第三靶的浓度。tt
22.段落21的方法，其中数据的子集也选择性地排除对第三靶为阳tt性的分块。tt
23.段落21或22的方法，其中数据的子集包括对第三靶为阳性的分tt块。tt
24.段落21到23中的任一项的方法，其中每个分块包括特异地结合tt到代表第三靶的扩增子的探针。tt
25.段落24的方法，其中特异地结合到代表第三靶的扩增子的探针tt不结合到代表第一靶的扩增子且不结合到代表第二靶的扩增子。tt
26.段落21到25中的任一项的方法，其中收集数据的步骤在代表光tt的不同波段的第一和第二光通道中被执行，其中第三靶的扩增在第一光通tt道中可检测到，以及其中第二靶的扩增在第二通道中可检测到。tt
27.段落20到26中的任一项的方法，其中探针包括发光团，其中收tt集数据的步骤在代表发射光的不同波段的第一和第二光通道中被执行，其tt中由通用报告物发射的光至少实质上排他地在第一光通道中被检测到，以tt及其中由发光团发射的光至少实质上排他地在第二光通道中被检测到。tt
28.段落20到27中的任一项的方法，其中通用报告物包括嵌入染料。tt
29.段落20到26或28中的任一项的方法，其中探针包括发光团，tt以及其中收集数据的步骤包括检测在同一波段中由通用报告物和探针发tt射的光。tt
实例7.选定实施方式IVtt
本实例描述被呈现为一系列编号的段落的各自用特异性报告物和通tt用报告物执行的多重数字分析的选定实施方式。tt
1.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供分块，每tt个分块包括同一混合物的一部分，混合物包含第一靶和第二靶且也包含对tt任一靶的扩增敏感的通用报告物和对第二靶的扩增特异地敏感的特异性tt报告物，其中只有分块的第一子集每个包含第一靶的至少一个拷贝，且分tt块的仅仅不同的第二子集每个包含第二靶的至少一个拷贝；(B)扩增在分tt块中的第一靶和第二靶；(C)从存在于多个分块中的通用报告物和特异性tt报告物收集扩增数据；以及(D)基于扩增数据计算每个靶的水平。tt
2.一种执行多重数字分析的方法，该方法包括：(A)提供分块，每tt个分块包括同一混合物的一部分，混合物包含第一靶和第二靶且也包含通tt用报告物和特异性报告物，其中只有分块的子集每个包含第一靶的至少一tttttt个拷贝，其分块的仅仅另一子集每个包含第二靶的至少一个拷贝；(B)扩tt增在分块中的靶以产生相应于第一靶的第一扩增子和相应于第二靶的第tt二扩增子，其中通用报告物结合到第一扩增子和第二扩增子，以及其中特tt异性报告物结合到第二扩增子而不是第一扩增子；(C)通过检测由通用报tt告物和特异性报告物的至少一个发光团发射的光从多个分块收集扩增数tt据；以及(D)基于扩增数据计算每个靶的水平。tt
3.段落1或2的方法，其中分块的不同的第三子集的每个分块包含tt这两个靶的至少一个拷贝。tt
4.段落3的方法，其中在扩增数据中，第三子集的分块不与第一子tt集或第二子集的分块可靠地区分开。tt
5.段落3或4的方法，其第三子集的分块有助于为至少一个靶计算tt的水平。tt
6.段落3到5中的任一项的方法，其中至少一个靶的水平的计算只tt使用选择性地排除第三子集的分块的扩增数据的一部分被执行。tt
7.段落1到6中的任一项的方法，其中在大约相同的温度下从多个tt分块收集所有数据。tt
8.段落1到7中的任一项的方法，其中水平是浓度。tt
9.段落1到8中的任一项的方法，还包括基于每个靶的水平确定靶tt之一的拷贝数变化的步骤。tt
10.段落9的方法，其中所提供的分块包含来自基因组的核酸，其中tt第一和第二靶中的一个是具有在基因组中的已知拷贝数的参考靶，以及第tt一和第二靶中的另一个是具有在基因组中的未知拷贝数的感兴趣靶。tt
11.段落1到10中的任一项的方法，其中混合物包括用于每个靶的tt扩增的引物。tt
12.段落1到11中的任一项的方法，其中混合物包含一组完整的试tt剂以支持每个靶的扩增。tt
13.段落1到12中的任一项的方法，其中特异性报告物具有完整的tttttt形式和一个或多个降解的形式，其中一个或多个降解的形式在第二靶的扩tt增期间从完整的形式产生，以及其中收集扩增数据的步骤包括从特异性报tt告物的一个或多个降解的形式收集数据。tt
14.段落1到13中的任一项的方法，其中收集扩增数据的步骤在至tt少第一光通道和第二光通道中被执行，以及其中第一光通道检测与在第二tt光通道中检测的光在光谱上不同的光。tt
