一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序的方法及试剂盒
技术领域tt
本发明涉及一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法、建库tt试剂盒、检测方法和检测试剂盒，属于基因测序领域。tt
背景技术tt
DNA甲基化是最早发现的基因表观遗传学修饰方式之一，真核生物中的甲tt基化主要发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpGtt二核苷酸5'-端的胞嘧啶(C)转变为5'-甲基胞嘧啶(5mC)。甲基化的主要功能tt是调控基因表达。在哺乳动物体内，DNA甲基化在分化细胞中相对稳定；相比tt之下，在早期胚胎发育和原始生殖细胞发育过程中会发生基因组范围的去甲基化tt和DNA甲基化谱式重新建立(Remethylation)的过程。tt
全基因组亚硫酸盐测序可以全面地分析DNA甲基化情况，但由于它是对整tt个基因组进行深度测序，需要较大的测序数据量。而简化代表性重亚硫酸氢盐测tt序(RRBS)技术提供了一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法。这种tt方法首先采用特异性限制性核酸内切酶(通常是MspI酶)来消化基因组DNA，tt然后通过片段选择进行启动子及CpG岛区域的特异性富集，随后进行重亚硫酸tt氢盐处理并测序。RRBS通过测较少的数据量，就可以有效的覆盖基因组大部分ttCpG位点，包括>70％的启动子，>80％的CpG岛和增强子、外显子、3′UTRs和tt重复元件等。tt
传统的RRBS技术包括如下步骤：(1)使用MspI酶对基因组DNA进行酶tt切；(2)对酶切产物进行过膜纯化；(3)对纯化产物依次进行末端补平、加Att和甲基化接头反应；(4)对加接头产物进行片段筛选；(5)对筛选后的产物进行tt重亚硫酸氢盐处理，使未甲基化的C转变为U；(6)PCR反应，扩增得到测序tt文库。tt
传统的RRBS方法对基因组DNA起始量的要求较高，约3～5μg，不适合微tt量样本或者单细胞样本。单细胞本身所含有的基因组比传统样本低好多个数量级，tt任何降解、样品损失或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响，导致传统的ttttttRRBS方法无法应用于单细胞或微量样本，比如对于临床上比较珍贵又稀少的样tt本或者单个细胞样本。tt
为了实现对单细胞的甲基化测序，Sebastien等提出了单细胞全基因组重亚硫tt酸盐测序技术，流程包括：(1)采集单细胞；(2)将采集的单细胞进行裂解，得tt到裂解后的单细胞样本；(3)将所述裂解后的单细胞样本进行重亚硫酸氢盐处理，tt得到单链重亚硫酸氢盐处理产物；(4)以上述单链的重亚硫酸氢盐处理产物为模tt板，使用含生物素标记的oligo1引物合成第一条链；(5)使用链亲和素磁珠调取tt生物素标记的第一条链；(6)以上述生物素标记的第一条链为模板，使用oligo2tt引物合成第二条链；以及(7)以所述第二条链作为模板进行PCR扩增，从而构tt建二代测序用DNA文库。但是，该方法得到的实验分析结果对CpG岛的覆盖率tt偏低。tt
参考文献tt
SebastienSmallwood,HeatherJLee,etal.2014.Single-cellgenome-widebisulfitettsequencingforassessingepigeneticheterogeneity.Naturemethods,8,11(8):817‐820tt
发明内容tt
为了克服现有技术的不足，本发明改进了传统的RRBS技术，将PCR前的ttRRBS文库构建步骤整合到单个反应管中完成，获得了合格的测序用RRBS文库，tt来绘制单碱基分辨率的小鼠或人类CpG位点的甲基化图谱，能够更好的从单细胞tt水平上研究细胞之间的异质性。tt
本发明包括：tt
1.一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序文库的构建方法，包括如下步tt骤：tt
A.将单个细胞进行裂解，得到单细胞基因组DNA；tt
B.将所述单细胞基因组DNA进行MspI酶切，得到酶切产物；tt
C.将所述酶切产物进行末端修复和3'端加A，得到3'端加A产物；tt
D.将所述3'端加A产物进行甲基化接头连接，得到加甲基化接头产物；tt
E.将所述加甲基化接头产物进行重亚硫酸氢盐处理，得到转化产物；tt
F.将所述转化产物进行PCR扩增，得到测序文库，tt
其中，tt
所述步骤A～E在单个反应管中完成。tt