15.段落14的方法，其中由通用报告物发射的光相对于第二光通道tt至少占优势地只在第一光通道中被检测到，以及其中由特异性报告物的至tt少一个发光团发射的光相对于第一光通道至少占优势地只在第二光通道tt中被检测到。tt
16.段落14的方法，其中由通用报告物发射的光在第一光通道和第tt二光通道中的每个中被检测到，以及其中由特异性报告物的至少一个发光tt团发射的光相对于第一光通道至少占优势地只在第二光通道中被检测到。tt
17.段落1到16中的任一项的方法，其中第二扩增子包括一对互补tt链，以及其中特异性报告物结合到互补链中的仅仅一个的区。tt
18.段落1到17中的任一项的方法，其中靶中的一个的水平从选择tt性地排除测试为对靶中的另一个为阳性的分块的扩增数据的仅仅子集计tt算。tt
19.段落1到18中的任一项的方法，其中分块是液滴。tt
20.段落1到19中的任一项的方法，其中通用报告物包括嵌入染料。tt
21.段落1到20中的任一项的方法，其中在扩增的端点对每个靶被tt到达之后收集扩增数据。tt
22.段落1到21中的任一项的方法，其中计算水平的步骤包括标绘tt扩增数据以产生具有第一轴和第二轴的散布图的步骤，其中每个轴代表在tt不同的光通道中检测的光的强度的范围，以及其中散布图包括数据点的至tt少两个簇，每个簇代表对至少一个靶为阳性的分块。tt
23.段落22的方法，其中计算每个靶的水平的步骤包括使用排除至tttttt少一个簇的数据的仅仅子集来计算至少一个靶的水平的步骤。tt
24.段落1到23中的任一项的方法，其中第一靶和第二靶在大部分tt分块中不共价地链接到彼此。tt
25.段落24的方法，其中第一靶和第二靶在分块中不共价地链接到tt彼此。tt
26.段落1到25中的任一项的方法，其中在低于每个扩增子的熔化tt温度的温度下从分块收集所有数据。tt
27.段落1到26中的任一项的方法，其中数据从多个分块被收集，tt同时在多个分块的至少子集中的第一扩增子的拷贝和第二扩增子的拷贝tt保持在至少部分双链形式中。tt
28.段落1到27中的任一项的方法，其中使用在双链形式中的第一tt扩增子的至少一部分和第二扩增子的至少一部分来收集所有数据。tt
29.段落1到28中的任一项的方法，其中在低于大约50摄氏度的温tt度下从分块收集所有数据。tt
30.段落1到29中的任一项的方法，其中特异性报告物包括特异地tt结合到第二扩增子的核酸。tt
31.段落1到30中的任一项的方法，还包括基于扩增数据对于至少tt一个靶将单独的分块分类为阳性或将单独的分块分类为阴性的步骤。tt
32.段落31的方法，还包括确定对于靶中的一个靶被分类为阳性或tt被分类为阴性的分块的数量的步骤，以及其中计算一个靶的水平的步骤基tt于被分类为阳性或被分类为阴性的分块的数量。tt
33.一种用于执行多重数字分析的成分，包括：(A)布置在同一连续tt相中的多个液滴，液滴每个包括同一混合物的一部分，其中混合物包含第tt一靶、第二靶、对任一靶的扩增敏感的通用报告物和对第二靶的扩增特异tt地敏感的特异性报告物，其中多个液滴的仅仅第一子集每个包含第一靶的tt至少一个拷贝，以及多个液滴的仅仅不同的第二子集每个包含第二靶的至tt少一个拷贝，以及其中混合物包括用于每个靶的扩增的完整的一组试剂。tt
34.段落33的成分，其中连续相包括油。tt
35.段落34的成分，其中油包括氟油、硅油和这两者。tt
36.段落33的成分，其中连续相在室温下是液体。tt
37.段落36的成分，其中连续相在90摄氏度下是液体。tt
38.段落33的成分，其中液滴的第三子集每个包含每个靶的至少一tt个拷贝。tt
39.段落33的成分，其中完整的这组试剂包括dNTP、用于扩增每个tt靶的引物和热稳定多聚酶。tt
上面阐述的本公开可包括具有独立效用的多个不同的发明。虽然这些tt发明中的每个在其优选形式中被公开，如在本文公开和示出的其特定实施tt方式不应在限制性的意义上被考虑，因为很多变化是可能的。发明的主题tt包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或特性的所有新颖和非显而易见tt的组合和子组合。下面的权利要求特别指出被视为新颖和非显而易见的某tt些组合和子组合。体现在特征、功能、元件和/或特性的其它组合和子组合tt中的发明可在从这个或相关申请要求优先权的申请中被主张。这样的权利tt要求不管目的是否在于不同的发明或同一发明以及在范围上是否比原始tt权利要求更宽、更窄、相等或不同也都被视为包括在本公开的发明的主题tt内。此外，所识别的元件的序数指示符例如第一、第二或第三用于区分开tt元件且并不指示这样的元件的特定位置或顺序，除非另外特别规定。tt