2.根据项1所述的方法，在步骤E后包括步骤E1：在所述转化产物中加入tttRNA进行纯化。tt
3.根据项1或2任一项所述的方法，所述单细胞来源于哺乳动物。tt
4.根据项3所述的方法，所述哺乳动物为人和/或小鼠。tt
5.根据项1～4任一项所述的方法，所述步骤A采用的裂解体系包括：裂解tt缓冲液和蛋白酶。tt
6.根据项1～4任一项所述的方法，所述步骤B采用的酶为MspI限制性内tt切酶。tt
7.根据项1～4任一项所述的方法，所述步骤D采用的甲基化接头连接体系tt包括：T4DNA连接酶、甲基化接头、连接酶缓冲液。tt
8.一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序用文库的构建试剂盒，包括选tt自下述试剂中的至少一种或全部：tt
用于对单细胞进行裂解的试剂，用于对单细胞基因组DNA进行MspI酶切tt处理的试剂，用于所述3'端加A的试剂，用于将所述3'端加A的DNA片段加甲tt基化接头的试剂，用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理tt的试剂，用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂。tt
9.一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐测序方法，包括如下步骤：tt
A.将单个细胞进行裂解，得到基因组DNA；tt
B.将所述基因组DNA进行MspI酶切，得到酶切产物；tt
C.将所述酶切产物进行末端修复和3'端加A，得到3'端加A产物；tt
D.将所述3'端加A产物进行甲基化接头连接，得到加甲基化接头产物；tt
E.将所述加甲基化接头产物进行重亚硫酸氢盐处理，得到转化产物；tt
F.将所述转化产物进行PCR扩增，得到测序用文库；tt
G.对所述测序用文库进行二代测序，基于测序结果，对所述单细胞的甲基tt化情况进行分析。tt
10.一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐的测序试剂盒，包括选自下述试tt剂中的至少一种或全部：tt
用于对单细胞进行裂解的试剂，用于对单细胞基因组DNA进行MspI酶切tt处理的试剂，用于所述3'端加A的试剂，用于将所述3'端加A的DNA片段加甲tt基化接头的试剂，用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理tt的试剂，用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂。tt
与现有技术相比，本发明的有益效果是：适用于起始量低样本的建库，特别tt是单细胞样本，能够以单碱基分辨率绘制小鼠或人类细胞内约100万CpG位点tt的甲基化图谱。相较于单细胞重亚硫酸氢盐测序(scBS)技术，scRRBS能够更tt好地覆盖CpG岛。tt
附图说明tt
图1是用安捷伦2100生物分析仪对单个卵母细胞的scRRBS文库进行文库tt质控的结果；tt
图2是用安捷伦2100生物分析仪对阴性对照样本的scRRBS文库进行文库tt质控的结果。tt
具体实施方式tt
在一个方面，本发明提供了一种构建测序用单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐tt文库的方法，包括如下步骤：tt
A.将单个细胞进行裂解，得到单细胞基因组DNA；tt
B.将所述单细胞基因组DNA进行MspI酶切，得到酶切产物；tt
C.将所述酶切产物进行末端修复和3'端加A，得到3'端加A产物；tt
D.将所述3'端加A产物进行甲基化接头连接，得到加甲基化接头产物；tt
E.将所述加甲基化接头产物进行重亚硫酸氢盐处理，得到转化产物；tt
F.将所述转化产物进行PCR扩增，得到测序用文库，tt
其中，所述步骤A～E在单个反应管中完成。tt
本发明创造性地将构建单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐文库的程序在一个tttttt反应管中完成，极大地降低了分步纯化和片段筛选导致的降解和污染等对样品造tt成的损失。tt
对于所述步骤E中采用的重亚硫酸氢盐处理的体系及反应条件没有特殊限tt制，本领域技术人员可以适宜选择能够在重亚硫酸氢盐处理过程中使用的那些成tt份体系及反应条件。tt
作为优选，本发明在步骤E后进行步骤E1：将所述转化产物中加入tRNAtt进行纯化。在纯化步骤中加入tRNA，极大地提高了纯化效率，使得纯化步骤得tt以在一步完成，降低了现有技术中采用分步纯化对单细胞样本造成的损失。tt
作为优选，本发明所述单细胞来源于哺乳动物、植物和/微生物中的至少一tt种。更优选地，所述哺乳动物为人和/或小鼠。tt
作为优选，所述步骤A采用的裂解体系包括：裂解缓冲液和蛋白酶。tt
作为优选，所述步骤B采用的酶为MspI限制性内切酶。tt
作为优选，所述步骤D采用的甲基化接头连接体系包括：T4DNA连接酶、tt甲基化接头、连接酶缓冲液。tt
在另一个方面，本发明提供了一种构建测序用单细胞简化代表性重亚硫酸tt氢盐文库的试剂盒，包括选自下述试剂中的至少一种或全部：tt
用于对单细胞进行裂解的试剂，用于对单细胞基因组DNA进行MspI酶切tt处理的试剂，用于所述3'端加A的试剂，用于将所述3'端加A的DNA片段加甲tt基化接头的试剂，用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理tt的试剂，用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂。tt
用于对单细胞进行裂解的试剂，例如蛋白酶及相应的反应缓冲液等；tt
用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂，例如MspItt酶及相应的酶切反应缓冲液等；tt
用于所述3'端加A的试剂，例如缺失外切酶活性的Klenow片段及相应的tt反应缓冲液等，可以与所述的用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂相同；tt
用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂，例如甲基化接头、ttT4DNA连接酶及相应的连接反应缓冲液；tt
用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐(Bisulfite)处理tt的试剂，例如EZMethylation(Zymo公司产品)等；tt
用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂，例如KAPAHiFittHotStartUracil+ReadyMix、Index引物等；tt
通过对所得测序用DNA文库进行二代测序，并基于测序结果进行分析，可tt以获得所述基因组DNA的甲基化的信息。tt
本发明还提供了一种单细胞的简化代表性重亚硫酸氢盐测序方法，其在包括tt上述本发明的建库方法的各步骤的基础上，还包括步骤G：对所述测序用文库进tt行二代测序，基于测序结果，对所述单细胞的甲基化情况进行分析。优选地，所tt述二代测序采用Illumina测序平台进行。tt
在另一个方面，本发明还提供了一种单细胞简化代表性重亚硫酸氢盐的测tt序试剂盒，包括选自下述试剂中的至少一种或全部：tt
用于对单细胞进行裂解的试剂，用于对单细胞基因组DNA进行MspI限制tt性内切酶处理的试剂，用于所述3'端加A的试剂，用于将所述3'端加A的DNAtt片段加甲基化接头的试剂，用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸tt氢盐处理的试剂，用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂。tt
本发明的试剂盒中所包含的试剂、装置等可以与用于传统的RRBS建库方tt法的试剂盒中包含的那些相同。tt
实施例tt
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所tt描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。tt
实施例1采用小鼠卵母细胞为材料构建scRRBS(单细胞简化代表性重亚tt硫酸氢盐)测序文库tt
(1)裂解细胞tt
分离单个小鼠卵母细胞，并将其置于1.5mL采样管中，体积约为1μL；阴性tt对照管内加入1μLddH2O。无需转管，直接将5μLLysisBuffer、1μLProtease、1μLttλDNA共7μL加入细胞中，总体积8μL，封口膜缠绕封口。50℃水浴中浸没整个tt小管，反应3小时，70℃15分钟以失活Protease。得到含有小鼠卵母细胞基因组ttDNA的混合溶液。tt
(2)MspI酶切tt
按如下体系酶切小鼠卵母细胞基因组DNA，其中(1)步预处理得到的混合tttttt物(小鼠卵母细胞gDNA)体积为8μL(已含λDNA)，tt
37℃水浴中浸没整个小管，反应3小时。tt
(3)末端补平及加“A”反应tt
反应体系如下：tt
37℃水浴中浸没整个小管，反应50-60分钟。tt
(4)甲基化接头(Meth-Adapter)连接反应：tt
反应体系如下：tt
16℃连接过夜。tt
(5)重亚硫酸氢盐(Bisulfite)处理tt
按照ZymoEZmethylation试剂盒进行操作。tt
过柱纯化，向各样本反应液中先行加入10ngtRNA混匀，再将反应液上柱纯tt化回收继续后续反应。tt
(6)PCR反应tt
使用KAPAHiFiUracil+ReadyMix进行扩增。仅进行1轮PCR，50μL反应体tt系如下:tt
反应条件如下：98℃2分钟；(98℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟)47个循tt环；72℃5分钟；4℃保存。tt
(7)磁珠纯化及安捷伦2100生物分析仪质控检测tt
所有PCR产物均使用1.8倍AmpureXP磁珠进行纯化，然后各取1.5μL进行tt2100质控检测。tt
对单个卵母细胞scRRBS文库进行2100检测的结果如图1所示，从结果上可以tt看出，文库片段范围为100～300bp，符合预期结果；tt
对阴性对照样本scRRBS文库进行2100检测的结果如图2所示，从结果上可以tt看到，条带分布范围很广，没有明显的主带，说明没有明显的文库产物，表示阴tt性对照成立。tt
(8)上机测序tt
质控合格后的文库进行上机测序，上机策略：SE50；测序数据量30Mreads。tt
(9)测序结果信息分析tt
(9-1)样本比对结果，如表1所示：tt
表1tt
CleanReads：过滤后的Reads数；tt
MappedReads：比对到基因组上的Reads数；tt
MappedRatio(％)：比对到基因组上的Reads数占CleanReads的百分比；tt
UniqueMappedReads：唯一比对到基因组上的Reads数；tt
UniqueMappedRatio(％)：唯一比对到基因组上的Reads数占CleanReads的百分比；tt
Duplication(％)：去除PCR过程中产生的重复序列的比例。tt
ErrorRate(％)：噬菌体λDNA基因组上被测成C的次数/C位点总测序次数(在得到全tt
基因组所有碱基比对信息后计算得到的)，其中转化率＝100(％)-ErrorRate(％)。tt
从表1来看，小鼠卵母细胞比对率达到了51.2％，阴性对照的比对率只有tt0.16％；从CT转化率来看，我们构建的文库转化率大于98％，这些结果表明实tt施例1的scRRBS的建库方法成功。tt
(9-2)甲基化位点统计分析tt
能够检出多少甲基化位点是衡量scRRBS建库方法是否成功的指标之一，其tt中启动子区和CpG岛的甲基化位点更具有代表性。我们对启动子区及CpG岛的覆tt盖度进行分析，将识别的位点注释到启动子区和CpG岛区域上，并对覆盖情况进tt行统计，如表2所示：tt
表2tt
CpGs(1×)：覆盖深度大于等于1×的CpGs的个数；tt
MeanCoverage(1×)：盖深度大于等于1×的CpGs的平均覆盖深度；tt
CpGs(5×)：覆盖深度大于等于5×的CpGs的个数；tt
MeanCoverage(5×)：覆盖深度大于等于5×的CpGs的平均覆盖深度；tt
CpGs(10×)：覆盖深度大于等于10×的CpGs的个数；tt
MeanCoverage(10×)：覆盖深度大于等于10×的CpGs的平均覆盖深度。tt
对比例1采用小鼠卵母细胞为材料构建scBS(单细胞重亚硫酸氢盐)测序文tt库tt
对比例1采用“Sebastien等提出的单细胞全基因组重亚硫酸盐测序技术”构建tt小鼠卵母细胞scBS文库。tt
文库构建完成后，使用安捷伦2100生物分析仪对文库进行检测，检测合格后，tt质控合格后的文库进行上机测序，上机策略：SE50；测序数据量30Mreads。tt
样本比对结果及甲基化位点统计分析结果，如表3所示。tt
表3tt
对比表2和表3可以看到，通过采用实施例1提供的构建测序用单细胞简化代tt表性重亚硫酸氢盐文库的方法构建得到scRRBS文库对CPG岛的覆盖度明显优于tt对比例1采用方法得到的scBS文库，尤其是在覆盖深度大于等于5×和覆盖深度大tt于等于10×的情况下。tt
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并tt非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其tt他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关tt领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的tt精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。tt
